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五倍子洗剂是我院依据中医药理论为基础应用于临床多年的协定方，主要用于复杂性肛瘘术后治疗，能促进术后创面的愈合，减轻术后水肿、疼痛、排尿障碍等不良反应[1-3]。五倍子洗剂由五倍子、槲寄生、黄柏、紫花地丁、大黄等八味中药经水煎提取制备而成。现有的五倍子洗剂是采用传统方法水煎剂直接处理得到，虽然临床应用多年，但是其基础研究薄弱，缺乏制剂相应规范化的提取标准，且存在质量差异，制剂稳定性受到很大影响。随着中药质量标准的进步和发展，有必要对其质量控制进行进一步的深入研究。根据2020年版《中国药典》中药材“含量测定”项中规定，五倍子、槲寄生、黄柏、紫花地丁和大黄的指标性成分分别为没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸[4]。目前已有研究对五倍子、黄柏、大黄等单味药材中的指标性成分进行含量测定[5-7]，未有对五倍子洗剂指标性成分含量同时测定的报道。
质谱联用技术具有专属性强，灵敏度高，准确度好的特点，已经越来越多的用于中药中多种成分的检测[8-10]。本研究基于2020年版《中国药典》，建立了一种稳定、快速的，同时测定五倍子洗剂中没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸含量的UPLC-MS/MS法，为五倍子洗剂的质量控制提供一种可靠的方法。
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6460 Triple Quad LC/MS高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），十万分之一电子天平（力辰科技）。
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五倍子（批号：201101，产地：安徽），白矾（批号：200501，产地：安徽），荆芥（批号：200102，产地：江苏），紫花地丁（批号：200902，产地：山东），黄柏（批号：200601，产地：四川），大黄（批号：200601，产地：甘肃），槲寄生（批号：200501，产地：辽宁），炒五灵脂（批号：200401，产地：陕西）；没食子酸（批号：5946，纯度≥98.0%）、紫丁香苷（批号：7568，纯度≥98.0%）、黄柏碱（批号：7682，纯度≥98.0%）、秦皮乙素（批号：127，纯度≥98.0%）、大黄酸（批号：5946，纯度≥98.0%）、苦杏仁苷（批号：5930，纯度≥98.0%）均购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；甲醇、乙腈和甲酸均为色谱纯（SIGMA公司）；水为超纯水。
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色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm, 2.7 μm），流动相：A相为0.2%甲酸溶液，B相为乙腈；线性梯度洗脱，洗脱程序如下：0～1.5 min，10 % B；1.5～7 min，10%～90% B：流速：0.3 ml/min，平衡时间：3 min，柱温：30 ℃；进样量：2 μl。
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采用AJS ESI动态多反应离子监测模式(DMRM)进行二级扫描；离子源参数设置：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi（1 psi=6894.7 Pa）；鞘气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4 000 V；5种成分及内标的质谱参数及保留时间见表1，化学结构式见图1，典型MRM色谱图见图2。
表 1 5种指标性成分以及内标的质谱参数
成分 母离子 子离子 电压（V） 碰撞电压（eV） 保留时间（min） 离子模式 没食子酸 169.0 125.0 100 10 1.8 负离子 紫丁香苷 395.0 364.2 110 17 4.3 正离子 黄柏碱 341.9 191.8 80 20 4.5 正离子 秦皮乙素 177.0 133.1 105 18 4.5 负离子 大黄酸 283.0 238.6 100 8 5.5 负离子 苦杏仁苷* 502.0 456.5 100 10 4.5 负离子 注：*为内标 
图 1 5种指标性成分及内标物的化学结构式
图 2 5种指标性成分及内标的典型色谱图
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精密称取没食子酸10.25 mg、紫丁香苷10.31 mg、黄柏碱10.53 mg、秦皮乙素10.14 mg、大黄酸10.54 mg、苦杏仁10.43 mg置于10 ml容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀备用，即得对照品储备液，浓度分别为没食子酸1.025 mg/ml，大黄酸1.031 mg/ml，紫丁香苷1.053 mg/ml，秦皮乙素1.014 mg/ml，黄柏碱1.054 mg/ml，苦杏仁1.043 mg/ml。精密移取单个对照品储备液适量，置于10 ml容量瓶中混合，加甲醇定容至刻度，得混合对照品储备液。精密移取混合储备液适当体积于10 ml容量瓶中，用甲醇依次逐级梯度稀释。配成混合对照品系列溶液，浓度分别为没食子酸：0.1538～15.38 μg/ml，大黄酸: 1.054～105.4 ng/ml，紫丁香苷：10.31～1031 ng/ml，秦皮乙素：50.00～5000 ng/ml，黄柏碱：5.265～526.5.5 ng/ml，苦杏仁:1043 ng/ml，上述溶液保存于4 ℃冰箱待用。
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按五倍子洗剂配方，分别称取五倍子、白矾、荆芥、紫花地丁、黄柏、大黄、槲寄生、炒五灵脂15 g，加入2500 ml纯净水，浸泡2 h，煎煮30 min，过滤，取适量滤液稀释100倍，经0.22 μm滤膜过滤，取续滤液即得五倍子洗剂供试品溶液；取供试品溶液900 μl，加入内标溶液100 μl，混匀，待分析。
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分别精密移取“2.3” 项中配置好的混合对照品系列溶液 900 μl，加入内标溶液100 μl，混匀，按“2.1”和“2.2”项下UPLC-MS/MS条件进样分析，记录色谱图，计算各成分与内标峰面积的比值。以添加浓度(X)为横坐标，各成分与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，进行线性回归。以信噪比大于10(S/N>10)作为定量下限，S/N>3作为检测下限。检测限、定量限、回归方程、线性范围及相关系数见表2，结果表明5种成分在相应的线性范围内呈良好的线性关系。
表 2 五倍子中5种指标性成分的标准曲线 (n=5)
成分 回归方程 r 线性范围（ng/ml） 检测限（ng/ml） 定量限（ng/ml） 没食子酸 Y=0.03438X−5.255 0.9991 153.8～15380 3.076 6.152 紫丁香苷 Y=0.05062X−0.1248 0.9998 10.31～1031 1.031 2.062 黄柏碱 Y=37.94X−8.409 0.9980 5.265～526.5 0.0526 0.1052 秦皮乙素 Y=0.1316X+4.712 0.9983 50.70～5070 2.028 4.056 大黄酸 Y=0.09424X+0.003552 0.9995 1.054～105.4 0.5270 1.054 -
取混合对照品高（没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的浓度分别为3.076、206.2、105.3、1.014、21.08 ng/ml）、中（浓度分别为1538、103.1、52.65、507.0、10.54 ng/ml）、低（浓度分别为769.0、51.55、26.32、253.5、5.270 ng/ml）三个浓度，按“2.3.2”项下方法处理样品，并按“2.1”和“2.2”项下UPLC-MS/MS条件进样分析，连续3 d测定，记录各成分色谱峰面积，计算浓度，考察日内和日间精密度，结果没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸在低浓度下的日内精密度RSD值分别为1.92%、0.28%、1.09%、1.97%、1.46% (n=3)，日间精密度RSD值分别为5.57%、1.82%，4.18%、4.08%、2.08%；中浓度下的日内精密度RSD值分别为1.55%、0.96%、1.09%、1.97%、0.87% (n=3)，日间精密度RSD值分别为1.61%、2.39%，1.33%、2.35%、4.68%；高浓度下的日内精密度RSD值分别为1.08%、1.77%、1.20%、1.48%、1.31% (n=3)，日间精密度RSD值分别为1.41%、3.11%，1.50%、2.96%、1.89%、7.20%；结果显示该方法精密度符合方法学要求，仪器精密度良好。
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精密取同一批五倍子洗剂溶液，共6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”和“2.2”项下条件进样分析，记录各成分色谱峰面积，计算浓度，没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的浓度分别为1 968、99.87、66.23、892.4、10.09 ng/ml，RSD分别为1.69%、4.11%、3.49%、4.09%、2.5%，结果表明该方法的重复性良好。
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按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、3、7、12、24 h测定供试品溶液中没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的含量，考察供试品常温放置稳定性，没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的RSD分别为2.58%、4.26%、4.86%、1.24%、5.26%，结果表明样品溶液在24 h内稳定性良好。
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精密量取五倍子供试品溶液，加入适量对照品溶液，平行操作6份，按“2.3.2”项下方法制备溶液，测定没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的含量，计算加样回收率（见表3），结果表明该方法回收率良好。
表 3 五倍子洗剂加样回收试验结果
成分 回收率（%） 平均值 RSD
（%）1 2 3 4 5 6 没食子酸 92.98 104.98 103.54 96.23 99.61 94.41 98.63 4.98 紫丁香苷 96.19 97.43 101.43 96.19 94.52 97.51 97.21 2.4 黄柏碱 84 92.51 96.65 93.31 91.48 95.28 92.2 4.81 秦皮乙素 101.38 101.87 104.54 95.86 100.71 100.79 100.86 2.8 大黄酸 103.54 96.71 96.9 93.1 91.2 95.95 96.23 4.39 -
精密量取3批次五倍子供试品溶液，按“2.3.2”项下方法制备溶液，测定没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的含量，结果如表4所示。
表 4 五倍子洗剂中5种指标性成分含量测定结果
成分 样品含量（μg/ml） 平均值 RSD
（%）1 2 3 没食子酸 190.8 182.2 200.6 191.2 4.82 紫丁香苷 10.66 9.966 10.33 10.32 3.36 黄柏碱 6.938 7.526 7.169 7.211 4.11 秦皮乙素 93.84 91.56 93.41 92.94 1.30 大黄酸 1.039 0.9651 1.063 1.022 4.99 -
五倍子洗剂中不同成分的含量差异较大，不同稀释倍数处理后进样，部分成分超出标准曲线线性范围，如没食子酸含量过高，大黄酸含量过低，进一步扩大线性范围会导致线性方程r系数不达标。因此，本实验针对稀释倍数进行了探索，五倍子洗剂稀释100倍处理后，6种成分的浓度均在线性范围内。
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前期采用高效液相色谱法检测五倍子洗剂中多个化学成分，但五倍子洗剂的各成分复杂，待测成分相互干扰，因此在色谱柱中分离时间较长，难以获得分离效果较好的色谱系统；同时各成分的含量差异较大，含量偏低的成分如大黄酸、紫丁香苷，其响应信号较低，不能满足定量要求。故本实验采用高选择性和高灵敏度的液质联用技术测定五倍子洗剂中5种指标性成分的含量。由于各成分在结构方面存在差异，为了兼顾各成分测定以使其具有较高的灵敏度，本实验采用正负离子切换模式同时定量5种成分，并优化碎片电压和碰撞能量，紫丁香苷和黄柏碱在正离子扫描模式下响应更强，而没食子酸、秦皮乙素、大黄酸在负离子扫描模式下的响应值更高。
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由于五倍子洗剂中没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的极性差异较大，预试验考察了不同色谱柱Waters HSS T3（2.10 mm×100 mm, 2.5 μm）、BEH Amide（2.1 mm×100 mm, 1.7 μm）、Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm, 2.7 μm）和不同流动相体系（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液、乙腈-甲酸溶液）对成分响应和峰形的影响。结果发现，Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱与乙腈-0.2%甲酸流动相组合后，没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的响应强度和峰形较好，并在7 min内完成分析。
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本实验建立了同时测定没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸6 种指标性成分UPLC-MS/MS方法，该方法样品前处理简便，结果准确稳定、重现性好，分析时间短，对五倍子洗剂的质量控制研究具有重要意义，为五倍子洗剂的进一步开发奠定基础。
Quantitative analysis of five compounds in gallnut lotion by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时检测五倍子洗剂中没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的含量。 方法 采用UPLC-MS/MS法，色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×150 mm，2.7 μm），流动相为0.2%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脱，流速为0.3 ml/min，柱温30 ℃；进样量2 μl。质谱检测采用动态多反应离子检测模式（DMRM）。 结果 没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸分别在153.8～15380、10.31～1031、5.265～526.5、50.70～5070、1.054～105.4 ng/ml浓度范围内线性关系良好，其精密度、重复性、稳定性和加样回收率均良好。 结论 该UPLC-MS/MS法稳定、快速、重复性好，适用于检测五倍子洗剂中没食子酸、紫丁香苷、黄柏碱、秦皮乙素、大黄酸的含量。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱法 /
- 五倍子洗剂 /
- 含量测定
Abstract:Objective To develop an ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method to simultaneously detect the contents of gallic acid, syringin, phellodendrine, aesculin and rhein in the gallnut lotion. Methods An UPLC- MS/MS method was established. Separation was performed on an Agilent Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×150 mm, 2.7 μm)with a gradient mobile phase system of 0.2% formic water-acetonitrile solution. The flow rate was 0.3 ml/min. The temperature of column was 30 ℃. The injection volume was 2 μl. The MS detection was in dynamic MRM mode. Results gallic acid, syringin, phellodendrine, aesculin and rhein were successfully separated using this method, with good linear relationship as the ranges of 153.8-15380、10.31-1031、5.265-526.5、50.70-5070、1.054-105.4 ng/ml, respectively. The precision, repeatability, stability and recovery were good. Conclusion This UPLC-MS/MS method is stable, rapid, and reproducible., It is suitable for detecting the contents of gallic acid, syringin, phellodendrine, esculetin and in the gallnut lotion. -
Key words:
- UPLC- MS/MS /
- gallnut lotion /
- determination
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图 2 5种指标性成分及内标的典型色谱图
A.空白对照溶液；B.对照品溶液；C.五倍子洗剂供试品溶液1.没食子酸；2.紫丁香苷；3.黄柏碱；4.秦皮乙素；5.大黄酸；6.苦杏仁苷
表 1 5种指标性成分以及内标的质谱参数
成分 母离子 子离子 电压（V） 碰撞电压（eV） 保留时间（min） 离子模式 没食子酸 169.0 125.0 100 10 1.8 负离子 紫丁香苷 395.0 364.2 110 17 4.3 正离子 黄柏碱 341.9 191.8 80 20 4.5 正离子 秦皮乙素 177.0 133.1 105 18 4.5 负离子 大黄酸 283.0 238.6 100 8 5.5 负离子 苦杏仁苷* 502.0 456.5 100 10 4.5 负离子 注：*为内标 
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表 2 五倍子中5种指标性成分的标准曲线 (n=5)
成分 回归方程 r 线性范围（ng/ml） 检测限（ng/ml） 定量限（ng/ml） 没食子酸 Y=0.03438X−5.255 0.9991 153.8～15380 3.076 6.152 紫丁香苷 Y=0.05062X−0.1248 0.9998 10.31～1031 1.031 2.062 黄柏碱 Y=37.94X−8.409 0.9980 5.265～526.5 0.0526 0.1052 秦皮乙素 Y=0.1316X+4.712 0.9983 50.70～5070 2.028 4.056 大黄酸 Y=0.09424X+0.003552 0.9995 1.054～105.4 0.5270 1.054
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表 3 五倍子洗剂加样回收试验结果
成分 回收率（%） 平均值 RSD
（%）1 2 3 4 5 6 没食子酸 92.98 104.98 103.54 96.23 99.61 94.41 98.63 4.98 紫丁香苷 96.19 97.43 101.43 96.19 94.52 97.51 97.21 2.4 黄柏碱 84 92.51 96.65 93.31 91.48 95.28 92.2 4.81 秦皮乙素 101.38 101.87 104.54 95.86 100.71 100.79 100.86 2.8 大黄酸 103.54 96.71 96.9 93.1 91.2 95.95 96.23 4.39
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表 4 五倍子洗剂中5种指标性成分含量测定结果
成分 样品含量（μg/ml） 平均值 RSD
（%）1 2 3 没食子酸 190.8 182.2 200.6 191.2 4.82 紫丁香苷 10.66 9.966 10.33 10.32 3.36 黄柏碱 6.938 7.526 7.169 7.211 4.11 秦皮乙素 93.84 91.56 93.41 92.94 1.30 大黄酸 1.039 0.9651 1.063 1.022 4.99
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