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玄膝荣筋散是由蚂蚁、青风藤、老鹳草、川芎、全蝎、重楼等十三味中药组成的复方制剂，其中黄芪为君药，白术、桂枝为臣药，具有滋补肝肾，养肝荣筋，消热利湿，祛风止痛。用于早、中、晚期风湿、寒型类风湿性关节炎。由于该标准中仅包含一个川芎薄层色谱鉴别和蚂蚁、黄芪的显微鉴别，且无定量测定方法，不能全面控制制剂质量。根据全军医疗机构制剂标准提高课题要求，在原有质量标准基础上，增加了川芎、穿山龙的薄层鉴别，同时采用高效液相色谱法，测定玄膝荣筋散中所含桂皮醛的含量，该法灵敏度高、专属性好、操作简便、重现性好。
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LC-20AD岛津高效液相色谱仪（日本）； 紫外检测器。
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玄膝荣筋散（批号：140601、131226、140701，规格：250g/袋），由南京政治学院门诊部提供；桂皮醛（对照品，批号：110710-201418，中国食品药品检定研究院）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。
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取本品5 g，加乙醚20 ml，超声处理15 min，滤过，滤液低温挥去乙醚，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。取川芎对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。取缺川芎的阴性样品，同法制备阴性对照液。吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯 (9∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性试验样品未见干扰，见图1。
图 1 川芎薄层色谱图
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取本品粉末15 g，加甲醇50 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取穿山龙对照药材0.5 g，加甲醇25 ml，同法制成对照药材溶液。取缺穿山龙的阴性样品，同法制备阴性对照液。吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水 (13∶7∶2)的下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性试验样品未见干扰，见图2。
图 2 穿山龙薄层色谱图
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色谱柱：KR100-5C18 (250mm×4.6mm ；5μm， E14878)；流动相：乙腈-水（35∶65）;流速：1.0 ml/min；检测波长290 nm；进样体积：10 μl。在此条件下，样品中桂皮醛与基线达到良好分离，见图3。
图 3 专属性试验HPLC图谱
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取桂皮醛对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml含桂皮醛 15 µg的溶液，即得。
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取样品（过四号筛）粉末约1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入80 %乙醇25 ml，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定重量，用 80 %乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
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按处方量制备缺桂枝的阴性样品，按供试品溶液方法制备阴性对照溶液。
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取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，阴性对照液中色谱峰对测定无干扰（见图3）。
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取桂皮醛对照品适量，加甲醇溶解并制成每1 ml含0.0326 mg溶液，作为对照品溶液5,将溶液5分别稀释为0.00489、0.008150、0.0163、0.02445 mg/ml四种浓度，作为对照品溶液1～4。精密吸取上述对照品溶液1～5各10μl，注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定峰面积，以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：Y=10181123.15X+6639.54，r=1.00，结果表明：桂皮醛在0.0489~0.3260 µg/ml范围内有良好的线性关系。
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精密吸取“2.2.3”项下供试品溶液，在上述色谱条件下，连续进样6次。结果峰面积的RSD为1.07%（n=6），表明仪器精密度良好。
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取同一批号的玄膝荣筋散（批号140601）按“2.2.3”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件，测得桂皮醛峰面积RSD为1.12%，结果表明此法重复性良好。
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取同一批号的玄膝荣筋散（批号140601）样品，精密称定，照上述含量测定方法，精密吸取10 µl, 分别在0、2、4、8、12、24 h进样，测定一次。结果桂皮醛峰面积的RSD为0.95%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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取同一批号的玄膝荣筋散（批号140601）0.5 g，精密称定，分别精密加入桂皮醛（0.00815 mg/ml）对照品溶液25 ml，按“2.2.3”项下制备方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果见表1。
表 1 桂皮醛加样回收率试验测定结果
称样量（g） 相当桂皮醛量（mg） 加入量（mg） 实测量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 0.5078 0.1737 0.2038 0.3717 97.15 0.5045 0.1725 0.2038 0.3708 97.30 0.5064 0.1732 0.2038 0.3644 93.82 95.69 1.78 0.5018 0.1716 0.2038 0.3637 94.26 0.5051 0.1727 0.2038 0.3650 94.36 0.5006 0.1712 0.2038 0.3694 97.25 -
取3批样品，按上述供试品溶液制备方法处理，进样，计算桂皮醛的含量，见表2。
表 2 玄膝荣筋散中桂皮醛含量测定结果（n=3）
批号 含量（mg/g） 140601 0.3422 140701 0.3121 131226 0.2945 -
桂皮醛为桂枝药材的主成分，经紫外吸收光谱扫描（200～400 nm），在291 nm处有最大吸收，故确定检测波长为290 nm。
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参照2020版《中国药典》[1] 中桂皮醛含量测定的方法，分别取样品2.0251、1.0530、0.5169 g，加入不同浓度的乙醇、甲醇等，超声处理20、30、40 min，按照正文的含量测定项下方法进行测定。结果表明，最终选择取样量为1g，选用80%乙醇为溶剂，在超声30 min后提取较完全。
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建立该制剂中川芎、穿山龙的薄层色谱鉴别方法，拟增加黄芪、甘草的薄层实验中，因存在阴性试验样品有干扰的问题，故未列入正文。对TLC方法，分别从温度（10 °C和35 °C）、相对湿度（42%和88%）以及不同硅胶板（国产和进口）等方面进行考察。在各试验条件下，鉴别结果不受温度、相对湿度和不同硅胶板等条件改变的影响。说明本文所建立的薄层色谱方法作为定性鉴定方法具有很强的适用性。
本实验运用高效液相色谱法建立了桂皮醛含量测定的方法，经过试验验证，该法灵敏度高、专属性好、操作简便、重现性好，可作为该制剂生产过程中的质量控制及检验手段，更好把控药品疗效与临床用药安全。
Study on quality standard for Xuanxi Rongjin powder
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摘要:
目的 修订玄膝荣筋散的定性和定量测定方法。 方法 采用薄层色谱（TLC）法对川芎、穿山龙进行定性鉴别，HPLC法测定制剂中桂皮醛的含量。采用KR100-5C18 色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈-水（35∶65），检测波长为290 nm。 结果 TLC法能定性鉴别川芎、穿山龙。桂皮醛在0.0489~0.3260µg/ml范围内线性关系良好（r=1.00）。平均加样回收率为95.71%（RSD=1.78%）。 结论 该法灵敏度高、专属性好、操作简便、重现性好。 Abstract:Objective To revise the qualitative and quantitative determination methods of Xuanxi Rongjin powder. Methods TLC was used to qualitatively identify Chuanxiong and Chuanshanlong. The content of cinnamaldehyde in the preparation was determined by HPLC with KR100-5C18 column (250 mm×4.6 mm, 5μm). The mobile phase was acetonitrile-water (35:65) and the detection wavelength was 290 nm. Results TLC can qualitatively identify Chuanxiong and Chuanshanlong. Cinnamaldehyde has a good linear relationship in the range of 0.0489~0.3260 µg/ml (r=1.00), The average recovery was 95.71% (RSD=1.78%). Conclusion The method has high sensitivity, good specificity, simple operation and good reproducibility. -
Key words:
- Xuanxi Rongjin powder /
- quality standard /
- HPLC /
- TLC /
- cinnamaldehyde
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雀梅藤Sageretia thea（Osbeck）Johnst又名雀梅刺、对角刺、碎米子等，为鼠李科雀梅藤属植物，主要分布地区包括云南、安徽、江苏等[1-2]。根、茎、叶均可入药，其性甘、淡、平，具有降气化痰、祛风利湿等功效[3]。民间常用雀梅藤药材煎汤或浸酒内服治疗乳腺肿瘤、淋巴结肿大和水肿等疾病，具有较好效果[4]。现代药理研究表明，雀梅藤具有抗结直肠癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌和肝保护等活性[5-6]，但尚未见雀梅藤对乳腺癌等其他肿瘤影响的报道。该研究通过多种体外实验观察雀梅藤对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响，并初步探索其作用机制，以证实民间应用该药材治疗乳腺肿瘤的合理性，为进一步的药物开发奠定基础。
1. 材料和仪器
1.1 试剂和仪器
CCK8 试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；Spark酶标仪（瑞士Tecan公司）；二氧化碳培养箱（Thermo Fisher）；96孔培养板（泰坦）；电子分析天平（塞多利斯 BSA2245-CW）；细胞计数仪（Corning 6749）；倒置相差显微镜（奥林巴斯 IX73）。
1.2 药材提取
雀梅藤药材购自昆明井田药业有限公司，生产许可证号：滇20160155。经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量教授鉴定为鼠李科雀梅藤属植物雀梅藤Sageretia thea（Osbeck）Johnst.的茎。取雀梅藤干燥药材660 g，粉碎后用8倍量75%乙醇回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，过滤后回收溶剂，得乙醇提取物。乙醇提取物用水溶解混悬，加入等体积的石油醚萃取3次，收集萃取液，通过旋转蒸发得到石油醚萃取部位。进一步采用真空冷冻干燥机在−80 ℃下冻干，分别称重，获得乙醇和石油醚提取物质量为57 g和0.91 g，提取得率分别为8.63%和0.13%。
1.3 提取物溶解
称取20 mg雀梅藤石油醚提取物溶于1 ml的DMSO溶剂中，然后用培养液稀释成不同药物浓度，药物最高剂量下的DMSO浓度不超过0.3%。同时，对照组培养液中添加0.3%的DMSO作为阴性对照。
1.4 细胞株
三阴性人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、BT549购自中国科学院上海细胞库；人脐静脉血管内皮细胞株购自上海赋望实业有限公司。
2. 方法
2.1 细胞活力分析
分别取对数生长期的人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231和BT549及人脐静脉血管内皮细胞株（HUVEC）并计数，以每孔5×103个的细胞密度接种到96孔板，在37 ℃的细胞培养箱中过夜培养至细胞贴壁。实验分为对照组和给药组，对照组以正常培养基培养，给药组以不同浓度含药培养基孵育细胞24 h。随后按试剂盒说明书进行操作，每孔加入10%的CCK8试剂，在培养箱中孵育2 h后，用酶标仪在450 nm处检测各孔的吸光度（OD）值。对照组细胞活力换算为100%，其余各给药组按以下公式计算：细胞增殖抑制率（%）=[（对照组A值−实验组A值）/（对照组A值−空白组A值）]×100%。
2.2 平板克隆试验
取上述对数生长期的人三阴性乳腺癌细胞株，以每孔500个细胞的密度均匀接种在12孔板内，过夜，使细胞贴壁，随后加入雀梅藤提取物孵育24 h。吸弃培养基，用含10%的胎牛血清培养基继续培养，当培养皿中出现肉眼可见的克隆形成时，终止培养。吸弃上清液，用PBS小心浸洗，然后甲醇固定。去除固定液，加入适量的结晶紫染色液进行染色，采用PBS多次轻轻洗去周边染色液，干燥后拍照，随后用Image J软件进行统计分析。
2.3 活死细胞分析
将两种乳腺癌细胞接种于96孔板，放置培养箱中过夜，随后加入提取物孵育24 h。吸弃培养基，用PBS温和洗涤细胞一次，每孔加入100 μl的Calcein AM/PI染色工作液，放入37 ℃培养箱中避光孵育15 min后，用高内涵系统采集图像。
2.4 细胞周期分析
取对数生长期乳腺癌细胞株，以每孔40万个细胞接种于6孔板，培养箱中过夜，待细胞贴壁后，用含不同浓度提取物的培养基处理24 h，消化，离心收集细胞，以预冷的70%乙醇混悬固定过夜。离心，去除乙醇，用PBS清洗一次，加入500 μl的碘化丙啶染色工作液，避光染色30 min后用流式细胞仪分析细胞周期。
2.5 流式凋亡分析
将对数生长期的三阴性乳腺癌细胞株以每孔40万个接种于6孔板中，过夜，待细胞贴壁后，用含不同浓度提取物的培养基孵育24 h。消化，离心收集细胞，用100 μl的1×结合缓冲液混悬后加入FITC Annexin V 和PI各5 μl，轻微振荡，室温下避光孵育15 min，流式细胞仪分析凋亡率。
2.6 DAPI染色分析
将上述对数生长期的人三阴性乳腺癌细胞株以每孔20万个接种于6孔板，过夜，待细胞贴壁后，用含不同浓度提取物的培养基孵育24 h，吸弃培养基，每孔加入1 ml稀释过的DAPI染液孵育细胞10 min，PBS清洗2遍后采用Cytation 5拍照。
2.7 线粒体膜电位（MMP）分析
将对数生长期的人三阴性乳腺癌细胞株以每孔20万个接种于6孔板，过夜，待细胞贴壁后，用含不同浓度提取物的培养基孵育细胞24 h。吸弃培养液，PBS洗涤细胞之后每孔加入1 ml的JC-1染液，在37 ℃培养箱中孵育20 min。吸除上清液，用缓冲液洗涤细胞3次后加入2 ml细胞培养液，高内涵系统拍照。
2.8 活性氧（ROS）含量检测
取上述对数生长期细胞株，以每孔20万个的细胞密度接种于6孔板，过夜，待细胞贴壁后，用含不同浓度提取物的培养基孵育24 h。吸弃培养基，每孔加入1 ml含DCFH-DA的新鲜培养基孵育细胞20～30 min，DAPI复染，采用高内涵系统拍照。
2.9 统计学处理
使用Graphpad Prism 8.0.1分析软件对所获得的实验数据进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 抑制乳腺癌细胞生长
通过细胞活力分析发现，雀梅藤石油醚提取部位对多种癌细胞均有明显细胞毒性，其中对乳腺癌细胞株抑制作用最强，而且明显强于乙醇提取物。结合临床应用，实验选择两种人三阴性乳腺癌系（BT549和MDA-MB-231）进一步研究（见图1）。CCK8结果表明（图1A-B），雀梅藤石油醚提取物以剂量和时间依赖的方式抑制乳腺癌细胞活力，作用24 h和48 h的IC50值分别为45.40、12.23 μg/ml和38.87、7.60 μg/ml。平板克隆实验结果显示（图1C-E），随着雀梅藤石油醚提取物剂量的增加，两种乳腺癌细胞生长均被显著抑制。浓度分别在10 μg/ml和20 μg/ml时，MDA-MA-231和BT549细胞株的生长被完全抑制。Calcein AM/PI活死细胞染色显示（图1F-G），随着药物剂量增加，活细胞（绿色）数量较对照组显著减少，而死亡细胞（红色）数量则显著增加，与对照组比较有极显著差异。
图 1 雀梅藤石油醚提取物抑制乳腺癌细胞生长A-B. 对两种乳腺癌细胞活力的影响；C-E. 对两种乳腺癌细胞平板克隆生长的影响；F-G. 两种乳腺癌细胞的Calcein AM/PI染色分析，绿色代表活细胞，红色代表死细胞*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001，与对照组比较。3.2 诱导乳腺癌细胞周期阻滞
雀梅藤石油醚提取物孵育乳腺癌细胞24 h后，采用流式细胞仪测定细胞的增殖周期情况（见图2）。结果显示，药物明显阻滞两种乳腺癌细胞株的细胞周期，但对两种细胞阻滞周期不同，BT549细胞阻滞在G1期（图2A和2C，给药组G1期细胞比率较对照组显著升高），MDA-MA-231细胞阻滞在S期（图2B和2D，给药组S期细胞比率较对照组显著升高），提示石油醚提取物对两种细胞株的细胞周期阻滞可能存在不同机制。
图 2 雀梅藤石油醚提取物诱导乳腺癌细胞周期阻滞A-B. 对BT-549细胞周期的影响；C-D. MDA-MB-231细胞周期的影响*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001，与对照组比较。3.3 诱导乳腺癌细胞凋亡
采用DAPI染色方法对细胞核形态进行分析（见图3）。如图3A-B所示，正常对照组乳腺癌细胞核呈均匀的圆形浅蓝色，药物处理后细胞核质固缩或碎裂成凋亡小体，且呈剂量依赖性。流式细胞仪凋亡定量分析显示（图3C-F），石油醚提取物显著增加两种乳腺癌细胞的凋亡率，与对照组比较有显著性差异，其中尤以MDA-MA-231细胞株明显，20 μg/ml浓度下几乎诱导细胞全部凋亡。
图 3 雀梅藤石油醚提取物诱导乳腺癌细胞凋亡A-B. 对两种乳腺癌细胞核的影响；C和E. 对BT549细胞凋亡的影响；D和F. 对MDA-MB-231细胞凋亡的影响**P<0.01, ***P<0.001，与对照组比较。3.4 诱导线粒体膜电位坍塌
线粒体通路是肿瘤细胞最常见的凋亡途径，最典型的特征是线粒体膜电位（MMP）水平显著下降。因此，研究采用JC-1免疫荧光染色检测线粒体膜电位水平。结果如图4所示，给药组红色荧光随剂量增加明显减弱，绿色荧光则明显增强，说明给药组线粒体膜电位显著下降。实验结果提示，雀梅藤石油醚提取物可能通过损伤线粒体而促进了乳腺癌细胞凋亡。
图 4 雀梅藤石油醚提取物降低细胞线粒体膜电位A. 对BT549细胞线粒体膜电位的影响；B. 对MDA-MB-231细胞线粒体膜电位的影响（绿色代表低电位，红色代表高电位）3.5 促进乳腺癌细胞活性氧生成
ROS升高是激活线粒体通路诱导肿瘤细胞凋亡的重要原因之一，因此进一步检测了药物处理24 h后ROS含量变化（图5）。结果代表ROS水平的绿色荧光在对照组仅有少量表达，而在给药组则显著增加，经统计学处理有显著性差异，其中尤以BT549细胞株明显，提示药物可能通过促进ROS生成而诱导了乳腺癌细胞凋亡。
图 5 雀梅藤石油醚提取物诱导乳腺癌细胞ROS增加A-B.对BT549细胞ROS水平的影响；C-D.对MDA-MB-231细胞ROS水平的影响**P<0.01, ***P<0.001，与对照组比较。3.6 对正常血管内皮细胞活力的影响
为了确定雀梅藤提取物是否对正常细胞产生毒性，进一步采用同样剂量对人正常脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）进行CCK8细胞活力分析。结果提取物孵育24 h后，即使在60 μg/ml的最高浓度下亦未观察到内皮细胞活力受到影响，与对照组比较无明显差异（图6），提示雀梅藤石油醚提取物对正常细胞并不产生毒性，具有较好的安全性。
4. 讨论
雀梅藤为云南等地民间常用中药，临床观察发现其对乳腺瘤生长有明显抑制作用[7]，且毒性较小[4, 8]。研究前期对雀梅藤的乙醇、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇等5个部位提取物进行了多种肿瘤细胞活性筛选，结果显示，对多数癌细胞，如乳腺癌、结肠癌、肝癌等，都具有明显杀伤作用，其中以石油醚部位提取物对癌细胞作用最为显著。进一步实验发现，雀梅藤石油醚提取物时间和剂量依赖地抑制乳腺癌细胞活力，显著减少细胞克隆形成率，阻滞细胞周期在G1/S期，明显增加癌细胞凋亡率，但并不影响正常血管内皮细胞活力，提示其细胞毒性具有明显的选择性。
引起细胞凋亡的途径包括线粒体通路、死亡受体通路和内质网应激通路，其中线粒体通路是药物诱导肿瘤细胞凋亡的最常见途径[9]，因此研究人员进一步观察了雀梅藤石油醚提取物是否通过损伤线粒体诱导乳腺癌细胞凋亡。结果通过JC-1染色发现，两种乳腺癌细胞的线粒体膜电位均显著降低，提示雀梅藤提取物诱导了细胞线粒体途径的凋亡。
ROS的主要来源之一是线粒体内膜的呼吸链底物端，ROS升高会引起线粒体内膜损伤，造成细胞毒性，从而促进肿瘤细胞凋亡[10]。研究人员用荧光探针方法检测雀梅藤石油醚提取物孵育BT549和MDA-MB-231细胞后的ROS水平，结果发现代表ROS的绿色荧光逐渐增强，表明石油醚提取物显著升高了线粒体内ROS水平。这些结果提示，石油醚提取物可能通过升高线粒体内ROS水平，造成ROS累积，损伤了线粒体，导致线粒体内容物如细胞色素c等流出到细胞质，进而激活caspase级联瀑布反应，从而诱导了细胞凋亡[9,11]。
虽然雀梅藤提取物在体外研究中表现出较好的抗乳腺癌细胞生长作用，但是凋亡信号转导通路和作用靶点尚不明确，线粒体中蛋白表达的变化犹未可知，因此具体作用机制尚需进一步研究。此外，已有研究人员从雀梅藤药材中鉴定出43种化学成分，可分为有机酸类、黄酮类及其他类，有机酸类包括儿茶素及其衍生物等，黄酮类包括异槲皮素等[12]。但是雀梅藤提取物中究竟何种成分发挥主要抗癌作用仍需进一步证实。
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表 1 桂皮醛加样回收率试验测定结果
称样量（g） 相当桂皮醛量（mg） 加入量（mg） 实测量（mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD（%） 0.5078 0.1737 0.2038 0.3717 97.15 0.5045 0.1725 0.2038 0.3708 97.30 0.5064 0.1732 0.2038 0.3644 93.82 95.69 1.78 0.5018 0.1716 0.2038 0.3637 94.26 0.5051 0.1727 0.2038 0.3650 94.36 0.5006 0.1712 0.2038 0.3694 97.25 
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