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损伤部位的机械刺激和局部感染可导致皮肤伤口的异常愈合,甚至导致瘢痕疙瘩的形成[1]。细胞的迁移、生长和增殖在伤口修复过程中起着至关重要的作用, 增生性瘢痕的形成与各类因子表达异常、成纤维细胞的增殖过度、以及胶原的过度沉积等因素密切相关[2-3]。电生理学实验研究表明,生物组织的行为与电荷的流动高度相关[4-6]。
驻极体是一类不需外加电源即能够提供稳定静电场和微电流的功能电介质材料[7], 其产生的静电场能够加快受创部位微循环,促进成纤维细胞在不同时期生长或凋亡以及促进药物的经皮渗透等作用[8-10]。 5-氟尿嘧啶(5-FU)是最早研发上市的抗癌药,作用于细胞后抑制其 DNA的合成,从而对成纤维细胞生长增殖产生影响,临床上是治疗难治性瘢痕的常用药之一[11]。
该研究将驻极体和 5-FU 联用,通过探索驻极体静电场联合5-FU对分离培养瘢痕成纤维细胞的生长、细胞周期和凋亡的影响,以期在细胞水平研究驻极体静电场以及驻极体联用 5-FU 对瘢痕形成的影响机制,为预防和治疗病理瘢痕提供新的思路。
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通过栅控恒压电晕充电系统对双裸面聚丙烯(Polypropylene,PP) 膜进行注极,栅压设为+5000 V,充电时间为 5 min,制备得+5000 V 驻极体。驻极体等效表面电位通过表面电位计(ESR102A 型振动电容静电计)测量。
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用 10%的水合氯醛腹腔注射麻醉(4 ml/kg),用实验动物剃毛刀去除大鼠背部毛发, 在大鼠背部用打孔器制造左右对称共 4 个直径为 2 cm 的创面,创面之间间隔一定距离,去除肉膜层,分笼饲养。在创面形成后 4 周产生增生性瘢痕。
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取瘢痕模型大鼠,10%的水合氯醛腹腔注射麻醉, 用实验动物剃毛刀将大鼠背部毛发去除干净, 酒精棉球擦拭后, 手术剪取下瘢痕皮肤组织,组织用含有青霉素浓度 100 U/ml,链霉素浓度 100 μg/ml 的 PBS 缓冲液反复冲洗 3 次。冲洗后, 用眼科剪将瘢痕皮肤组织剪成组织小块, 组织小块大小在 1~2 mm3 之间。将组织小块置于培养皿中,加入含有 20%胎牛血清的 1640培养基,待细胞长满培养皿,进行细胞传代,待细胞传至 3~8 代,进行后续实验。
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实验分为瘢痕细胞对照组,+5000 V驻极体组,+5000 V驻极体+10 μg/ml 5-FU组,+5000 V驻极体+40 μg/ml 5-FU组,+5000 V驻极体+160 μg/ml 5-FU组。
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取对数生长期的瘢痕皮肤组织成纤维细胞(细胞密度为 1×104/ 孔),接种于96孔培养板中(100 μl/孔) 。待细胞绝大部分贴壁后,更换培养液,按照上述实验分组分别对细胞干预24 h、48 h、72 h,再以 10 μl/孔向各孔中加入 cck-8 试剂溶液, 继续在细胞培养箱中保温 1~4 h,终止培养,震荡摇匀,在全自动定量酶标仪上以 450 nm 波长处测定各孔吸光度, 按照增殖率=(实验孔实测值−空白组平均值)/(对照组平均值−空白组平均值)×100%计算细胞增殖率。
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取瘢痕细胞消化离心后重悬,制成单细胞悬液,按1×104个/孔种植到96孔板中,待细胞绝大部分贴壁后,更换培养基,选取+5000 V驻极体+40 μg/ml 5-FU组对其进行处理,恒温箱培养48 h后,去除培养液,各组均加入含Hoechst 33342(原浓度为10 mg/ml,稀释10000倍)的1640培养液,避光孵育30 min,然后去除培养液,用PBS清洗两次,加入适量PBS,置于荧光显微镜下观察并拍照,每组重复3个样本。荧光定量PCR引物序列表见表1。
引物名称 引物序列(5'→3') 片段长度(bp) 退火温度(℃) R-TP53-S GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC 220 60 R-TP53-A GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA 60 R-fas-S AGCGTTCGTGAAACCGACAAC 172 60 R-fas-A AGTGTTTCCTGTCCGTGTACTCC 60 R-fasl-S GCAAATAGCCAACCCCAGCAC 186 60 R-fasl-A ACGAAGTACAACCCAGCCTCA 60 R-BAX-S GGGCCTTTTTGCTACAGGGTTT 284 60 R-BAX-A AGCAAAGTAGAAAAGGGCAACCAC 60 R-GAPDH-S CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG 138 60 R-GAPDH-A GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT 60 -
瘢痕细胞在不同浓度5-FU及正极性驻极体和不同浓度5-FU联用干预 24 h、48 h、72 h后增殖率变化情况:在5-FU干预 24 h、48 h、72 h后,在不同浓度5-FU的作用下, 随着 5-FU浓度的增加,瘢痕细胞的增殖率呈下降趋势,且随着时间的增加瘢痕增值下降趋势越明显;正极性驻极体和不同浓度5-FU联用作用于细胞72 h后,细胞增殖率都有所降低。随着 5-FU 浓度的增加, 对照组和各正极性驻极体组瘢痕细胞增殖率呈下降趋势;该变化趋势较5-FU单一作用 72 h组更加明显,具体见表2。
组别 0 10 40 160 24 h组 1.00±0.028 0.99±0.028 0.77±0.027 0.49±0.033 48 h组 1.00±0.024 0.98±0.025 0.65±0.028 0.41±0.028 72 h组 1.00±0.020 0.96±0.033 0.53±0.017 0.21±0.046 +5000 V与5-FU联用72 h组 0.90±0.034 0.47±0.051 0.15±0.051 -
瘢痕细胞各组染色的结果见图1,图中箭头所示亮点为凋亡细胞,较暗的蓝色荧光为正常细胞,图1A右上角方框内为亮点部位放大结果。结果显示:瘢痕细胞对照组基本无细胞凋亡或者极少细胞凋亡; +5000 V驻极体组出现少数细胞凋亡; +5000 V 驻极体与5-FU联用组细胞凋亡数高于 5-FU 组。
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瘢痕成纤维细胞各组凋亡基因 mRNA 的相对表达量见表3。以对照组为 1,比较各实验组mRNA 的表达。结果显示:与对照组相比,5-FU组表达量明显增加, +5000 V 驻极体组4种凋亡基因 mRNA 的相对表达量都有所增加;与5-FU组相比,虽然+5000 V驻极体组相对表达量稍小,但是+5000 V驻极体+5-FU组表达量则显著增大,以上相比较的各组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。
组别 p53 fas Bas fasl 对照组 1.00±0.00 1.00±0.01 1.00±0.02 1.00±0.03 5-FU组 1.60±0.06 2.23±0.11 1.81±0.13 2.01±0.19 +5000 V 驻极体组 1.30±0.10 1.61±0.21 1.41±0.10 1.50±0.12 +5000 V+5-FU组 1.92±0.14 2.81±0.29 2.20±0.17 2.49±0.21
Synergistic effect of positive electret combined with 5-fluorouracil on growth inhibition of scar fibroblasts
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310027
- Received Date: 2023-10-16
- Accepted Date: 2024-04-11
- Rev Recd Date: 2024-03-19
- Available Online: 2024-06-24
- Publish Date: 2024-06-25
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Key words:
- electrostatic field /
- electret /
- 5-fluorouracil /
- scar fibroblasts
Abstract:
Citation: | YANG Yuanyuan, AN Xiaoqiang, XU Jiajie, JIANG Jian, LIANG Yuanyuan. Synergistic effect of positive electret combined with 5-fluorouracil on growth inhibition of scar fibroblasts[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(6): 244-247. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310027 |