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河豚毒素处方前初步研究

徐己人 郑紫云 李园 鲁莹 储智勇

张群群, 钱芳, 徐玲玲, 张若曦, 年华. 海派膏方历史发展浅析[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(7): 408-410, 448. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106033
引用本文: 徐己人, 郑紫云, 李园, 鲁莹, 储智勇. 河豚毒素处方前初步研究[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(9): 544-546, 551. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202304024
ZHANG Qunqun, QIAN Fang, XU Lingling, ZHANG Ruoxi, NIAN Hua. The historical development of Shanghai herbal paste[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(7): 408-410, 448. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106033
Citation: XU Jiren, ZHENG Ziyun, LI Yuan, LU Ying, CHU Zhiyong. Preliminary pre-prescription study of Tetrodotoxin[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(9): 544-546, 551. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202304024

河豚毒素处方前初步研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202304024
详细信息
    作者简介:

    徐己人,本科生,Email:MikuMiyo@hotmail.com ,Tel:18121451808

    通讯作者: 储智勇,博士,研究方向:海洋药物,Email:zhiyongchu87@163.com
  • 中图分类号: R943

Preliminary pre-prescription study of Tetrodotoxin

  • 摘要:   目的   考察河豚毒素(TTX)在不同溶剂中的溶解性及稳定性,以及温度和pH值对稳定性的影响。  方法   配制TTX不同介质的溶液,采用高效液相色谱法(HPLC)测定其在不同温度、不同pH缓冲液中的浓度,分析计算其溶解度及稳定性。  结果   TTX在pH值为3.5时溶解度最大,随着pH值增加其溶解度逐渐降低。TTX在强碱条件下降解最为迅速,在70 ℃条件下、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中,20 min即完全降解。稳定性试验结果同样证明TTX在碱性条件下的稳定性最差,在37 ℃、pH值=7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,TTX浓度在1~10 h时开始持续降低,28天降解率为88.07±0.27%。  结论  TTX易溶于pH值=3.5的酸性水溶液,几乎不溶于碱性水溶液。其稳定性与温度、介质pH值密切相关,在酸性水溶液中较为稳定,在碱性条件下易降解,温度升高会加速其降解过程。
  • 自1843年11月17日开埠以来,上海以其“开放包容、经济发达、生活精致、文化繁荣”等独特的地域特征,渐渐形成了独特的海派文化特质,即“海纳百川、兼容并蓄、开放创新、追求卓越”,而海派中医则是海派文化的重要组成之一[1]。海派著名老中医善用膏方,逐渐形成了独具特色的“海派膏方”。海派膏方因人、因时、因地制宜,越来越迎合现代人治病、食补或保健的需求,“海派膏方热”迅速蔓延。海派膏方的应用虽得到广泛推广,且效果良好,但其历史渊源未见详细报道,故笔者查阅相关文献,结合实际,浅析海派膏方的历史渊源,梳理其各个阶段的发展情况,并进行总结归纳[2],以期更全面地了解与掌握海派膏方,为人们提供更优质的服务。

    上海,地处吴越中心地带,地理位置优越,处于长江的入海口,是典型的冲积平原,经济发达,物产丰富,交通也比较便捷,各种物质、信息、人员在此汇聚,逐渐形成了特有的“海派文化”。海派文化的独特之处在于,它不像中国其他地区一样只有一种文化,它既有江南地区传统的吴越文化,又包含了自从开埠以后汇入的西方各国文化;它不注重功名和官衔,而看重实际利益和个人的奋斗。正是这种“海纳百川、开放包容”的“海派文化”,给了许多优秀、有才华、勇于拼搏的知识分子包括中医师汇聚上海的动力,为他们提供了发展的舞台[3]。同时,四季分明的气候特点让上海人十分注意遵循时令的变化而采取不同的养生保健措施,与中医的“天人合一”理论相合。俗话说“冬令进补,夏天打虎”,这样的传统在上海更是根深蒂固,除一般食补以外,人们提出了更高的医疗保健需求。

    “海派文化”对近现代的中国社会产生了一定的影响,而“海派中医”则是组成海派文化的一个无可替代的部分[1]。“海派中医”是以“海派文化”为滋生土壤,以中西医学兼容并蓄的名医群体为代表,尤其是许多享誉海内外的名医群体,在一种独特的地域环境下形成的医学文化现象[4]。“海派中医”中包含了不同的行医风格、不同的医学门派以及不同的学术见解的各科医家流派,共同组成了“海纳百川、有容乃大”的海派中医流派[5]

    海派著名老中医一直重视膏方,逐渐形成了“海派膏方”。彼时北方膏方仍以巩固宿疾、治疗为主,并无对时令的要求。至清代后期,南北差异日益显著。在上海这种独特的经济、文化和地理气候影响下,形成了自身独特的“海派膏方”特点,即“补中寓治,治中寓补,补治结合”。海派中医在开具海派膏方时,较少使用攻伐作用强的猛药,例如芒硝、大黄等,而是用药比较温和,阿胶、龟板、熟地、人参等补阳、补阴、补血、补气等性情温和的补虚之品较为常见。海派中医在组方时会辨证分型治疗,使得海派膏方并不局限于补益这一种形式。此外,海派膏方还首次提出了“开路方”的思想,意思就是若患者本来其体内就有湿、痰、瘀等淫邪或者有一定程度上的脾胃消化不良,则在服用海派膏方前,先使用化湿健脾的药物,使得脾胃健运,防止“闭门留寇”。“开路方”同时也是对患者的身体进行一次试探性的调补,以此来观察其用药后的反应,为膏方正式调补提供“开路”基础[6]。最终逐渐形成了先用“开路方”祛邪扶正、健脾开胃,再给予膏方滋肾固精、益寿延年的治法[7]

    据文献报道,“海派中医”始于清末民初[4],所以本文从清代开始浅析海派膏方的发展轨迹。

    江南地区是膏方文化的发源地,而上海则为江南地区膏方的中心[8]。上海地区原属江苏,还未开埠时,中医师就已经有了开膏方的习惯。清代早期,沪上名医沈鲁珍(1658—1738年)开具的膏方是典型的素膏,其用法也与现在的膏方无差[9]。在其《沈氏医案》一书中,记载了多个与膏方有关的医案,例如崇明范锡凡案,范氏患痰火之哮喘,除豁痰降气清火之煎剂外,沈氏处以膏方,即以煎方去桑皮、甘草、莱菔子,加梨汁、莱菔汁、地栗汁、竹沥、姜汁,用饴糖四两,烊入收贮,燉热不时挑化[9]。又如孙采邻提出:“煎膏加蜜成规:凡药一两,煎膏三钱。每膏一两,加白蜜二钱,此成规也。”这基本上成为了清代膏方的统一制作标准。这个时期的冬令膏方无论是在遣方布药上,还是在胶类和收膏的方法使用上几乎与现在的膏方没有差别[7]

    在清中后期时,冬令膏方已见端倪,但却是在诸案中星星点点的散落出现,在流传的一些名医的膏方手稿中可见。这一时期的海派名医张氏内科第八代传人张玉书(1822−1867年)善于给患者开膏方,上海历史博物馆收藏了其留存的上百份膏方处方原件,其后人张骧云留存的膏方手稿收藏于上海中医药博物馆[6]

    在清代晚期,膏方走向民间,冬令膏方开始在江浙一带兴盛起来,这个时期的膏方很大一部分都是在冬季服用,其中夹杂的一些传统膏方的应用已较少,而且胶类、糖类等的使用方法也与现代相似[10]

    此时期的“孟河四大家”之一,海派名医丁甘仁(1865−1926年)在其撰写的《丁甘仁医案·膏方》中出现了“膏方”专章[10]

    民国时期(1912−1949年左右),膏方发展已经比较成熟,而且在人民群众中拥有了良好的根基,成为了人们治病养生的首选[10],尤其是冬令膏方,成为一种冬令进补膏方的潮流。这个时期的北京同仁堂、上海雷允上等很多老字号的中药堂店推出了自制的成品膏方,例如葆春膏、八仙民寿膏等,发展前景十分广阔[2]

    民国时期,沪上名医大家秦伯未(1901−1969年)撰写了《膏方大全》和《谦斋膏方案》,这两本书被看作是最早的膏方方面的专著,为膏方的未来发展奠定了理论基础以及临床应用规范[9]。其中,《膏方大全》对膏方的发展的贡献尤为巨大,总结为以下三点:第一,对膏方的名称下了定义。“膏方者,盖煎熬药汁成脂液而所以营养五脏六腑之枯燥虚弱者也,故俗亦称膏滋药”。第二,明确了膏方的性质和用途。“润泽、滋补”是膏方的主要性质,“膏方并非单纯之补剂,乃包含救偏却病之义”。第三,创立了膏方施治的法则。“须视各个之体质而施以平补、温补、清补、涩补;亦须视各个之病根,而施以生津、益气、固精、养血”[11]。即:膏方在选药时要辩不同的体质、不同的病因而不同施治。膏方是以治疗疾病为主,不能把膏方看作是唯一进补之品而盲目进补[12]。这本书已经成为了中医师开膏方的准绳,更是一些年轻的中医师们学习、借鉴膏方的书籍首选[10],甚至现代膏方的药材选配、制作方法等也以该书中的内容为规范[2]。而《谦斋膏方案》则是记载了其本人运用膏方的临证验案[2]

    此外,民国时期还有很多其他海派中医,如李平书、张骧云、夏应堂、余伯陶、张山雷等[13]亦为海派膏方的发展起到了推动作用。

    近现代时期海派膏方进入了迅猛发展阶段。在大量使用海派膏方的同时,冬令膏方的理论体系也初步建立。上海名医既继承了以前的膏方传统,又结合理论和实践做了进一步的探索和研究,使得膏方上了一个新台阶。

    1984年,上海中医药大学附属龙华医院首次开设膏方门诊,并且形成了一套规范、全面的炮制流程和标准[2]。随后,江苏、浙江等地模仿上海地区也陆续开设了膏方门诊。一些中药名店也开始推广膏方的应用,例如上海雷允上、杭州胡庆余堂、北京同仁堂等。伴随着膏方门诊数量的增加以及膏方专著的面世,膏方的发展越来越受到医学界的关注和重视,也越来越体现了膏方的临床应用价值[14]

    这个时期对膏方的发展起了重要作用的海派中医有:祝味菊、黄文东、蔡香荪、陈道隆、程门雪、严苍山等名家,并且有膏方医案流传[9]

    进入新世纪,海派膏方的发展也进入了新的阶段。上海掀起了一股“海派膏方热”,老百姓们趋之若鹜,尤其是冬令时节,各个中医医院的膏方门诊都排起了长队。数量上的大幅增长催生出了膏方的工业化大生产,逐渐取代了作坊式的膏方生产[9],这一点从海派膏方的包装上可以看出:所用瓷罐越来越漂亮、精美,而且出现了由包装机器生产的真空袋装膏方,既定量,又密封,服用、携带也方便。伴随着一系列生产管理、经营规范的出台,膏方的发展一直保持在健康向上的轨道上,同时,膏方的生产制作方面也上升了新台阶,例如在卫生条件、质量控制等方面[9]。高效液相色谱法、气相色谱法及薄层色谱法等是在膏方质量控制中运用最多的检测手段,而高效液相色谱法是其中的重要检测方法[15]

    最早采用海派膏方制备传统工艺制作的医疗机构——上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,独立制作加工古法炮制海派膏方,是目前上海地区唯一一家具备自制膏方能力的医院。其在传统中医膏方熬制技艺的基础上,形成了独一无二的“海派中医膏方熬制技艺”——主要包括审方、配方、煎熬前期准备、中药饮片的煎煮、中药药汁的浓缩、收膏、装膏、凉膏、成膏,每个步骤均有特定的规程。最终制备而成的“岳阳膏方”可以达到“其黑如漆,其亮如镜,入口即化”的最优质量。海派中医膏方熬制技艺的主要传承人是郭庆标、鲍忠华、徐玲玲、年华等。其中,徐玲玲作为海派中医膏方熬制技艺的领军人物,在膏方的制备中继承了海派中医膏方熬制技艺学说,并在制膏中广泛应用“海派中医膏方熬制技艺”得到了较好的继承与发展,推动了海派膏方的传播与发扬。

    师从张氏第十二代传人张伯讷及七代中医世家刘树农教授的朱抗美,是上海中医药大学附属曙光医院教授,她对海派膏方的贡献可谓是开创性的,从海派膏方的最初发掘、整理,到后续的推广、应用等方面都有她忙碌的身影。

    此外,上海目前有15项海派中医流派传承研究基地建设项目,包括丁氏内科、顾氏外科、石氏伤科、陆氏针灸、徐氏儿科、张氏内科、颜氏内科、朱氏妇科、蔡氏妇科、魏氏伤科、丁氏推拿、夏氏外科、董氏儿科、杨氏针灸和恽氏中西医汇通[16]。这些项目将会持续推动海派中医流派的传承,大力促进海派中医流派特色的发扬,同时也为海派膏方的传承与发展做了基础铺垫。

    海派膏方文化的影响力越来越大,其衍生的相关文化产物也越来越普及,例如膏方节、开炉仪式等活动[6],而“海派膏方”也越来越被推崇为“膏方之首”。

      综上所述,海派膏方从清代到民国再到当代,逐渐走向兴盛[10]。时至今日,服用膏方不仅仅是治病,人们对其提出了更高的医疗保健需求,而海派膏方正好满足了这一需求。2009年,上海全市开出了大约15万料膏方,此后,该数字保持每年10%以上的增长速度,膏方热成为了一种流行趋势。自上世纪80年代中期起,上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院恢复开展由中医专家主持的膏方门诊,并设立专用场地,以传统工艺自制加工膏方。每年都有许多专程上门请中医专家把脉、定制服用“岳阳膏方”者,在上海、浙江、江苏、北京和港澳台地区都能看到“岳阳膏方”的“身影”,岳阳医院已成为中医膏方研究和应用的主要基地之一。岳阳医院的“海派中医膏方熬制技艺”已经获得了上海市虹口区非物质文化遗产的批准,同时“岳阳膏方”的研究基地也成为了长三角膏方联盟的副会长单位。目前,全国各地的膏方都有海派膏方的痕迹。在当前广阔的市场和发展前景下,海派膏方的未来发展既有“大显身手”的机遇,也有“披荆斩棘”的挑战,我们要在保持传统中医传承与根本的基础上,推陈出新,使海派膏方的海派中医特色更“传统”,借助现代科技手段的发展更“新颖”,向着更加有利于现代膏方的可持续方向发展,像熠熠生辉的太阳源源不断绽放新光芒。

  • 图  1  河豚毒素结构式

    图  2  TTX对照溶液(A)与供试品溶液(B)的典型色谱图

    图  3  TTX在不同温度、不同介质中的稳定性(A. 4 ℃条件下TTX浓度变化趋势;B. 25 ℃条件下TTX浓度变化趋势;C. 37 ℃条件下TTX浓度变化趋势)

    表  1  TTX在不同pH值水溶液中的溶解度

    pH值 3.5 4.5 5.0 6.5 7.0 7.4 8.0
    $ \bar{\rm{x}} $(mg/ml) 264.63 31.35 4.64 1.02 0.47 0.21 0.05
    SD(mg/ml) 5.54 0.75 0.08 0.046 0.015 0.002 7 0.001
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  • [1] 方国锋, 王锡昌, 陶宁萍, 等. 河豚毒素的样品前处理与快速检测技术研究进展[J]. 分析测试学报, 2014, 33(12): 1447-1452. doi:  10.3969/j.issn.1004-4957.2014.12.021
    [2] BANE V, LEHANE M, DIKSHIT M, et al. Tetrodotoxin: chemistry, toxicity, source, distribution and detection[J]. Toxins, 2014, 6(2): 693-755. doi:  10.3390/toxins6020693
    [3] SAOUDI M, ABDELMOULEH A, EL FEKI A. Tetrodotoxin: a potent marine toxin[J]. Toxin Rev, 2010, 29(2): 60-70. doi:  10.3109/15569543.2010.487631
    [4] NOGUCHI T. Tetrodotoxin - distribution and accumulation in aquatic organisms, and cases of human intoxication[J]. Mar Drugs, 2008, 6(2): 220-242. doi:  10.3390/md6020220
    [5] 张梦倩, 储智勇, 钱晓明等. 河鲀毒素——一种具有缓解癌性疼痛潜力的药物[J]. 生物化学与生物物理进展, 2023, 50(7): 1-15.
    [6] SHI J, LIU T T, WANG X, et al. Tetrodotoxin reduces cue-induced drug craving and anxiety in abstinent heroin addicts[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2009, 92(4): 603-607. doi:  10.1016/j.pbb.2009.02.013
    [7] 王兴龙, 蔡强, 桂文锋, 等. 河鲀毒素及其检测技术研究进展[J]. 水产科学, 2020, 39(3): 447-457.
    [8] KATIKOU P, GOKBULUT C, KOSKER A R, et al. An updated review of tetrodotoxin and its peculiarities[J]. Mar Drugs, 2022, 20(1): 47. doi:  10.3390/md20010047
    [9] 张金艳, 姜雯鹏, 谭欣, 等. 基于AuPtRh纳米酶的比色适体传感器快速检测河豚毒素[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(22): 7183-7190.
    [10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2020年版. 四部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020, 424-425.
    [11] GOLDLUST S A, KAVOOSI M, NEZZER J, et al. Tetrodotoxin for chemotherapy-induced neuropathic pain: a randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-dose finding trial[J]. Toxins, 2021, 13(4): 235. doi:  10.3390/toxins13040235
    [12] CAMPOS-RÍOS A, RUEDA-RUZAFA L, HERRERA-PÉREZ S, et al. Tetrodotoxin: a new strategy to treat visceral pain?[J]. Toxins, 2021, 13(7): 496. doi:  10.3390/toxins13070496
    [13] BUCCIARELLI G M, LECHNER M, FONTES A, et al. From poison to promise: the evolution of tetrodotoxin and its potential as a therapeutic[J]. Toxins, 2021, 13(8): 517. doi:  10.3390/toxins13080517
  • [1] 张强, 李静, 刘越, 储晓琴.  基于网络药理学与分子对接技术研究制痂酊治疗Ⅱ度烧伤的作用机制 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-7. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202307014
    [2] 余小翠, 王习文, 张贵英, 徐君伟, 祝雨薇, 胡丹.  麝香接骨胶囊的HPLC特征图谱的研究及7种成分含量测定 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202307059
    [3] 高锦, 胡丹, 王习文, 余小翠, 王泽欣, 刘晶, 祝雨薇, 马紫辉, 徐君伟, 高青, 洪小栩.  滴眼液中抑菌剂硫柳汞的HPLC含量测定方法研究 . 药学实践与服务, 2025, 43(): 1-5. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202404059
    [4] 毛智毅, 王筱燕, 陈晓颖, 汤逸斐.  度拉糖肽联合二甲双胍对肥胖型2型糖尿病患者机体代谢、体脂成分及血清脂肪因子的影响 . 药学实践与服务, 2024, 42(7): 305-309. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305032
    [5] 陈方剑, 骆锦前, 王志君, 胡叶帅, 孙煜昕, 宋洪杰.  HPLC-MS/MS同时测定感冒安颗粒中5种黄酮成分的含量 . 药学实践与服务, 2024, 42(9): 402-406. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202403030
    [6] 毛泽玲, 文波.  大黄的HPLC指纹图谱及禁用农药的残留研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(7): 297-304, 314. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202310057
    [7] 李丹, 戴贤春, 王芳珍, 陈奕含, 杨萍, 刘继勇.  HPLC-MS/MS测定当归六黄汤中4种不同成分的含量 . 药学实践与服务, 2024, 42(6): 248-252, 266. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202305007
    [8] 张艺昕, 关欣怡, 王博宁, 闻俊, 洪战英.  二氢吡啶类钙离子拮抗药物手性分析及其立体选择性药动学研究进展 . 药学实践与服务, 2024, 42(8): 319-324. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202308062
    [9] 赖立勇, 夏天爽, 徐圣焱, 蒋益萍, 岳小强, 辛海量.  中药青蒿抗氧化活性的谱效关系研究 . 药学实践与服务, 2024, 42(5): 203-210, 216. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202211012
  • 期刊类型引用(1)

    1. 何金英,张永萍,曹国琼,刘耀,徐剑. 丹参“水—脂”二元组分凝胶的皮肤药动学研究. 环球中医药. 2022(07): 1133-1138 . 百度学术

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出版历程
  • 收稿日期:  2023-04-14
  • 修回日期:  2023-08-14
  • 网络出版日期:  2023-09-25
  • 刊出日期:  2023-09-25

河豚毒素处方前初步研究

doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202304024
    作者简介:

    徐己人,本科生,Email:MikuMiyo@hotmail.com ,Tel:18121451808

    通讯作者: 储智勇,博士,研究方向:海洋药物,Email:zhiyongchu87@163.com
  • 中图分类号: R943

摘要:   目的   考察河豚毒素(TTX)在不同溶剂中的溶解性及稳定性,以及温度和pH值对稳定性的影响。  方法   配制TTX不同介质的溶液,采用高效液相色谱法(HPLC)测定其在不同温度、不同pH缓冲液中的浓度,分析计算其溶解度及稳定性。  结果   TTX在pH值为3.5时溶解度最大,随着pH值增加其溶解度逐渐降低。TTX在强碱条件下降解最为迅速,在70 ℃条件下、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中,20 min即完全降解。稳定性试验结果同样证明TTX在碱性条件下的稳定性最差,在37 ℃、pH值=7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,TTX浓度在1~10 h时开始持续降低,28天降解率为88.07±0.27%。  结论  TTX易溶于pH值=3.5的酸性水溶液,几乎不溶于碱性水溶液。其稳定性与温度、介质pH值密切相关,在酸性水溶液中较为稳定,在碱性条件下易降解,温度升高会加速其降解过程。

English Abstract

张群群, 钱芳, 徐玲玲, 张若曦, 年华. 海派膏方历史发展浅析[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(7): 408-410, 448. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106033
引用本文: 徐己人, 郑紫云, 李园, 鲁莹, 储智勇. 河豚毒素处方前初步研究[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(9): 544-546, 551. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202304024
ZHANG Qunqun, QIAN Fang, XU Lingling, ZHANG Ruoxi, NIAN Hua. The historical development of Shanghai herbal paste[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(7): 408-410, 448. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202106033
Citation: XU Jiren, ZHENG Ziyun, LI Yuan, LU Ying, CHU Zhiyong. Preliminary pre-prescription study of Tetrodotoxin[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2023, 41(9): 544-546, 551. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202304024
  • 河豚毒素(TTX)属于氨基全氢化喹唑啉化合物,分子式为C11H17O8N3,分子量为319。其分子结构类似于生物碱[1],呈独特的笼形,如图1。河豚毒素粗品为黄褐色粉末,纯品为白色晶体,呈弱碱性,容易潮解,微溶于水溶液,易溶于无机酸水溶液,且在弱酸条件下稳定;对于热不敏感,但在高温下毒性会增强,强酸强碱条件下其结构可被破坏[2]

    图  1  河豚毒素结构式

    河豚毒素是一种高效的神经类毒素,由于能够特异性的阻断Na+离子通道,进而产生麻痹作用,因此低浓度的河豚毒素被认为是一种优良的神经类候选药物,一直受到科研人员尤其是新药研发人员的关注[3]。目前已有将河豚毒素作为止痛药[4-5]和成瘾戒断药[6]的相关探索和研究。由于河豚毒素在药学领域有着广阔前景,关于其药学应用的研究报道逐年增多,但大多集中在分析方法[7]、药理机制[8]或药物载体研究[9],对其可成药性的相关研究报道较少。本文按照新药研发要求,建立高效液相反相离子对色谱法,对河豚毒素在不同溶剂中的溶解性和不同pH环境中的稳定性进行考察,为河豚毒素的处方前研究积累数据,为其进一步临床应用提供有力支撑。

    • LC-2030C高效液相色谱仪(日本岛津制作所);AL-104电子天平(METTLER TOLEDO,瑞士);数显pH计(sartorius,德国);紫外可见分光光度计(安捷伦科技(中国)有限公司);循环水式真空泵(上海豫康科教仪器设备有限公司);SECURA125-1CN型十万分之一电子天平(赛多利斯,德国);Arium@ mini 超纯水机(赛多利斯,德国)。

    • 河豚毒素原料药(中洋生物科技江苏有限公司,批号:20220089,含量88%);河豚毒素对照品(泰州康特生物工程有限公司,批号:201206,含量≥99%);磷酸、98%甲酸、柠檬酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠、庚烷磺酸钠、磷酸二氢铵、乙酸铵、盐酸、30% H2O2和冰醋酸均为分析纯试剂(国药集团化学试剂有限公司)。

    • 色谱柱为Shim-pack GISI C18-AQ(4.6×250 mm,5 μm);流动相为5 mmol/L庚烷磺酸钠-25 mmol/L磷酸二氢铵,等度洗脱;进样量为10 μl;柱温:25 ℃;流速1 ml/min;检测波长为196 nm;检测时长为40 min。

    • 取TTX对照品适量,精密称定,用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的TTX对照品储备液。

    • 取TTX原料药适量,精密称定,用0.1%磷酸溶液溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的供试品储备液。

    • 按照《中国药典》(2020版)四部通则8004缓冲液配制方法,配制pH值分别为3.5、4.5、5.0、6.5、7.0、7.4、8.0的缓冲液[10]。称取研成细粉的TTX原料药各2 mg,分别置于4 ml不同pH值的缓冲液(25±2 ℃)中,30 min内每隔5 min强力振摇30 s,观察溶解情况,如无目视可见颗粒,视为完全溶解。如完全溶解则继续加入研成细粉的TTX原料药,同法操作直至饱和,取适量经滤膜滤过,作为溶解度试验测试溶液。

    • 取研成细粉的TTX原料药约1 mg,置于10 ml容量瓶中,分别用0.1 mol/L盐酸和0.1 mol/L氢氧化钠溶液溶解并定容,置于70 ℃下反应20 min。精密量取各反应溶液适量,冷却至室温,分别加入对应体积的0.1 mol/L氢氧化钠或0.1 mol/L盐酸进行中和并终止反应。取适量样品经滤膜过滤后作为强酸与强碱破坏试验测试溶液。

    • 取研成细粉的TTX原料药约1 mg,置于10 ml容量瓶中,加入30% H2O2溶液溶解定容后,室温反应10 min。精密量取反应溶液适量,经滤膜过滤,作为氧化破坏试验测试溶液。

    • 取研成细粉的TTX各适量,精密称定,分别用PBS缓冲液(pH值=7.4)、0.1%甲酸溶液、0.1%柠檬酸溶液溶解,并稀释制成浓度为0.1 mg/ml的TTX溶液,然后分别置于4 ℃、25 ℃、37 ℃中储存,在第1、2、3、5、7、14、21、28 d各取适量经滤膜过滤,作为温度适应性测试溶液。

    • 分别将对照品储备液及供试品储备液用0.1%磷酸溶液稀释至0.1 mg/ml,作为对照品溶液和供试品溶液,按“2.1”项进行测试。如图2所示,TTX的保留时间为22.665 min。理论板数为14 501,供试品溶液中主峰与邻峰的分离度为6.4。结果表明,此色谱条件可以满足TTX相关测试要求。

      图  2  TTX对照溶液(A)与供试品溶液(B)的典型色谱图

    • 取对照品储备液,用0.1%磷酸溶液配制浓度为4、10、20、40、80 μg/ml的TTX对照品测试溶液,按“2.1”项进行测试。以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得回归方程为Y=12 601.2X–2 263.69(r=0.999 9)。结果表明,TTX的浓度与峰面积在测试范围内呈良好线性关系。

    • 取对照品储备液,用0.1%磷酸溶液分别稀释至10、20、40 μg/ml的溶液各3份,按“2.1”项进行测试,计算其含量的平均值为101.000%,RSD为0.60%,表明该方法准确度良好,满足测试要求。

    • 取供试品溶液,按“2.1”项重复测试6次,计算得到的RSD为0.17%,表明该方法重复性良好。室温分别放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后按“2.1”进行测试。计算得到的RSD为1.48%,表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

    • 表1结果可看出,TTX几乎不溶于碱性水溶液,但溶解度随着pH值降低而逐渐增大,易溶于pH值为3.5的酸性水溶液。

      表 1  TTX在不同pH值水溶液中的溶解度

      pH值 3.5 4.5 5.0 6.5 7.0 7.4 8.0
      $ \bar{\rm{x}} $(mg/ml) 264.63 31.35 4.64 1.02 0.47 0.21 0.05
      SD(mg/ml) 5.54 0.75 0.08 0.046 0.015 0.002 7 0.001
    • 实验结果表明,强碱对TTX的破坏能力最强,在0.1mol/L氢氧化钠溶液中、70 ℃条件下反应20 min后,TTX被完全降解。强酸对TTX的破坏能力次之,TTX在70 ℃、0.1mol/L HCl溶液中反应20 min后的降解率为60.78%;氧化对TTX的破坏能力相对最弱,在30% H2O2溶液中反应20 min后的降解率为17.06%。

    • 不同介质、不同温度条件下TTX稳定性试验结果见图3。当溶剂为pH值=7.4的PBS溶液时,不同温度下TTX均表现出降解趋势,在25 ℃与37 ℃条件下保存28 d的TTX溶液降解率均超过50%,在37 ℃时PBS溶液中的TTX降解率更高达88.07±0.27%,提示在后续剂型研究中,需注意TTX在体外释放液中的稳定性。以0.1%甲酸溶液或0.1%柠檬酸溶液为溶剂的TTX溶液则较为稳定,在25 ℃和37 ℃下保存28 d含量均未表现出显著性变化。

      图  3  TTX在不同温度、不同介质中的稳定性(A. 4 ℃条件下TTX浓度变化趋势;B. 25 ℃条件下TTX浓度变化趋势;C. 37 ℃条件下TTX浓度变化趋势)

    • TTX作为一种具有广泛应用前景的潜在镇痛药物,其在药理和作用机制方面的相关研究已有较多报道[11-13],但对于其理化性质和成药性研究的报道极少。本研究建立了高效液相反相离子对色谱法,测定TTX在不同溶剂中的溶解性,并考察温度、溶剂pH值和氧化剂对其稳定性的影响。实验结果表明TTX在酸性条件下具有较高的溶解度,前期试验还表明TTX不溶于乙醇,二氯甲烷等有机溶剂。稳定性试验结果显示TTX在强碱溶液中较不稳定,实验条件下20 min即被强碱全部降解,而在酸性条件、氧化环境中较为稳定。不同温度稳定性试验结果同样显示,TTX在0.1%甲酸或柠檬酸溶液中4周内稳定性均良好;而在pH值=7.4 PBS中降解较为迅速,即使在4 ℃条件下,pH值=7.4 PBS中28 d的降解率仍然接近50%,37 ℃条件下28 d降解率接近90%。研究结果可为TTX处方设计及制备工艺提供实验依据,并提示研究者在开展TTX剂型研究和体外释放研究时应重点关注其稳定性和降解情况。

参考文献 (13)

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