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METRNL(Meteorin-like)是一个新发现的分泌蛋白,为神经营养调节因子Meteorin的同源蛋白。2014年,本实验室首次报道METRNL是一个新的脂肪因子,由于其在皮下白色脂肪组织中表达很丰富,故也称为Subfatin[1]。10年来,我们对METRNL的功能进行了多方面的探索,并不断扩展METRNL的研究工具与平台。我们的研究已发现,该蛋白参与调节机体多种病理生理过程,比如:脂肪细胞METRNL可促进白色脂肪分化、脂质代谢并抑制脂肪炎症,从而抵抗高脂饮食诱导的胰岛素抵抗[2];肠上皮细胞METRNL参与调节肠道抗菌肽的平衡[3],且肠道METRNL缺乏会加重溃疡性结肠炎[4];此外,METRNL促进小鼠皮肤创伤愈合[5],并能对抗D-半乳糖诱导的衰老小鼠的认知功能障碍[6]。最近,我们新报道了血液METRNL的主要分泌来源是血管内皮细胞,并发现内皮细胞METRNL对维持血管内皮正常功能和对抗动脉粥样硬化具有重要作用[7]。在这些研究中,我们构建METRNL基因的全身性和各种组织特异性的敲除小鼠,以及多种双基因敲除小鼠,并在体外细胞实验中充分利用METRNL重组蛋白探索相关治疗学意义。除了本实验室,全球其他多个实验室也展开了对METRNL的功能探索,并发现METRNL在能量代谢[8-9]、炎症[10-11]、心脏疾病[12-13]等多种病理生理过程中发挥积极作用。
尽管目前有很多关于METRNL的研究结果提示,该蛋白具有非常好的临床治疗潜力,但有关整体METRNL治疗学探索不多,尤其是长期治疗研究几乎没有。主要原因之一是市场METRNL重组蛋白价格昂贵,而且我们前期研究结果发现:对C57BL/6J 小鼠单次静脉注射1.75 µg METRNL重组蛋白后,血清METRNL在15 min后急剧升高(226 ng/ml),接着在4 h内迅速下降约90%。虽然在注射后24 h仍明显高于基础水平,但此时血中METRNL浓度已下降约97%[2]。因此,以重组蛋白给药方式在动物整体水平研究METRNL的治疗学作用,尤其是长期治疗学作用将产生巨大经济成本。另一方面,对于一些已经体现METRNL治疗潜力的疾病(如动脉粥样硬化),疾病发展缓慢,短期给予METRNL重组蛋白很难起到治疗作用。
因此,本研究旨在构建一株长期稳定高表达METRNL的小鼠作为METRNL的治疗学研究工具,并对该小鼠高表达METRNL的情况进行验证。
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鼠尾DNA提取试剂盒(CW2094S)购自北京康伟试剂生物科技有限公司;5 × PrimeScript RT Master Mix(Takara 公司);小鼠Tubulin抗体( AT819,碧云天公司);通用型RNA提取试剂盒Ⅱ(AG21022,艾瑞克生物科技);Human Meteorin-like/METRNL DuoSet ELISA试剂盒(DY7867-05,R&D system公司);山羊抗兔 IgG(ab175471)、山羊抗小鼠 IgG(ab216772)、抗METRNL抗体(ab235775)购自Abcam公司。
LightCycler96实时荧光定量PCR仪(Roche公司);TP600PCR仪(Takara公司);5200S化学发光分析系统(Tanon公司)。
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人METRNL基因条件性过表达(R26-LSL-METRNL+/-)小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄 C57BL/6J 小鼠和Dppa-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒(IVC)系统中,温度(24±2)℃,相对湿度为40%~60%,饲养期间笼盒内保持清洁,小鼠在笼内自由活动、进食及饮水,动物房内照明系统为自动控制(12 h照明、12 h黑暗)。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》,并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准指导。
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将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm,剪碎,按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA之后,对目的基因进行PCR扩增,各引物序列见表1。
基因名称 上游引物(5’→3’) 下游引物(5’→3’) R26-WT TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA R26-L-METRNL AAAGTCCCGGAAAGGAGCTG GAGGCTCCATCCAGCAAGTT R26-Stop GGGCAACGTGCTGGTTATTG ACTTGCCCCTTGCTCCATAC 内参基因 TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GATCCACCTGTCTCTGCCTTCC Dppa-Cre TGGGTTGGGTGTCTGTTTCATTGT GACCTTGCATTCCTTTGGCGAGAG 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳,上样量为每孔6 μl,电泳条件为100 V,30 min,结束后进行拍照、分析。
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将小鼠称重后,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(100 mg/kg),待小鼠处于深度麻醉后,打开其胸腔,自上下腔静脉汇合处缓慢抽取血液,并转移至1.5 ml EP管静置于室温。迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、白色脂肪和肌肉组织,放入组织冻存管扔进液氮速冻,待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。血液于室温静置2 h后离心:4 ℃,3000×g,15 min,分离血清,储存至−80 ℃超低温冰箱。
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使用RNA提取试剂盒提取组织RNA,将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录,得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验,各引物序列见表2。
基因名称 上游引物(5′→3′) 下游引物(5′→3′) 人 METRNL ACCAGCGACTTCGTAATTCAC CAGCTCCACGTCATGGGTG 小鼠 Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管,加入蛋白裂解液后,使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管,离心:12000 × g,20 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中,进行蛋白浓度测定,剩余样品加入5 × 蛋白上样缓冲液,97 ℃变性10 min得到蛋白样品。
使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳,电泳条件为:150 V,60 min。使用PVDF膜进行转膜,转膜条件为100 V,60 min。
转膜结束后,使用快速封闭液封闭15 min,之后使用1×TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入一抗(1∶1000稀释)4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液,使用1 × TBST缓冲液洗膜,5 min × 3次。加入二抗孵育液(1∶2 000稀释)常温孵育1 h,用1 × TBST缓冲液洗去二抗,5 min × 4次,结束后即可进行扫膜。
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使用酶联免疫吸附实验试剂盒(DY7867-05)测定小鼠血清中的METRNL水平,具体操作按照试剂盒说明书进行。
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实验数据使用GraphPad Prism 8.0进行统计分析。两组间的比较使用双尾t检验,P<0.05视为差异有统计学意义。
Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014
- Received Date: 2023-11-08
- Accepted Date: 2024-03-12
- Rev Recd Date: 2024-02-17
- Available Online: 2024-05-22
- Publish Date: 2024-05-25
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Key words:
- METRNL /
- systemic overexpression /
- mouse
Abstract:
Citation: | WANG Xuelian, ZHENG Sili, LI Zhiyong, LUO Hengyu, MIAO Chaoyu. Construction and validation of a mouse model with systemic overexpression of human METRNL gene[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2024, 42(5): 198-202, 222. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202311014 |