替考拉宁（teicoplanin）是一种糖肽类抗生素，常用于治疗包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）在内的G⁺菌引起的感染^[1]。它包括5个主要成分（TA 2-1、TA 2-2、TA 2-3、TA 2-4和TA 2-5）、1个水解成分（TA 3-1）和4个次要成分（RS-1～RS-4）^[2]。其中,TA 2-2组分是活性最强的化合物，占各组分相对含量的40%以上^[3-4]，临床上常常通过测定TA 2-2的含量来监测替考拉宁的浓度^[5-6]。目前，替考拉宁治疗药物监测主要以测定总浓度为主，但监测结果存在较大的个体差异。主要因为替考拉宁蛋白结合率较高（90 %～95%），在血液循环中主要与白蛋白（Alb）结合并处于动态平衡，未结合的游离部分在体内发挥药效^[7]。健康状态下，人体白蛋白为正常水平（35～52 g/L），不同患者药物的血浆蛋白结合率变化不大；但在低蛋白血症（Alb<25 g/L）^[8-10]、危重症、酸血症、肾衰竭、肝硬化、吸烟、多种药物合用等特殊情况下，患者常伴有白蛋白水平下降，当Alb<30 g/L时，白蛋白就会对替考拉宁游离浓度产生显著影响从而影响疗效^{[7, 10]}。同时，游离药物水平升高导致肾脏排泄增加，肾毒性风险增加^[11-12]。所以，针对上述白蛋白水平较低的患者，单纯用总浓度去评价替考拉宁的疗效和安全性是片面的，若同时测定替考拉宁游离浓度，将更加利于临床精准调整给药方案，以获得满意的治疗效果，减少或避免不良反应的发生。本研究旨在建立一种简便、快速、灵敏、准确的离心超滤结合超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）用来测定替考拉宁游离浓度，为临床实现替考拉宁游离血药浓度监测提供依据。

1.   材料与方法

1.1   实验仪器

QTRAP 5500型三重四极杆/复合线性离子阱质谱仪（美国AB-SCIEX有限公司）；30AD型超高效液相色谱仪（日本岛津有限公司）；AL204型分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；H1850R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；Vortex-5型涡旋混合机（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；超纯水仪系统（默克密理博上海有限公司）；Centrifree^® 超过滤装置（截留分子量>30 000的物质）（默克密理博上海有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴器（上海精密试验设备有限公司）。

1.2   药品和试剂

替考拉宁对照品（中国食品药品检定研究院）；甲酸、醋酸铵（色谱纯，Dikma科技有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma-Aldrich公司）。

1.3   UPLC-MS/MS分析条件

1.3.1   UPLC分析条件

色谱柱：Endeavorsil^TM C₁₈柱 (50 mm×2.1 mm，1.8 µm)；流动相A：0.02 mol/L醋酸铵溶液（含0.1%甲酸），流动相B：乙腈，梯度洗脱信息见表1；柱温：35 ℃；进样量：5 µl。

表  1  梯度洗脱信息

时间（t/min）	流速（ml/min）	A（%）	B（%）
0.0	0.2	85	15
11.0	0.2	74	26
13.0	0.2	74	26
15.0	0.2	85	15
20.0	0.2	停止	停止

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1.3.2   MS检测条件离子源参数：

喷雾针电压（ISV）：5 500 V；碰撞气（CAD）：medium；气帘气（CUR）：20 psi；入口电压（EP）：10 V；去簇电压（DP）：78 V；碰撞能量（CE）：20.74 V；碰撞池出口电压（CXP）：13 V；离子源气体1（GS1）：55 psi；离子源气体2（GS2）：60 psi；离子源温度（TEM）：550 ℃。检测模式：电喷雾离子化（ESI），选择性离子检测（SIM），正离子。多离子反应监测模式（MRM）离子对：替考拉宁TA2-2 m/z 940.7→316.2。扫描时间：200 ms。

1.4   工作液的配制

精密称取替考拉宁对照品2.0 mg置于100 ml容量瓶中，用超纯水溶解并稀释至刻度，得到浓度为20.0 μg/ml的储备液。分别取不同体积的替考拉宁储备液，用超纯水稀释成浓度为0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、12.0、16.0 μg/ml的标准曲线工作液，以及0.50、3.00、12.0 μg/ml的质控工作液。

1.5   血浆样品的处理

取1 ml血浆样品置于Centrifree^®超滤装置（截留分子量>30 000的物质）中，在37 ℃水浴中平衡30 min，然后在37 ℃，1 500×g下离心30 min，取样品超滤液直接进样。

1.6   血浆超滤液样品的配制

分别取“1.4”项下各浓度标准曲线工作液以及质控工作液100 μl，加入100 μl空白血浆超滤液，稀释成浓度为0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 μg/ml的标准曲线血浆超滤液样品，以及浓度为0.25、1.50、6.00 μg/ml的质控点血浆超滤液样品。

2.   结果

2.1   专属性

取空白血浆超滤液，直接进样，得到色谱图A；空白血浆超滤液加替考拉宁对照品溶液配制成一定浓度（1.00 μg/ml），混合均匀后进样，得色谱图B；取使用替考拉宁的患者血浆，按“1.5”项下处理，进样后得色谱图C，考察方法的专属性。根据色谱图1中A、B、C，可以看出血浆中内源性物质没有干扰替考拉宁的检测，同时TA 2-2与TA 2-3完全分开，TA 2-2保留时间为11.57 min，可以准确定量TA 2-2。

图  1  替考拉宁色谱图

A.空白血浆超滤液；B.空白血浆超滤液 + 替考拉宁对照品；C.患者血浆超滤液 1.TA 2-2；2.TA 2-3

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2.2   线性关系考察

分别取“1.6”项下各浓度标准曲线血浆超滤液样品5 μl直接进样分析，以替考拉宁游离浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得线性回归方程为Y=51 708.90X+1 397.10（r=0.999，n=8），结果表明，替考拉宁游离浓度在0.10～8.00 μg/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系，定量下限为0.10 μg/ml。

2.3   精密度与准确度

按照“1.6”项下质控点血浆超滤液样品配制方法，配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品各6份，直接进样分析，计算批内精密度。按照相同的方法重复测定3次，计算批间精密度。结果见表2。如表2所示，在低、中、高浓度水平，样品的批内和批间RSD (%)均不超过7.00%，实测值与理论值相对误差在−5.00%～7.00%之间，精密度与准确度均符合生物样品测定要求。

表  2  批内和批间精密度与准确度(n=6，$ \bar x$±s)

理论浓度 （μg/ml）	实测浓度 （μg/ml）	准确度 （%）	精密度（%）
			批内	批间
0.25	0.25±0.02	1.56	6.91	6.77
1.50	1.43±0.05	−4.52	2.53	3.83
6.00	5.95±0.20	−0.88	2.99	3.44

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2.4   方法回收率

按照“1.6”项下质控点血浆超滤液样品配制方法，配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品各6份，直接进样分析，按线性回归方程计算实测浓度，以实测浓度与理论浓度的比值计算方法回收率。表3结果显示，低、中、高浓度水平的回收率在93.8%～101%范围内，总回收率为97.9%，同时RSD (%)也符合生物样品分析要求。

表  3  替考拉宁的方法回收率(n=6，$ \bar x$±s)

浓度水平 （μg/ml）	回收率 （%）	RSD (%)	总回收率 （%）	总RSD (%)
0.25	101±7.00	6.91	97.9	5.50
1.50	93.8±2.37	2.53
6.00	98.5±2.96	3.01

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2.5   基质效应

取来源不同的6个空白血浆样品，按照“1.6”项下质控点血浆超滤液样品配制方法，每个来源都分别配制成低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品（每个浓度3份），直接进样分析，得峰面积A₁。此外，用超纯水配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的替考拉宁对照品溶液（每个浓度3份），直接进样分析，得峰面积A₂。计算相应样品中替考拉宁的A₁/A₂值，即为基质因子（MF），考察基质效应。表4结果显示，低、中、高浓度水平所有样品的平均基质因子为0.97，接近1.00，且RSD (%)为2.12%，符合生物样品分析要求，说明基质效应不会影响分析方法的准确性。

表  4  替考拉宁在血浆超滤液中的基质效应(n=3，$ \bar x$±s)

浓度水平（μg/ml）	基质因子
	0.25	1.50	6.00
基质A	0.96±0.02	0.96±0.01	0.98±0.02
基质B	0.95±0.03	0.96±0.03	0.97±0.01
基质C	1.00±0.01	0.97±0.01	0.99±0.01
基质D	0.97±0.02	1.00±0.01	0.98±0.01
基质E	0.99±0.03	0.98±0.02	0.99±0.03
基质F	0.97±0.02	0.95±0.01	0.98±0.01
各浓度水平均值	0.97	0.97	0.98
各浓度水平RSD (%)	2.58	2.21	1.30
总均值	0.97
总RSD (%)	2.12

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2.6   稳定性考察

2.6.1   血浆超滤液样品在室温条件下的稳定性

配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品，每个浓度有6个重复样品，放置在室温10 h后与当日配制的标准曲线同批测定，考察替考拉宁血浆超滤液样品在室温下的稳定性。结果见表5，室温放置10 h后，样品实测浓度与理论浓度偏差在−4.00%～2.17%，RSD(%)不超过6.00%，在生物样品分析要求范围内，表明样品在室温下放置10 h后稳定性较好。

表  5  不同储存条件下替考拉宁样品的稳定性(n=6，$ \bar x$±s)

储存条件	理论浓度（μg/ml）	实测浓度（μg/ml）	RSD (%)	准确度（%）
室温10 h	0.25	0.24±0.01	5.52	−4.00
	1.50	1.48±0.03	2.16	−1.33
	6.00	6.13±0.12	2.09	2.17
−20 ℃ 15 d	0.25	0.22±0.01	4.76	−12.00
	1.50	1.46±0.02	1.98	−2.67
	6.00	5.79±0.13	2.23	−3.50
冻融3次	0.25	0.22±0.01	6.43	−12.00
	1.50	1.44±0.05	3.67	−4.00
	6.00	5.68±0.18	3.15	−5.33

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2.6.2   血浆超滤液样品长期冷冻保存的稳定性

配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品，每个浓度有6个重复的样品，在−20 ℃放置15 d后与测定当日配制的标准曲线同批进样分析，考察替考拉宁血浆样品−20 ℃下的稳定性。结果见表5，−20 ℃下储存15 d后，样品实测浓度与理论浓度偏差在−12.0%～−2.67%，RSD在5.00%以内，符合生物样品分析要求，表明样品在−20 ℃保存15 d后稳定性达标。

2.6.3   血浆超滤液样品的冻融稳定性

配制低、中、高浓度（0.25、1.50、6.00 μg/ml）的质控点血浆超滤液样品，每个浓度有6个重复的样品，放置在−20 ℃的冰箱内超过24 h，取出放置在室温条件下完全溶解后，再放置在−20 ℃的冰箱内，反复冻融3次，在第3次融化后与测定当日配制的标准曲线同批进样分析，以考察血浆样品3次冻融循环稳定性。结果见表5，反复冻融3次后，样品实测浓度与理论浓度偏差在−12.0%～−4.00%，RSD在6.50%以内，符合生物样品分析要求，表明样品冻融后稳定性仍较好。

3.   总结与讨论

近年来，血浆药物游离浓度的监测逐渐受到广泛关注。对于临床上提倡进行治疗药物监测，而蛋白结合率又高于80%的药物，建议监测药物游离浓度用以指导用药的剂量调整。对于高蛋白结合率的药物来说，白蛋白水平的改变可能会导致其药动学参数变异性增加^[12]。因此，对于低蛋白血症（Alb<25 g/L）^[8-10]、危重症、酸血症、肾衰竭、肝硬化、吸烟、多种药物合用等这类常伴有白蛋白水平降低的患者来说，替考拉宁的蛋白结合率具有一定的变异性^{[7, 13]}，即使获得相同的替考拉宁总浓度，体内真正发挥药效的游离替考拉宁浓度也可能不同。此时，应准确测定替考拉宁游离浓度来调整用药剂量，以防浓度低达不到治疗目标，或用药过量导致不良反应的发生。为实现对替考拉宁游离浓度的监测，本研究首次建立了超滤离心结合UPLC-MS/MS的方法。该方法与传统的高效液相色谱法相比，优点在于检测速度快，检测限较低，灵敏度较高，质谱检测可以排除患者所用的其他药物对替考拉宁的干扰，准确度较高。替考拉宁在水中易溶，在乙腈、甲醇中几乎不溶。因此，用超纯水作为储备液溶剂可使对照品完全溶解。替考拉宁成分复杂，为实现对各组分的有效分离，本研究选用Dikma公司的Endeavorsil^TM C₁₈柱，是通用型UPLC反相柱，具有独特的选择性和超高的分离性能，适合于高效、超快速分离分析，且峰形对称性好。在流动相选择的前期探索中，发现乙腈较甲醇可以更好地提高质谱响应，所以，选用乙腈作为有机相。水相则选择在0.02 mol/L醋酸铵溶液中加入0.1%甲酸，增加离子化效率，进一步改善峰形，使各组分完全分离。此外，采用电喷雾电离源(ESI)电离方式，发现替考拉宁在正离子模式下具有较高的离子化效率，且重现性良好。药物游离浓度的测定具有一定的难度，难点在于如何快速且有效地分离游离型药物，对血浆样品的处理有较高的要求。目前，测定药物游离浓度常见的样品处理方法主要有平衡透析法、超滤离心法^[14]。其中最常用的是超滤离心法，该法不需稀释，不会改变生理pH值、离子组成，主要是利用离心力使游离药物通过半透膜，迅速而有效地从血液及其他生物样本中分离游离药物^[15]。现国内外常用的超滤离心装置主要有Centrifree^®和Amicon Ultra两种型号。本研究选用Centrifree^®超滤装置进行分离。Roberts等在替考拉宁游离浓度测定的研究中，使用Amicon Ultra超滤装置分离蛋白^[10]。但是，在实验前期探索中，我们发现Amicon Ultra装置所得血浆超滤液中加入乙腈后仍有沉淀析出，蛋白截留不完全；而Centrifree^®装置产品说明书提示Centrifree^®装置可以截留99.9%的蛋白，且使用该装置所得血浆超滤液中加入等量乙腈后未见明显沉淀析出。虽然两者所用滤膜均是再生纤维素膜，但是相比Amicon Ultra的凹槽设计、Centrifree^®系列的平面设计，优点在于滤面更大，死体积更小，更有利于微溶质的滤过，是专用于从血液等生物样本中分离蛋白结合微溶质的，用于游离型药物的分离更为合理^[15]。其次，为保证游离药物可以和蛋白有效分离，应选择合适的滤膜孔径。由于替考拉宁主要与白蛋白结合，而白蛋白的分子量约为66 000，本研究选用截留分子量为30 000的滤膜用以截留与白蛋白结合的药物，获得游离型替考拉宁。此外，确定合适的样品处理条件也是至关重要的。首先，收集的血浆样品为保持稳定性，需要低温保存，但温度较低可能会影响药物与蛋白的结合，导致药物游离浓度偏低，为保证测定结果的准确性，样品需在37 ℃平衡30 min后再进行超滤离心^[10]。其次，离心力与离心时间也是影响超滤效果的重要因素^[16]。离心力（1 000～2 000）×g可以达到最佳滤过率，离心时间在15～30 min时超滤液量与离心时间成正比^[16]，再结合文献^[10]报道，本研究最终选用离心力1 500×g，离心时间30 min。同时，为保证样品测定尽可能不受基质的影响，本研究所有样品均采用空白血浆超滤液作为基质进行配制。有文献^[17]也指出，游离药物分析最适宜的基质为空白血浆超滤液。方法建立后按照《中国药典》（2015年版）附录《生物样品定量分析方法验证指导原则》进行验证，验证结果均符合该指导原则的要求。综上，本研究建立了离心超滤结合UPLC-MS/MS检测替考拉宁游离浓度的方法，该方法简便、快速、灵敏、准确，可以为临床开展替考拉宁游离浓度监测提供依据。