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根据毒理学研究的国际标准[12-13],设计制定Ames试验以检测受试药物HMS-01的遗传毒性。Ames试验亦称细菌回复突变实验,是利用伤寒沙门氏菌具有回复突变的特性,以鉴定受试物是否具有致突变性的一种试验方法。his−鼠伤寒沙门氏菌,因不能自主合成组氨酸而不能在缺乏组氨酸的培养基上生长,但在外界致突变因素的作用下可突变为能自主合成组氨酸的原养型沙门氏菌,从而能在无组氨酸的培养基上正常生长。因此,可通过观测其经受试物作用后,在无组氨酸培养基上的菌落生长情况来判定受试物是否具有致突变毒性。
试验结果要求应满足以下条件:①阴性对照组的回复突变菌落均数在历史阴性/溶媒对照范围内;②阳性对照组的回复突变菌落均数为其对应的阴性对照组的3倍以上;③污染平皿数不超过平皿总数的5%。
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5种试验菌(TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535)应具备表1所示的特性,因此于实验前进行如下生物学特性鉴定 : his−鉴定、脂多糖屏障缺陷(rfa突变)鉴定、氨苄青霉素抗性(菌株R 因子缺失)鉴定、紫外线敏感性(ΔuvrB突变)鉴定、四环素(pAQ1)抗性的鉴定、自发回变菌落数(his+)测定 、对阳性诱变剂的回变敏感性测定,以确定试验菌株符合试验标准。
表 1 各试验菌株生物学特性
菌株名称 组氨酸
缺陷脂多糖
屏障缺损R因子
缺失ΔuvrB
突变抗四
环素自发回
落数TA97a + + + + − 90~180 TA98 + + + + − 30~50 TA100 + + + + − 120~200 TA102 + + + − + 240~320 TA1535 + + − + − 10~35 取鉴定合格试验菌分别接种于装有7 ml营养肉汤培养基的试管中,于(35±2) ℃、(120±25) r/min条件下在空气恒温震荡器中扩增培养16~18 h,使用酶标仪检测菌液光密度并估算活菌浓度,待浓度达1×109 个/ml以上时可用于试验。
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设置6个HMS-01实验组,最高剂量为HMS-01 5 000 μg/皿,其下等比稀释设置5个剂量组分别为1 666.7、555.6、185.2、61.7、20.6 μg/皿。除此之外,另设置空白对照组及各菌对应的阳性对照组,分组情况见表2。
表 2 各试验菌对应的阳性诱变剂及剂量
代谢活化 菌株名称 阳性诱变剂 剂量(μg/皿) −S9 TA97a ICR-191 1 TA98 2-硝基芴 1 TA100 叠氮钠 2 TA102 甲基磺酸甲酯 1.3 TA1535 叠氮钠 2 +S9 TA97a 2-氨基蒽 3 TA98 2-氨基蒽 3 TA100 2-氨基蒽 3 TA102 2-氨基蒽 30 TA1535 2-氨基蒽 3 -
用全自动Ames实验仪进行试验,即2 ml融溶状态下的顶层琼脂培养基与下列物质混合:0.5 ml S9混合液或0.5 ml磷酸盐缓冲液、0.1 ml对应受试药品、0.1 ml扩增菌液,迅速混匀,室温静置,待平皿凝固后倒置于(37±1) ℃培养箱内培养48~72 h。各组共设置3个平行皿,重复试验1次。
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培养结束后肉眼或显微镜下观察各皿的受试药品是否有析出以及背景菌斑的生长情况,并计数各平行皿的回变菌落数。每个组分别求均值,并将结果以(
$ \bar{x}\pm s $ )的方式列出,各组平行数表示为$ n $ 。根据中国食品药品检定研究院发布的《细菌回复突变试验技术指导原则(征求意见稿)》制定的结果判断标准,对于TA97a、TA98、TA100及TA102,其诱导的回复突变菌落均数大于各自阴性对照组的2倍,且具有浓度依赖性及可重现性,即可判定为阳性结果;对于TA1535,其诱导的回复突变菌落均数高出各自阴性对照组的3倍,且具有浓度依赖性及可重现性,结果可判定为阳性。受试药品在加S9或不加S9混合液的条件下,经上述5种试验菌株测定后,只要有1种试验菌株为阳性,即可认定该受试药品的细菌回复突变试验为致突变阳性,反之则判断为阴性。
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受试药品HMS-01在有S9处理条件下的TA97a和TA1535菌株实验中,1 666.7和5 000 μg/皿浓度组有观察到镜下非干扰沉淀,其余所有处理条件均未观察到供试品沉淀,结果见表3。所有试验组均未观察到背景菌斑抑制现象。
表 3 HMS-01细菌回复突变试验结果(n=3)
代谢活化 组别 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 +S9 阴性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 20.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 61.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 185.2 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 555.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 1 666.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 5 000.0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 阳性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 −S9 阴性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 20.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 61.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 185.2 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 555.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 1 666.7 T0 P1 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P1 5 000.0 T0 P1 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P1 阳性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 注:T0.正常; P0.正常;P1.镜下非干扰性沉淀。 -
受试药品HMS-01在所有处理条件下的回复突变菌落平均数均小于各自阴性对照组的2倍,且无浓度依赖性升高,结果见表4。本次试验条件中,在有(或无)代谢活化条件时,受试品HMS-01对组氨酸营养缺陷型(his−)鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535均无潜在致突变性。
表 4 HMS-01细菌回复突变试验结果(n=3)
代谢活化 组别 回复突变菌落数 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 阴性对照组 157.7±15.5 29.3±3.1 138.3±4.7 326.0±7.5 21.3±4.0 20.6 156.7±17.8 34.7±7.1 119.3±8.0 334.3±16.7 21.0±5.2 61.7 159.0±7.2 31.7±8.5 140.0±9.8 250.0±113.2 19.3±3.1 185.2 147.7±22.7 33.3±4.2 151.7±6.0 319.0±6.2 18.7±0.6 555.6 168.3±7.6 34.7±2.5 130.7±10.0 340.0±6.1 19.3±4.0 1 666.7 157.7±2.1 34.7±5.8 148.7±2.9 287.0±84.1 20.3±4.6 5 000 143.7±19.9 38.3±6.7 122.3±8.1 304.0±22.9 17.0±1.7 阳性对照组 704.0±30.2 122.7±10.1 646.7±46.0 1 758.7±86.3 574.7±9.2 −S9 阴性对照组 171.7±5.1 36.7±3.2 151.3±8.7 340.3±3.8 23.7±1.5 20.6 168.0±11.8 40.0±1.7 125.7±9.1 338.7±7.4 25.3±3.1 61.7 169.7±17.5 42.3±13.7 131.3±15.6 350.0±15.9 21.3±3.1 185.2 152.0±13.1 34.3±5.5 148.0±8.7 366.0±5.0 24.7±3.2 555.6 167.7±1.5 42.0±2.0 161.3±8.6 351.0±24.2 22.7±6.5 1 666.7 163.0±3.6 45.3±3.2 156.0±3.6 376.7±25.7 22.3±3.1 5 000 164.7±22.9 40.3±3.1 153.3±6.7 365.0±26.0 17.3±3.8 阳性对照组 1 384.0±4.0 1 264.0±17.4 504.0±38.6 1 365.3±48.4 188.0±32.7
Genotoxicity evaluation of HMS-01
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摘要:
目的 检测HMS-01的遗传毒性,并对其进行临床前安全评价研究,为后续该药物进入临床试验提供支持。 方法 采用鼠伤寒沙门氏菌进行细菌回复突变试验(Ames试验)评价HMS-01的遗传毒性。 结果 HMS-01在20.6、61.7、185.2、555.6、1 666.7、5 000 μg/皿的6个剂量下,无论有无代谢活化条件,对鼠伤寒沙门氏菌均无致突变性。 结论 在本实验剂量范围内,HMS-01未见致突变性。 -
关键词:
- HMS-01 /
- 细菌回复突变试验Ames /
- 致突变性 /
- 遗传毒性
Abstract:Objective To provide a toxicological basis for HMS-01 in future clinical trials, through genotoxicity testing of safety evaluation. Methods The genotoxicity of HMS-01 was evaluated by Bacterial Reverse Mutation Assay (Ames test) with Salmonella typhimurium. Results HMS-01 was non-mutagenic against Salmonella typhimurium at six doses of 20.6, 61.7, 185.2, 555.6, 1666.7, and 5000 μg/dish with (or without) a metabolic activation system. Conclusion HMS-01 was not found to be mutagenic in the dose range of this experiment. -
Key words:
- HMS-01 /
- bacterial reverse mutation assay /
- mutagenicity /
- genetic toxicity
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表 1 各试验菌株生物学特性
菌株名称 组氨酸
缺陷脂多糖
屏障缺损R因子
缺失ΔuvrB
突变抗四
环素自发回
落数TA97a + + + + − 90~180 TA98 + + + + − 30~50 TA100 + + + + − 120~200 TA102 + + + − + 240~320 TA1535 + + − + − 10~35 表 2 各试验菌对应的阳性诱变剂及剂量
代谢活化 菌株名称 阳性诱变剂 剂量(μg/皿) −S9 TA97a ICR-191 1 TA98 2-硝基芴 1 TA100 叠氮钠 2 TA102 甲基磺酸甲酯 1.3 TA1535 叠氮钠 2 +S9 TA97a 2-氨基蒽 3 TA98 2-氨基蒽 3 TA100 2-氨基蒽 3 TA102 2-氨基蒽 30 TA1535 2-氨基蒽 3 表 3 HMS-01细菌回复突变试验结果(n=3)
代谢活化 组别 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 +S9 阴性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 20.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 61.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 185.2 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 555.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 1 666.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 5 000.0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 阳性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 −S9 阴性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 20.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 61.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 185.2 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 555.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 1 666.7 T0 P1 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P1 5 000.0 T0 P1 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P1 阳性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 注:T0.正常; P0.正常;P1.镜下非干扰性沉淀。 表 4 HMS-01细菌回复突变试验结果(n=3)
代谢活化 组别 回复突变菌落数 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 阴性对照组 157.7±15.5 29.3±3.1 138.3±4.7 326.0±7.5 21.3±4.0 20.6 156.7±17.8 34.7±7.1 119.3±8.0 334.3±16.7 21.0±5.2 61.7 159.0±7.2 31.7±8.5 140.0±9.8 250.0±113.2 19.3±3.1 185.2 147.7±22.7 33.3±4.2 151.7±6.0 319.0±6.2 18.7±0.6 555.6 168.3±7.6 34.7±2.5 130.7±10.0 340.0±6.1 19.3±4.0 1 666.7 157.7±2.1 34.7±5.8 148.7±2.9 287.0±84.1 20.3±4.6 5 000 143.7±19.9 38.3±6.7 122.3±8.1 304.0±22.9 17.0±1.7 阳性对照组 704.0±30.2 122.7±10.1 646.7±46.0 1 758.7±86.3 574.7±9.2 −S9 阴性对照组 171.7±5.1 36.7±3.2 151.3±8.7 340.3±3.8 23.7±1.5 20.6 168.0±11.8 40.0±1.7 125.7±9.1 338.7±7.4 25.3±3.1 61.7 169.7±17.5 42.3±13.7 131.3±15.6 350.0±15.9 21.3±3.1 185.2 152.0±13.1 34.3±5.5 148.0±8.7 366.0±5.0 24.7±3.2 555.6 167.7±1.5 42.0±2.0 161.3±8.6 351.0±24.2 22.7±6.5 1 666.7 163.0±3.6 45.3±3.2 156.0±3.6 376.7±25.7 22.3±3.1 5 000 164.7±22.9 40.3±3.1 153.3±6.7 365.0±26.0 17.3±3.8 阳性对照组 1 384.0±4.0 1 264.0±17.4 504.0±38.6 1 365.3±48.4 188.0±32.7 -
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