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中药配方颗粒是以符合标准的单味中药饮片为原料,经现代工艺提取、浓缩、制粒而成的一种新型中药制剂[1]。1992年,国家批准了试点生产企业进行中药配方颗粒研发,2001年,将其规范命名为“中药配方颗粒”,同时纳入中药饮片管理范畴。2021年国家先后公布了两批次196种配方颗粒的国家标准[2-3],标志着中药配方颗粒正式步入历史舞台。地龙配方颗粒目前仍属于企业在研品种,由于药材来源、制备工艺和质量标准不同,其产品质量亦存在差异,加之2020年版《中国药典》中地龙项下缺少指标成分和定量评价方法[4],使其仍缺少统一的评价指标。
核苷类成分是地龙舒张支气管、抗组胺、平喘的物质基础[5],通过对核苷类成分的评测,可在一定程度上反映地龙药材和配方颗粒的内在质量。有研究表明,利用高效液相色谱法(HPLC)建立的特征图谱,能较好地表征地龙药材中核苷类成分[6-7],同时可对其进行含量测定[8-12],也有用该方法测定地龙配方颗粒中次黄嘌呤的含量并对其进行质量评价的研究报道[13-14]。本研究采用高效液相色谱法测定不同厂家地龙配方颗粒中次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷4种核苷类成分的含量,并应用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》建立指纹图谱进行质量评价。
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Thermo AcclaimTM120 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相乙腈(A)-水(B),梯度洗脱,洗脱条件见表1;流速0.6 ml/min;柱温25 ℃;检测波长254 nm;进样量10 μl。理论塔板数按肌苷峰计算不小于3500。
时间 (min) 流动相比例(%) 流动相A 流动相B 0~15 2 98 15~25 2~3 98~97 25~30 3~8 97~92 30~40 8~20 92~80 40~50 20 80 50~55 20~50 80~50 55~60 50~100 50~0 60~63 100 0 63~68 100~2 0~98 -
取地龙对照药材约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入双蒸水50 ml,称定重量。于60 ℃水浴30 min,再超声(功率300 W,频率40 kHz)30 min,放至室温,称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,取上清液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
分别称取对照品适量,制成含尿嘧啶0.504 mg/ml,次黄嘌呤0.326 mg/ml,黄嘌呤0.345 mg/ml,尿苷0.420 mg/ml,肌苷0.420 mg/ml,鸟苷0.338 mg/ml,腺苷0.350 mg/ml的储备液,置4 ℃储存备用。取上述对照品储备液适量,制成含尿嘧啶20.16 μg/ml,次黄嘌呤60.52 μg/ml,黄嘌呤17.25 μg/ml,尿苷21.00 μg/ml,肌苷138.2 μg/ml,鸟苷33.82 μg/ml和腺苷35.02 μg/ml的混合对照溶液。
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取地龙配方颗粒适量,研细,取0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入双蒸水50 ml,称定重量,超声处理(功率300 W,频率40 kHz)30 min,放至室温,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,取上清液,经0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。
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取混合对照溶液和样品S1,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进样检测,记录色谱图。根据对照品的保留时间,指认了地龙配方颗粒HPLC图谱中7个主要色谱峰(图1),分别为尿嘧啶(峰1)、次黄嘌呤(峰2)、黄嘌呤(峰3)、尿苷(峰4)、肌苷(峰5)、鸟苷(峰6)和腺苷(峰7)。
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取样品S1,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定6次,以肌苷峰为参照峰,计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积,二者RSD分别小于0.12%和2.46%,表明仪器精密度良好。
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取样品S1,按“2.2.2”项制备供试品溶液,分别于0、4、8、12、16、24 h时按“2.1”项下色谱条件测定,以肌苷峰为参照峰,各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于0.16%和2.73%,表明该溶液在24 h内稳定性良好。
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取6份样品S1,按“2.2.2”项制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,以肌苷峰为参照峰,各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别小于0.14%和2.52%,表明该方法重复性良好。
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取样品(S1~S10)和对照药材,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,将所得的HPLC图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》软件,以样品S1色谱图为参照图谱,时间窗宽度为0.1,经多点校正后,进行全谱峰匹配,采用中位数法生成对照指纹图谱R(图2)。
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使用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版)》软件对各厂家的地龙配方颗粒和对照药材的HPLC图谱与对照特征图谱进行相似度计算。结果10批次地龙配方颗粒(S1~S10)和对照药材的HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度分别为:0.943、0.953、0.961、0.982、0.912、0.970、0.989、0.974、0.972、0.978、0.945,均大于0.912,表明不同厂家生产的地龙配方颗粒之间,及其与地龙对照药材所含成分种类较为相似,但成分含量上具有一定的差异。
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分别取混合对照溶液0.1、0.25、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 ml置于10 ml容量瓶中,定容。取上述溶液和混合对照溶液适量,0.45 μm滤膜滤过,按“2.1”项下色谱条件检测(n=2),以样品浓度(X)为横坐标,峰面积(Y)为纵坐标,计算得回归方程和相关系数,结果见表2。结果各回归方程的相关系数r≥0.999 9,表明4种成分在各自浓度范围内线性关系良好。
组分 回归方程 相关系数 线性范围(μg/ml) 次黄嘌呤 Y=1.168 2X−0.004 5 0.999 9 0.605 2~60.520 0 肌苷 Y=0.605 0X+0.071 9 0.999 9 1.382 4~138.240 0 鸟苷 Y=0.705 3X+0.031 7 0.999 9 0.338 2~33.820 0 腺苷 Y=0.808 0X+0.029 1 0.999 9 0.350 2~35.020 0 -
取混合对照溶液,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷峰面积的RSD分别为0.19%、0.07%、0.26%、0.13%,表明仪器精密度良好。
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取S1样品6份,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件检测,记录峰面积并计算含量。次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷含量的RSD分别为1.94%、0.83%、0.94%、1.51%,表明该方法重复性良好。
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取S1样品按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件分别于配制0、4、8、12、16、24 h时检测,记录峰面积。次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷峰面积的RSD分别为0.37%、0.41%、0.47%、1.31%,表明供试品溶液在24 h之内稳定性良好。
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精密称取S1样品0.25 g,共9份,分别精密加入相当于已知含量的50%、100%和150%的次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷对照品溶液,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件测定,计算平均加样回收率。结果,次黄嘌呤平均回收率为97.95%,RSD为0.47%;肌苷平均回收率为102.98%,RSD为0.71%;鸟苷平均回收率为99.20%,RSD为0.26%;腺苷平均回收率为103.45%,RSD为0.59%。表明该方法准确度良好。
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按上述供试品溶液的制备方法和测定条件,测定10批次地龙配方颗粒和对照药材中次黄嘌呤、肌苷、鸟苷和腺苷的含量,结果见表3。
样品 含量(mg/g) 总含量(mg/g) 次黄嘌呤 肌苷 鸟苷 腺苷 S1 4.457 4 7.805 0 1.596 1 0.689 2 14.547 7 S2 0.740 0 4.770 9 0.999 3 0.596 0 7.106 2 S3 1.037 5 2.323 6 0.386 8 0.814 2 4.562 1 S4 1.322 1 6.257 1 0.605 1 1.145 1 9.329 4 S5 1.070 8 4.487 3 0.993 1 2.222 9 8.774 1 S6 1.063 5 3.836 9 0.452 8 1.431 2 6.784 4 S7 1.444 6 5.775 1 0.839 6 1.077 7 9.137 0 S8 1.038 5 3.095 7 0.606 9 0.161 3 4.902 3 S9 3.672 3 6.932 4 1.332 5 0.477 3 12.414 5 S10 1.200 1 2.132 3 0.325 4 0.537 2 4.195 0 对照品 0.2526 1.8422 0.2962 0.0308 2.4218
Determination of multi-index components and quality evaluation of Dilong Formula Granules
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209086
- Received Date: 2022-09-30
- Rev Recd Date: 2023-02-27
- Available Online: 2023-09-25
- Publish Date: 2023-09-25
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Key words:
- Dilong formula granule /
- fingerprints /
- hypoxanthine /
- inosine /
- guanosine /
- adenosine /
- quality evaluation
Abstract:
Citation: | LI Lei, ZHANG Chengzhong, ZHANG Hanming, BU Qitao, ZHANG Lei. Determination of multi-index components and quality evaluation of Dilong Formula Granules[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(9): 547-551. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202209086 |