Screening and anti-colorectal activity of small molecule inhibitors of Fusobacterium nucleatum

基于市售化合物库（上海陶术生物科技有限公司）中5073个化合物针对Fn的表型筛选结果，选择9个不同结构类型、不同作用机制、不同活性的化合物作为本研究的实验材料；鼠源PD-1（程序性死亡受体1）抗体（武汉艾美捷科技有限公司）；布氏肉汤、脑心浸出液（BHI）肉汤（美国BD公司）；结直肠癌类器官基础培养基、培养基补充液B、培养基补充液C、类器官培养型基质胶、肿瘤组织消化液和红细胞裂解液（伯桢生物科技公司）；直肠癌组织（海军军医大学第一附属医院肛肠科）；DMEM培养基、CCK-8检测试剂盒、胎牛血清（上海翌圣生物科技股份有限公司）；人结直肠癌细胞HCT116（上海中国科学院细胞中心）；具核梭杆菌（ATCC 23726，美国模式菌种收集中心）；裸鼠（上海吉辉实验动物饲养有限公司）；xCELLigence RTCA DP实时无标记细胞分析仪（安捷伦科技有限公司）。

①实验前准备：首先，配置完全培养基（结直肠癌类器官基础培养基∶培养基补充B∶培养基补充C=976∶20∶4）；其次，将−20℃保存的类器官基质胶放置于4℃融化（室温下不超过30 s）；最后，将肿瘤组织消化液置于37℃的水浴锅内预热。②组织收集与处理：直肠癌组织用类器官基础培养基清洗2遍，置于盛有PBS的无菌培养皿中，无菌剪刀剪碎组织至直径小于1 mm，然后用适量的肿瘤组织消化液重悬，并转移至离心管内，于37℃、100 r/min的恒温振荡培养箱中消化30 min，在消化完成的组织悬液中加入胎牛血清（FBS）至终浓度达1%～5%，减缓消化作用，同时轻轻吹打5～10次。③筛选细胞：用100 μm细胞过滤器过滤组织悬液，将穿过的滤液转移至离心管中，450 r/min离心3 min，吸去上清液。④细胞收集：用类器官基础培养基清洗细胞2次，加入红细胞裂解液裂解1 min，300 r/min离心3 min，吸去上清液。⑤3D培养板细胞接种：按每孔2×10³个细胞用20 μl基质胶于冰浴条件下混匀，然后用移液器将基质胶和细胞的混合液移至细胞培养24孔板底部中央位置,于37℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育15 min。⑥加液培养：待培养24孔板基质胶凝固至不再流动后，沿孔壁缓缓加入完全培养基，于37℃、5% CO₂培养箱中培养。⑦加Fn菌液：培养72 h后，观察类器官成型且稳定，采用完全培养基重悬Fn使其浓度分别为1×10⁸ CFU/ml和1×10⁴ CFU/ml，加入24孔板中，同时在不同孔中加入同体积PBS。⑧观察:每天在同一视野、同一放大倍数下分别对PBS、浓度为1×10⁴ CFU/ml和1 × 10⁸ CFU/ml的Fn作用下的直肠癌类器官进行拍照记录，观察类器官生长变化，共4 d。

①细胞培养：用8 ml含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基培养HCT116细胞。待细胞生长至 90% 左右时，弃上清液，加入2 ml PBS清洗，2 ml胰酶消化1.0 min，加入3 ml含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基吹打均匀，1 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，加入4 ml含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基再次吹打均匀，取10 μl细胞悬液稀释10倍至100 μl，置于细胞计数板上计数。②细胞铺板：将HCT116细胞按照浓度为每孔7 × 10³个/ml加100 μl于96孔板中，37℃、5% CO₂细胞培养箱中孵育12 h。③受试药物与细胞或与细胞和Fn共孵育：吸出培养基，每孔加入100 μl不同浓度的受试化合物，将生长良好的Fn培养液用4 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入无胎牛血清、无双抗的DMEM培养基混匀，比浊仪将菌的浓度调至0.5麦氏浊度[（1～2）×10⁸ CFU/ml]制得Fn菌液，然后再加入100 μl感染系数（MOI）为1 000∶1的上述Fn菌液或新鲜无胎牛血清和双抗的DMEM培养基，于37℃、5% CO₂细胞培养箱中培养72 h。④测定IC₅₀：吸出培养基，加入100 μl浓度为10%的CCK-8溶液，35℃孵育0.5 h，在450 nm波长的条件下读取A值；用GraphPad Prism 7软件拟合出受试药物对HCT116细胞或与Fn共孵育HCT116细胞的IC₅₀值。

①HCT116细胞培养和Fn菌液准备同“2.2”项。②按实时无标记细胞分析仪的规范操作程序完成名称、目的、分组、时长等输入。③以50 μl含5%胎牛血清、无双抗DMEM培养基进行基线矫正。④每孔加入7×10³个/ml 的HCT116细胞，在室温下放置 30 min后，放置于测试台中。⑤ 18 h后暂停设备，吸出培养基，加入含5%胎牛血清、无双抗DMEM培养基的Fn菌液100 μl，使得MOI=1 000∶1，加入浓度在最小抑菌浓度（MIC）上下的受试化合物100 μl，放入测试台中继续培养72 h，实时观察记录HCT116细胞数量变化。

①裸鼠在动物房无操作下饲养5 d，然后在裸鼠饮用水中加入链霉素和克林霉素使其浓度分别为5 g/L和0.1 g/L，继续饲养7 d以清理裸鼠肠道微生物，减少其他微生物对实验结果的影响。②以皮下注射方式，接种浓度为1.0×10⁷个/ml的人源HCT116细胞。③待皮下肿瘤大小长至50 mm³时，将浓度为1×10⁸ CFU/ml（BHI溶解）的Fn菌液灌胃，每2 d给予1次，500 μl/只，共4次。④将荷瘤裸鼠随机分为4组，对照组和PD-1组每组5只，甲氨蝶呤组和联合用药组每组3只。对照组：每3 d给予Fn灌胃1次；PD-1组：除每3 d Fn灌胃1次外，另外给予鼠源PD-1抗体腹腔注射100 μl，首周3次，次周2次，每次给药剂量为5 mg/kg；受试药物组：除每3 d给予Fn灌胃1次外，再给予甲氨蝶呤灌胃500 μl，剂量为0.5 mg/kg，每天给药1次；联合用药组：采用同样的给药频率和剂量，同时给予甲氨蝶呤和PD-1抗体。⑤裸鼠体质量和肿瘤体积监测：每天监测荷瘤裸鼠体质量和皮下肿瘤体积变化，观测15 d后断颈处死裸鼠。肿瘤体积计算公式为V=1/2×a×b²，式中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径。抑瘤率（%）=（对照组平均体积−实验组平均体积）／对照组平均体积×100%。

实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。符合正态分布计量资料用（$ \bar{x}\pm \mathrm{s} $）描述，进行方差分析或t检验，计数资料采用$ {\chi ^2} $检验。P<0.05为有统计学差异。

连续4 d对PBS和不同浓度Fn干预下的固定位置直肠癌类器官生长情况的拍照观察结果显示，PBS阴性对照组的直肠癌类器官随时间呈缓慢生长；但是，1×10⁴ CFU/ml浓度的Fn干预下的直肠癌类器官随时间呈急速生长，且呈浓度依赖（图1）。

用CCK-8法分别比较测定了前期筛选获得的9个MIC达2.0~32 μg/ml的抗Fn活性化合物对人结直肠癌HCT116细胞及在最优MOI条件下与Fn共孵育的人结直肠癌HCT116细胞的体外IC₅₀，结果显示，9个受试化合物均能显著提升Fn与结肠癌细胞共孵育条件下的体外抗肿瘤活性，其中甲氨蝶呤提升幅度最大，达143倍（表1）。

通过实时无标记肿瘤细胞分析技术检测了优选抗Fn活性化合物甲氨蝶呤在Fn与HCT116细胞共孵育条件下对肿瘤细胞生长的影响，实时检测结果显示，甲氨蝶呤也能显著抑制Fn的促肿瘤细胞生长作用，且呈浓度依赖性（图2）。

综上所述，优选甲氨蝶呤开展后续Fn灌胃干预下裸鼠人结肠癌HCT116移植瘤的体内抗癌药效评价。

在Fn灌胃干预下，抗Fn优选化合物甲氨蝶呤（0.5 mg/kg） 以及PD-1抗体 （5.0 mg/kg） 单独用药的抑瘤率分别为 11.39%、 53.95%； 当甲氨蝶呤 （0.5 mg/kg）与PD-1抗体（5.0 mg/kg）联用后，其抑瘤率可显著提升至67.46%（见图3A）。给药组荷瘤裸鼠的体质量无显著变化，与对照组相似（见图3B）。

本文研究表明：①Fn（1 × 10⁴ CFU/ml）可显著促进直肠癌类器官增殖，且呈浓度依赖（图1），患者衍生的类器官模型表明，Fn的高富集可促进直肠癌的发展，加重病情，严重威胁患者的生命安全，由此可知，在体内抑制Fn的复制、繁殖等可能会为患者带来好处。② 9个抗Fn活性化合物（MIC= 2.0~32 μg/ml）均能显著提升与Fn共孵育结肠癌HCT116细胞的体外抗肿瘤活性，甲氨蝶呤提升抗癌活性幅度最大，达143倍（表1），同时，实时无标记肿瘤细胞生长分析实验显示，甲氨蝶呤也能显著抑制Fn促结肠癌HCT116细胞生长作用，且呈浓度依赖特性（图2）。Fn、细胞、化合物共孵育实验表明，部分化合物在抵抗Fn促增殖作用的同时，可提升其体外抗肿瘤活性，其中，甲氨蝶呤作为经典的抗肿瘤药物，在抗Fn、抗肿瘤细胞以及抗Fn和肿瘤细胞共孵育中均表现出不俗的效果，但产生此效果的机制尚需进一步研究。③优选活性化合物甲氨蝶呤（0.5 mg/kg）与PD-1抗体（5.0 mg/kg）联用，对Fn灌胃干预下裸鼠人结肠癌HCT116移植瘤具有显著的抑制活性，其抑瘤率达67.46%，分别优于相同给药剂量的甲氨蝶呤和PD-1抗体单独用药的抑瘤活性，且对荷瘤裸鼠的体质量无显著影响。从体内实验结果中可知，在Fn高富集的情况下，甲氨蝶呤联合应用PD-1抗体后表现出更好的治疗效果。本研究首先在类器官层面验证了Fn促进直肠癌增殖的效果，其次探索了Fn、细胞同时存在情况下，化合物体外抗肿瘤效果变化，最后根据实验结果优选经典化疗药物甲氨蝶呤，利用裸鼠人结肠癌HCT116移植瘤模型验证了体内效果，并得出基于抗致病具核梭杆菌开发抗结直肠癌的药物具有应用前景的结论。

本研究可为后续抗Fn类抗结直肠癌药物结构衍生提供先导化合物，并有望拓展甲氨蝶呤的新适应证。同时，本文研究仍有部分缺陷，如体内实验没有设置无Fn灌胃干预组，观察无Fn干预情况下裸鼠移植瘤的肿瘤增殖情况，因此，这也为后续深入结构优化所得高抗Fn活性化合物的体内抗结直肠癌活性研究提供改进策略。