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肺型氧中毒是长期吸入高浓度氧气导致的肺部损伤,表现为肺组织充血、水肿、炎性浸润等,其中以多型核白细胞为主[1]。活化的多型核白细胞可以激活氧化酶,进而产生和释放大量的炎症介质和氧自由基,进一步介导级联式扩大的炎症反应对肺部造成损伤[2]。在饱和潜水或重型减压病患者进行加压治疗时,肺型氧中毒已成为最常见的并发症[3]。然而,目前关于高压氧(HBO)诱导的肺型氧中毒发生机制缺乏深入的探讨。
山莨菪碱(ANI)是一种毒蕈碱(M)受体阻滞剂,新斯的明(NEO)是一种临床常见的胆碱酯酶抑制剂。我们课题组前期研究发现ANI和NEO以500∶1的比例组成复方,简称新斯莨菪碱,能协同地激活α7nAChR,并减轻二者联用所致的不良反应。研究表明激活α7nAChR受体在感染性休克[4]、类风湿关节炎[5]、挤压综合征[6]、脑卒中[7]等动物模型上均发挥保护作用。然而,在HBO诱导的肺型氧中毒的发生、发展过程中,新斯莨菪碱是否可以用于肺型氧中毒的治疗?其治疗作用的病理生理机制是什么?这些都尚未阐明。
铁死亡是一种以细胞内铁依懒性的活性氧(ROS)异常增高,导致细胞内ROS的生成和降解失衡为特征的细胞死亡方式[8]。高浓度氧暴露条件下生成的大量ROS,一方面可直接对肺细胞产生损害,另一方面可参与炎症反应,促进炎症细胞渗透聚集,使各种致炎因子的表达增多,进一步加重肺的急性炎症反应[9]。
本文探究了新斯莨菪碱对HBO诱导的肺型氧中毒是否具有保护效应,并在此基础上,阐明铁死亡在新斯莨菪碱治疗HBO诱导的肺型氧中毒中的作用,以期为肺型氧中毒的临床防治提供新的理论指导和思路。
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雄性C57BL/6小鼠,6~8周龄,小鼠购自上海斯莱克公司。所有小鼠均饲养于22℃,昼夜循环12 h的独立饲养系统中。小鼠自由饮食、自由饮水。所有实验均经海军军医大学实验动物伦理委员会批准并按照指南进行。
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小型实验动物氧舱(RDC150-300-6,海军军医大学);台式高速冷冻离心(SCILOGEX);7500RT-PCR 仪器(Applied Biosystems 公司);激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司);酶标仪(瑞士Tacan 公司);高速组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司);Trizol、BCA 法蛋白定量试剂盒(美国GLPBIO公司);苏木精-伊红(上海Sangon Biotech公司);戊巴比妥(上海国药集团化学试剂公司);RT-PCR试剂盒(日本Takara公司);组织铁检测试剂盒(北京Solarbiog公司);伊文思蓝(美国Sigma-Aldrich公司);MDA、GSH检测试剂盒(上海Beyotime公司);Perls stain、抗谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)抗体、抗β-actin抗体(英国Abcam公司);驴抗兔/驴抗鼠二抗、Odyssey 扫膜仪(LI-COR公司)。
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将小鼠置于动物加压舱内,先用纯氧冲洗舱5 min,然后将压力在5 min内调至舱内为100% O2、2.5 ATA,维持6 h,在暴露过程中保持 0.5 L/min的连续氧流量,每1~2 h调整气阀进行快速通气,同时舱内放置碱石灰以避免呼吸产生的CO2在舱内蓄积。动物实验分组如下:①正常组:腹腔注射给予生理盐水10 ml/kg,常压饲养;②模型组:HBO暴露前30 min给予生理盐水10 ml/kg,2.5 ATA暴露6 h;③新斯莨菪碱组:HBO暴露前30 min给予ANI(25 mg/kg)+NEO(50 μg/kg),2.5 ATA 暴露6 h。
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使用戊巴比妥钠麻醉并处死小鼠,解剖取小鼠左肺组织于4%多聚甲醛中固定,然后用石蜡包埋并切成5 μm的薄片。在 200倍光学显微镜下观察组织炎症、水肿或其他损伤。组织学评分:0分为正常组织学;1分代表轻度白细胞浸润和毛细血管充血;2分代表轻度白细胞浸润、血管周围水肿、肺结构部分破坏和出血;3分代表强烈的白细胞浸润和肺结构破坏。
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HBO暴露6 h后,将小鼠固定,尾静脉注射1%伊文思蓝(50 mg/kg)后放回笼中自由活动,约30 min处死动物,用PBS灌流后取肺组织,用滤纸擦干肺组织表面水分并对肺组织进行拍照。每100 mg肺组织加入2 ml甲酰胺,55℃孵育18 h,反应结束后10 000×g 离心30 min后取上清液,并在630、740 nm处测量吸光度。
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将小鼠麻醉处死后,取新鲜左肺组织,滤纸擦干表面血迹后称重记为湿重,随后将肺组织置于60℃干燥箱中,每日测量肺组织重量,直至肺组织重量不再变化,此时肺组织重量为干重。肺含水量(%)=(湿重−干重)/湿重×100%。
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用1 ml预冷PBS经气管插管灌洗肺3次,收集混合的支气管肺泡灌洗液(BALF),将收集到的BALF以1 500 r/min 离心10 min获得其上清液,BCA法测定试剂盒定量BALF中总蛋白。
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30 mg肺组织在冷PBS中清洗,在冰上用匀浆器在铁测定缓冲液中匀浆,在4℃以16 000×g离心10 min,收集上清液用铁检测试剂盒进行组织铁含量测定。
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戊巴比妥钠麻醉处死小鼠,取新鲜肺组织于4%多聚甲醛中固定,固定48 h后进行梯度脱水,二甲苯置换,浸蜡;包埋、切片(厚度为5 μm)。将石蜡切片脱蜡后用Prussian Blue Stain(等体积的亚铁氰化钾溶液和盐酸溶液混合,制成铁染色工作液)染色15 min,洗涤,然后用核固红溶液染色5 min,洗涤,封片后在Olympus光学显微镜下观察染色切片。
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取100 μg肺组织于300 μl PBS溶液中,匀浆机研磨后,以12 000 r/min离心10 min后取上清液待测。所有试剂盒均按照制造商的说明书使用,按检测工作液与上清2∶1配好检测体系后100℃水浴15 min,冷却后于532 nm处测吸光度。
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取100 μg肺组织,与700 μl蛋白去除试剂S溶液混匀,匀浆机研磨后以12 000 r/min,离心10 min后取上清液进行总谷胱甘肽测定。所有试剂盒均按照制造商的说明书使用,25℃反应60 min即可测得氧化性谷胱甘肽(GSSG)含量,还原GSH含量=总谷胱甘肽含量−GSSG×2 。
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动物出舱后,解剖取肺组织,使用TRIzol试剂提取组织总RNA并逆转录成cDNA,进行PCR扩增,采用2–ΔΔCT分析目的基因的相对表达量,引物序列见表1。
表 1 实时定量PCR引物序列
引物名称 引物序列(5′—3′) IL-6(F) CCAGAAACCGCTATGAAGTTCC IL-6(R) GTTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA IL-1β(F) GTTCCCATTAGACAACTGCACTACAG IL-1β(R) GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTA TNF-α(F) CCCCAAAGGGATGAGAAGTTC TNF-α(R) CCTCCACTTGGTGGTTTGCT GAPDH(F) GTATGACTCCACTCACGGCAAA GAPDH(R) GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 注:F: 正向引物; R: 反向引物。 -
提取肺组织蛋白,BCA法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质,然后转移到硝酸纤维素膜上,与GPX4、β-肌动蛋白共孵育。最后,根据情况将膜与驴抗兔或驴抗鼠二抗孵育,使用Odyssey 扫膜仪获取图像,通过Image J 软件对条带进行定量分析。
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实验数据的分析以及数据处理均使用GraphPad Prism 8.0 软件进行。所有值以(
$ \bar{x}\pm s $ )表示,多组间比较用单因素方差分析(ANOVA)并 Bonferroni 检验,P<0.05 视为差异具有统计学意义。
Protective effect and mechanisms of neostigmine in combination with anisodamine against pulmonary oxygen toxicity
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摘要:
目的 高压氧(HBO)诱导的肺型氧中毒尚无有效的防治措施。该研究旨在阐明新斯的明(NEO)与山莨菪碱(ANI)联合(简称新斯莨菪碱)应用对肺型氧中毒的作用并初步探讨其机制。 方法 将C57BL/6小鼠暴露于2.5 ATA 99.9%氧气6 h制备肺型氧中毒模型,对照组小鼠给予生理盐水腹腔注射,治疗组小鼠给予ANI(25 mg/kg,腹腔注射)和NEO (50 μg/kg,腹腔注射),暴露结束后取肺组织进行检测。HE染色观察肺组织的病理损伤情况;伊文思蓝染色通过检测肺通透性以及测定肺湿/干比及肺泡灌洗液中的蛋白含量来衡量肺损伤的严重程度;同时测定肺组织中炎症因子、氧化应激指标以及铁含量变化情况。 结果 与正常组相比,模型组的肺损伤程度显著加重,肺通透性、肺湿/干比以及肺泡灌洗液中蛋白含量同步增加;肺组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平显著增加,抑炎因子IL-4、TGF-β明显降低;氧化指标MDA 显著升高、抗氧化指标 GSH 则显著降低;铁含量升高,铁死亡的标志物GPX4表达量增加,而给予新斯莨菪碱治疗后能明显逆转上述变化。 结论 新斯莨菪碱对肺型氧中毒具有保护作用,可能通过激活胆碱能抗炎通路,从而抑制炎症和氧化应激的发生,进而减少了肺组织中游离铁的含量,最终抑制细胞铁死亡。 Abstract:Objective Pulmonary oxygen poisoning resulting from hyperbaric oxygen, frequently occurs in specialized operations, without any current effective prevention or treatment measures. To elucidate the impact and mechanism of neostigmine (NEO) in combination with anisodamine (ANI) (neoscopolamine) on pulmonary oxygen toxicity. Methods The animal model of pulmonary oxygen poisoning was established. C57BL/6 mice were exposed to 2.5 ATA 99.9% oxygen for 6 h. The control group mice were injected with normal saline ip, while the treatment group mice received injections of ANI (25 mg/kg, ip)and NEO (50 μg/kg, ip). Lung tissues were collected and stained with HE to observe any pathological injuries after exposure. Evans blue stain was utilized to identify lung permeability, wet/dry lung ratio, and protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) to assess the lung injury’s severity. The modifications in inflammatory factors, oxidative stress indicators, and iron content in lung tissue were assessed. Results The results showed that the 2.5 ATA 99.9% oxygen-exposed group experienced a significant worsening of lung injury, as well as increased lung permeability, lung wet/dry ratio, and protein content in alveolar lavage fluid when compared to the control group. Moreover, mRNA levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α, and IFN-γ in the lung tissue of the model group were significantly elevated, while the levels of anti-inflammatory cytokines IL-4 and TGF-β were significantly reduced. The oxidative index MDA also significantly increased, while the antioxidant index GSH significantly decreased. Additionally, the expression of GPX4, a marker of ferroptosis, increased with an increase in iron content. Neoscopolamine treatment successfully reversed those effects. Conclusion The combined use of ANI and NEO had a protective effect on pulmonary oxygen poisoning. Neoscopolamine may inhibit inflammation and oxidative stress by activating the cholinergic anti-inflammatory pathway, thereby reducing the content of free iron in lung tissue and finally inhibiting cell ferroptosis. -
Key words:
- hyperbaric oxygen /
- pulmonary oxygen toxicity /
- neoscopolamine /
- inflammation /
- oxidative stress
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表 1 实时定量PCR引物序列
引物名称 引物序列(5′—3′) IL-6(F) CCAGAAACCGCTATGAAGTTCC IL-6(R) GTTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA IL-1β(F) GTTCCCATTAGACAACTGCACTACAG IL-1β(R) GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTA TNF-α(F) CCCCAAAGGGATGAGAAGTTC TNF-α(R) CCTCCACTTGGTGGTTTGCT GAPDH(F) GTATGACTCCACTCACGGCAAA GAPDH(R) GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 注:F: 正向引物; R: 反向引物。 -
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