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河豚毒素(TTX)属于氨基全氢化喹唑啉化合物,分子式为C11H17O8N3,分子量为319。其分子结构类似于生物碱[1],呈独特的笼形,如图1。河豚毒素粗品为黄褐色粉末,纯品为白色晶体,呈弱碱性,容易潮解,微溶于水溶液,易溶于无机酸水溶液,且在弱酸条件下稳定;对于热不敏感,但在高温下毒性会增强,强酸强碱条件下其结构可被破坏[2]。
河豚毒素是一种高效的神经类毒素,由于能够特异性的阻断Na+离子通道,进而产生麻痹作用,因此低浓度的河豚毒素被认为是一种优良的神经类候选药物,一直受到科研人员尤其是新药研发人员的关注[3]。目前已有将河豚毒素作为止痛药[4-5]和成瘾戒断药[6]的相关探索和研究。由于河豚毒素在药学领域有着广阔前景,关于其药学应用的研究报道逐年增多,但大多集中在分析方法[7]、药理机制[8]或药物载体研究[9],对其可成药性的相关研究报道较少。本文按照新药研发要求,建立高效液相反相离子对色谱法,对河豚毒素在不同溶剂中的溶解性和不同pH环境中的稳定性进行考察,为河豚毒素的处方前研究积累数据,为其进一步临床应用提供有力支撑。
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分别将对照品储备液及供试品储备液用0.1%磷酸溶液稀释至0.1 mg/ml,作为对照品溶液和供试品溶液,按“2.1”项进行测试。如图2所示,TTX的保留时间为22.665 min。理论板数为14 501,供试品溶液中主峰与邻峰的分离度为6.4。结果表明,此色谱条件可以满足TTX相关测试要求。
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取对照品储备液,用0.1%磷酸溶液配制浓度为4、10、20、40、80 μg/ml的TTX对照品测试溶液,按“2.1”项进行测试。以浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得回归方程为Y=12 601.2X–2 263.69(r=0.999 9)。结果表明,TTX的浓度与峰面积在测试范围内呈良好线性关系。
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取对照品储备液,用0.1%磷酸溶液分别稀释至10、20、40 μg/ml的溶液各3份,按“2.1”项进行测试,计算其含量的平均值为101.000%,RSD为0.60%,表明该方法准确度良好,满足测试要求。
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取供试品溶液,按“2.1”项重复测试6次,计算得到的RSD为0.17%,表明该方法重复性良好。室温分别放置0、2、4、6、8、10、12、24、48 h后按“2.1”进行测试。计算得到的RSD为1.48%,表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
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由表1结果可看出,TTX几乎不溶于碱性水溶液,但溶解度随着pH值降低而逐渐增大,易溶于pH值为3.5的酸性水溶液。
表 1 TTX在不同pH值水溶液中的溶解度
pH值 3.5 4.5 5.0 6.5 7.0 7.4 8.0 $ \bar{\rm{x}} $(mg/ml) 264.63 31.35 4.64 1.02 0.47 0.21 0.05 SD(mg/ml) 5.54 0.75 0.08 0.046 0.015 0.002 7 0.001 -
实验结果表明,强碱对TTX的破坏能力最强,在0.1mol/L氢氧化钠溶液中、70 ℃条件下反应20 min后,TTX被完全降解。强酸对TTX的破坏能力次之,TTX在70 ℃、0.1mol/L HCl溶液中反应20 min后的降解率为60.78%;氧化对TTX的破坏能力相对最弱,在30% H2O2溶液中反应20 min后的降解率为17.06%。
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不同介质、不同温度条件下TTX稳定性试验结果见图3。当溶剂为pH值=7.4的PBS溶液时,不同温度下TTX均表现出降解趋势,在25 ℃与37 ℃条件下保存28 d的TTX溶液降解率均超过50%,在37 ℃时PBS溶液中的TTX降解率更高达88.07±0.27%,提示在后续剂型研究中,需注意TTX在体外释放液中的稳定性。以0.1%甲酸溶液或0.1%柠檬酸溶液为溶剂的TTX溶液则较为稳定,在25 ℃和37 ℃下保存28 d含量均未表现出显著性变化。
Preliminary pre-prescription study of Tetrodotoxin
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摘要:
目的 考察河豚毒素(TTX)在不同溶剂中的溶解性及稳定性,以及温度和pH值对稳定性的影响。 方法 配制TTX不同介质的溶液,采用高效液相色谱法(HPLC)测定其在不同温度、不同pH缓冲液中的浓度,分析计算其溶解度及稳定性。 结果 TTX在pH值为3.5时溶解度最大,随着pH值增加其溶解度逐渐降低。TTX在强碱条件下降解最为迅速,在70 ℃条件下、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液中,20 min即完全降解。稳定性试验结果同样证明TTX在碱性条件下的稳定性最差,在37 ℃、pH值=7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中,TTX浓度在1~10 h时开始持续降低,28天降解率为88.07±0.27%。 结论 TTX易溶于pH值=3.5的酸性水溶液,几乎不溶于碱性水溶液。其稳定性与温度、介质pH值密切相关,在酸性水溶液中较为稳定,在碱性条件下易降解,温度升高会加速其降解过程。 Abstract:Objective To investigate the solubility and stability of Tetrodotoxin (TTX) in different solvents, and the effect of temperature and pH on its stability. Method Solutions of TTX in different matrices were prepared. Their concentrations at different temperatures and pH buffers were determined by high performance liquid chromatography and their solubility and stability were analyzed and calculated. Result TTX was most soluble at pH 3.5 and its solubility decreased as the pH increased. TTX degraded most rapidly under strong alkali conditions, with complete degradation after 20 min of reaction at 0.1 mol/L sodium hydroxide and 70 ℃. The stability test results similarly demonstrated that TTX was least stable under alkaline conditions. In a PBS buffered solution at 37 ℃, pH 7.4, TTX concentration began to decrease consistently at 1~10h, with a degradation rate of 88.07±0.27% after 28 days. Conclusion TTX is readily soluble in acidic aqueous solutions at pH 3.5 and almost insoluble in alkaline aqueous solutions. Its stability is closely related to the temperature and pH of the medium. It is more stable in acidic aqueous solutions and easily degrades under alkaline conditions, and its degradation process could be accelerated by increasing temperature. -
Key words:
- Tetrodotoxin /
- HPLC /
- Stability /
- Solubility
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表 1 TTX在不同pH值水溶液中的溶解度
pH值 3.5 4.5 5.0 6.5 7.0 7.4 8.0 $ \bar{\rm{x}} $ (mg/ml)264.63 31.35 4.64 1.02 0.47 0.21 0.05 SD(mg/ml) 5.54 0.75 0.08 0.046 0.015 0.002 7 0.001 -
[1] 方国锋, 王锡昌, 陶宁萍, 等. 河豚毒素的样品前处理与快速检测技术研究进展[J]. 分析测试学报, 2014, 33(12): 1447-1452. doi: 10.3969/j.issn.1004-4957.2014.12.021 [2] BANE V, LEHANE M, DIKSHIT M, et al. Tetrodotoxin: chemistry, toxicity, source, distribution and detection[J]. Toxins, 2014, 6(2): 693-755. doi: 10.3390/toxins6020693 [3] SAOUDI M, ABDELMOULEH A, EL FEKI A. Tetrodotoxin: a potent marine toxin[J]. Toxin Rev, 2010, 29(2): 60-70. doi: 10.3109/15569543.2010.487631 [4] NOGUCHI T. Tetrodotoxin - distribution and accumulation in aquatic organisms, and cases of human intoxication[J]. Mar Drugs, 2008, 6(2): 220-242. doi: 10.3390/md6020220 [5] 张梦倩, 储智勇, 钱晓明等. 河鲀毒素——一种具有缓解癌性疼痛潜力的药物[J]. 生物化学与生物物理进展, 2023, 50(7): 1-15. [6] SHI J, LIU T T, WANG X, et al. Tetrodotoxin reduces cue-induced drug craving and anxiety in abstinent heroin addicts[J]. Pharmacol Biochem Behav, 2009, 92(4): 603-607. doi: 10.1016/j.pbb.2009.02.013 [7] 王兴龙, 蔡强, 桂文锋, 等. 河鲀毒素及其检测技术研究进展[J]. 水产科学, 2020, 39(3): 447-457. [8] KATIKOU P, GOKBULUT C, KOSKER A R, et al. An updated review of tetrodotoxin and its peculiarities[J]. Mar Drugs, 2022, 20(1): 47. doi: 10.3390/md20010047 [9] 张金艳, 姜雯鹏, 谭欣, 等. 基于AuPtRh纳米酶的比色适体传感器快速检测河豚毒素[J]. 食品安全质量检测学报, 2022, 13(22): 7183-7190. [10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2020年版. 四部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020, 424-425. [11] GOLDLUST S A, KAVOOSI M, NEZZER J, et al. Tetrodotoxin for chemotherapy-induced neuropathic pain: a randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-dose finding trial[J]. Toxins, 2021, 13(4): 235. doi: 10.3390/toxins13040235 [12] CAMPOS-RÍOS A, RUEDA-RUZAFA L, HERRERA-PÉREZ S, et al. Tetrodotoxin: a new strategy to treat visceral pain?[J]. Toxins, 2021, 13(7): 496. doi: 10.3390/toxins13070496 [13] BUCCIARELLI G M, LECHNER M, FONTES A, et al. From poison to promise: the evolution of tetrodotoxin and its potential as a therapeutic[J]. Toxins, 2021, 13(8): 517. doi: 10.3390/toxins13080517