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白蔹为葡萄科蛇葡萄属植物白蔹的干燥块根,首载于《神农本草经》。白蔹是最早用于疮痈、烫伤[1]治疗的药物,具有解毒、生肌的功效。资料显示,白蔹在皮肤创伤治疗中的使用频率较高。随着白蔹药理研究的不断深入,发现白蔹还具有抗菌、抗病毒[2-6]、免疫调节及促进溃疡快速愈合等作用。
在2015版《中国药典》中,白蔹的质量标准只有定性分析而无定量分析。白蔹成分检测中发现其含大黄素等蒽醌类活性成分[7],且白蔹中大黄素的定量测定方法文献资料[8-9]较少。本实验采用反相高效液相色谱法,建立白蔹药材中大黄素含量测定方法,为白蔹的质量控制标准提供方法和依据。
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Apollo-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为甲醇−0.2%磷酸溶液(85:15),流速1.0 ml/min,检测波长220 nm,进样量20 μl。在此条件下,大黄素与相邻色谱峰分离度良好,无干扰,理论塔板数为2 000。对照品与供试品色谱图见图1。
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取大黄素对照品(含量为99.1%)约10 mg,精密称定,置于1 000 ml 容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,得浓度为9.91 μg /ml 的大黄素对照品储备液,备用。
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取过5目筛的白蔹药材粉末,置烘箱内(70±2)℃,2 h烘干。精密称量30 g,用10倍量质量分数20%的硫酸在50 ℃条件下回流水解2 h。过滤,取滤渣。滤渣用纯化水洗至中性(pH=7),烘干。称其质量,记录。再以8倍量体积的95%乙醇在82 ℃条件下回流提取2次,每次1 h,过滤,合并乙醇提取液,减压蒸馏,浓缩至无醇味,加乙醇溶解并定容于10 ml容量瓶中,即得供试品溶液。
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分别精密量取“2.2.1”项下制备的大黄素对照品溶液各125、250、500、1 000、2 000、4 000 μl,分别置10 ml容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,配制成6种不同浓度的对照品溶液。依次精密吸取对照品溶液各20 μl注入高效液相色谱仪中,记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标,对照品溶液浓度X为横坐标,进行线性回归,得回归方程为Y = 53 962X − 966. 46,r = 0.999 7;结果表明大黄素在0.124~3.968 μg/ml浓度范围内线性关系良好。
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精密量取对照品溶液20 μl,按“2.1”项下色谱条件连续进样6次,测定峰面积。大黄素峰面积RSD为1.7%。仪器精密度良好,符合要求。
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精密称取同一批号样品6份,按“2.2.2”项下方法平行制备样品溶液,在“2.1”项色谱条件下,分别进样,测定大黄素的峰面积,RSD为1.2%(n= 6),结果表明本方法重复性良好。
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按“2.1”项下色谱条件,分别精密量取在室温(10~30 ℃)下放置0、2.5、5、7.5、10、24 h的同一份供试品溶液各20 μl进样测定,记录大黄素的峰面积,6次进样结果表明,供试品溶液在24 h内基本稳定,RSD为1.5%。
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取同一批次(批号:20170704)已知含量的白蔹药材样品9份,分别按相当于样品溶液中大黄素含量的80%(n=3)、100%(n=3)、120%(n=3)加入“2.3.1”项下制备的对照品溶液,按“2.2”项下色谱条件进行测定。计算回收率,结果见表1。
表 1 白蔹药材样品加样回收率试验结果
样品含有量(m/mg) 加样量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD
(%)0.225 0.180 0.399 96.7 99.7 2.5 0.225 0.180 0.403 98.9 0.225 0.180 0.409 102.0 0.225 0.225 0.446 98.2 0.225 0.225 0.458 103.6 0.225 0.225 0.447 98.7 0.225 0.270 0.503 103.0 0.225 0.270 0.494 99.6 0.225 0.270 0.487 97.0 -
取不同批次白蔹药材样品,分别按“2.3.2”项下方法制备样品溶液,按“2.2”项下色谱条件测定峰面积,连续进样3次,以外标法计算含量,测定结果见表2。
表 2 白蔹样品大黄素含量测定结果(n=3)
批号 含量(μg/g) RSD(%) 20170622 17.845 1.16 20170626 19.113 2.07 20170704 15.002 2.50
Emodin assay in Ampelopsis radix by RP-HPLC
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摘要:
目的 建立白蔹药材中大黄素含量的测定方法,为完善白蔹药材的质量控制标准提供方法和依据。 方法 采用反相高效液相色谱法,色谱柱:Apollo-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相:甲醇-0.2%磷酸(85:15);流速:1.0 ml/min;柱温:室温;检测波长:220 nm。 结果 在选定的色谱条件下,白蔹药材中大黄素在0.124~3.968 μg/ml范围内线性关系良好,直线回归方程为Y=53 962X–966.46,r=0.999 7,平均回收率为99.7%,RSD为2.5%(n=9)。 结论 该方法所测结果准确、灵敏度高、重现性好,适用于白蔹药材中大黄素的含量测定。 Abstract:Objective To establish a method for Emodin assay in Ampelopsis radix, and to improve the quality control of Ampelopsis radix. Methods Reversed phase high performance liquid chromatography was used. The column: Apollo-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μm); mobile phase: methanol:0.2% phosphoric acid (85:15); flow rate: 1.0 ml/min; column temperature: room temperature; detection wavelength: 220 nm. Results With the specified chromatographic conditions, there was a good linear relationship for Emodin in Ampelopsis radix in the range of 0.124-3.968 μg/ml. The linear regression equation was Y= 53 962X–966.46, r=0.999 7. The average recovery was 99.7%. RSD=2.5% (n=9). Conclusion This method is accurate, sensitive and repeatable. It is suitable for the determination of emodin in Ampelopsis radix. -
Key words:
- Ampelopsis radix /
- emodin /
- HPLC
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表 1 白蔹药材样品加样回收率试验结果
样品含有量(m/mg) 加样量(m/mg) 测得量(m/mg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD
(%)0.225 0.180 0.399 96.7 99.7 2.5 0.225 0.180 0.403 98.9 0.225 0.180 0.409 102.0 0.225 0.225 0.446 98.2 0.225 0.225 0.458 103.6 0.225 0.225 0.447 98.7 0.225 0.270 0.503 103.0 0.225 0.270 0.494 99.6 0.225 0.270 0.487 97.0 表 2 白蔹样品大黄素含量测定结果(n=3)
批号 含量(μg/g) RSD(%) 20170622 17.845 1.16 20170626 19.113 2.07 20170704 15.002 2.50 -
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