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肺型氧中毒是长期吸入高浓度氧气导致的肺部损伤，表现为肺组织充血、水肿、炎性浸润等，其中以多型核白细胞为主[1]。活化的多型核白细胞可以激活氧化酶，进而产生和释放大量的炎症介质和氧自由基，进一步介导级联式扩大的炎症反应对肺部造成损伤[2]。在饱和潜水或重型减压病患者进行加压治疗时，肺型氧中毒已成为最常见的并发症[3]。然而，目前关于高压氧（HBO）诱导的肺型氧中毒发生机制缺乏深入的探讨。
山莨菪碱（ANI）是一种毒蕈碱（M）受体阻滞剂，新斯的明（NEO）是一种临床常见的胆碱酯酶抑制剂。我们课题组前期研究发现ANI和NEO以500∶1的比例组成复方，简称新斯莨菪碱，能协同地激活α7nAChR，并减轻二者联用所致的不良反应。研究表明激活α7nAChR受体在感染性休克[4]、类风湿关节炎[5]、挤压综合征[6]、脑卒中[7]等动物模型上均发挥保护作用。然而，在HBO诱导的肺型氧中毒的发生、发展过程中，新斯莨菪碱是否可以用于肺型氧中毒的治疗？其治疗作用的病理生理机制是什么？这些都尚未阐明。
铁死亡是一种以细胞内铁依懒性的活性氧（ROS）异常增高，导致细胞内ROS的生成和降解失衡为特征的细胞死亡方式[8]。高浓度氧暴露条件下生成的大量ROS，一方面可直接对肺细胞产生损害，另一方面可参与炎症反应，促进炎症细胞渗透聚集，使各种致炎因子的表达增多，进一步加重肺的急性炎症反应[9]。
本文探究了新斯莨菪碱对HBO诱导的肺型氧中毒是否具有保护效应，并在此基础上，阐明铁死亡在新斯莨菪碱治疗HBO诱导的肺型氧中毒中的作用，以期为肺型氧中毒的临床防治提供新的理论指导和思路。
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雄性C57BL/6小鼠，6~8周龄，小鼠购自上海斯莱克公司。所有小鼠均饲养于22℃，昼夜循环12 h的独立饲养系统中。小鼠自由饮食、自由饮水。所有实验均经海军军医大学实验动物伦理委员会批准并按照指南进行。
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小型实验动物氧舱（RDC150-300-6，海军军医大学）；台式高速冷冻离心（SCILOGEX）；7500RT-PCR 仪器（Applied Biosystems 公司）；激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）；酶标仪（瑞士Tacan 公司）；高速组织研磨仪（上海净信实业发展有限公司）；Trizol、BCA 法蛋白定量试剂盒（美国GLPBIO公司）；苏木精-伊红（上海Sangon Biotech公司）；戊巴比妥（上海国药集团化学试剂公司）；RT-PCR试剂盒（日本Takara公司）；组织铁检测试剂盒（北京Solarbiog公司）；伊文思蓝（美国Sigma-Aldrich公司）；MDA、GSH检测试剂盒（上海Beyotime公司）；Perls stain、抗谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗体、抗β-actin抗体（英国Abcam公司）；驴抗兔/驴抗鼠二抗、Odyssey 扫膜仪（LI-COR公司）。
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将小鼠置于动物加压舱内，先用纯氧冲洗舱5 min，然后将压力在5 min内调至舱内为100% O2、2.5 ATA，维持6 h，在暴露过程中保持 0.5 L/min的连续氧流量，每1~2 h调整气阀进行快速通气，同时舱内放置碱石灰以避免呼吸产生的CO2在舱内蓄积。动物实验分组如下：①正常组：腹腔注射给予生理盐水10 ml/kg，常压饲养；②模型组：HBO暴露前30 min给予生理盐水10 ml/kg，2.5 ATA暴露6 h；③新斯莨菪碱组：HBO暴露前30 min给予ANI（25 mg/kg）+NEO（50 μg/kg），2.5 ATA 暴露6 h。
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使用戊巴比妥钠麻醉并处死小鼠，解剖取小鼠左肺组织于4%多聚甲醛中固定，然后用石蜡包埋并切成5 μm的薄片。在 200倍光学显微镜下观察组织炎症、水肿或其他损伤。组织学评分：0分为正常组织学；1分代表轻度白细胞浸润和毛细血管充血；2分代表轻度白细胞浸润、血管周围水肿、肺结构部分破坏和出血；3分代表强烈的白细胞浸润和肺结构破坏。
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HBO暴露6 h后，将小鼠固定，尾静脉注射1%伊文思蓝（50 mg/kg）后放回笼中自由活动，约30 min处死动物，用PBS灌流后取肺组织，用滤纸擦干肺组织表面水分并对肺组织进行拍照。每100 mg肺组织加入2 ml甲酰胺，55℃孵育18 h，反应结束后10 000×g 离心30 min后取上清液，并在630、740 nm处测量吸光度。
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将小鼠麻醉处死后，取新鲜左肺组织，滤纸擦干表面血迹后称重记为湿重，随后将肺组织置于60℃干燥箱中，每日测量肺组织重量，直至肺组织重量不再变化，此时肺组织重量为干重。肺含水量（%）=（湿重−干重）/湿重×100%。
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用1 ml预冷PBS经气管插管灌洗肺3次，收集混合的支气管肺泡灌洗液（BALF），将收集到的BALF以1 500 r/min 离心10 min获得其上清液，BCA法测定试剂盒定量BALF中总蛋白。
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30 mg肺组织在冷PBS中清洗，在冰上用匀浆器在铁测定缓冲液中匀浆，在4℃以16 000×g离心10 min，收集上清液用铁检测试剂盒进行组织铁含量测定。
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戊巴比妥钠麻醉处死小鼠，取新鲜肺组织于4%多聚甲醛中固定，固定48 h后进行梯度脱水，二甲苯置换，浸蜡；包埋、切片（厚度为5 μm）。将石蜡切片脱蜡后用Prussian Blue Stain（等体积的亚铁氰化钾溶液和盐酸溶液混合，制成铁染色工作液）染色15 min，洗涤，然后用核固红溶液染色5 min，洗涤，封片后在Olympus光学显微镜下观察染色切片。
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取100 μg肺组织于300 μl PBS溶液中，匀浆机研磨后，以12 000 r/min离心10 min后取上清液待测。所有试剂盒均按照制造商的说明书使用，按检测工作液与上清2∶1配好检测体系后100℃水浴15 min，冷却后于532 nm处测吸光度。
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取100 μg肺组织，与700 μl蛋白去除试剂S溶液混匀，匀浆机研磨后以12 000 r/min，离心10 min后取上清液进行总谷胱甘肽测定。所有试剂盒均按照制造商的说明书使用，25℃反应60 min即可测得氧化性谷胱甘肽（GSSG）含量，还原GSH含量=总谷胱甘肽含量−GSSG×2 。
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动物出舱后，解剖取肺组织，使用TRIzol试剂提取组织总RNA并逆转录成cDNA，进行PCR扩增，采用2–ΔΔCT分析目的基因的相对表达量，引物序列见表1。
表 1 实时定量PCR引物序列
引物名称 引物序列（5′—3′） IL-6（F） CCAGAAACCGCTATGAAGTTCC IL-6（R） GTTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA IL-1β（F） GTTCCCATTAGACAACTGCACTACAG IL-1β（R） GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTA TNF-α（F） CCCCAAAGGGATGAGAAGTTC TNF-α（R） CCTCCACTTGGTGGTTTGCT GAPDH（F） GTATGACTCCACTCACGGCAAA GAPDH（R） GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 注：F: 正向引物; R: 反向引物。 -
提取肺组织蛋白，BCA法测定蛋白浓度。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白质，然后转移到硝酸纤维素膜上，与GPX4、β-肌动蛋白共孵育。最后，根据情况将膜与驴抗兔或驴抗鼠二抗孵育，使用Odyssey 扫膜仪获取图像，通过Image J 软件对条带进行定量分析。
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实验数据的分析以及数据处理均使用GraphPad Prism 8.0 软件进行。所有值以（
$ \bar{x}\pm s $ ）表示，多组间比较用单因素方差分析（ANOVA）并 Bonferroni 检验，P<0.05 视为差异具有统计学意义。 -
首先，探究HBO暴露后对肺组织的病理损伤情况以及新斯莨菪碱对HBO诱导的肺损伤的作用。将C57BL/6小鼠置于2.5 ATA的高压氧舱中暴露6 h建立肺型氧中毒模型，然后通过HE染色观察肺组织结构变化，如图1所示。正常组小鼠肺泡肺泡壁结构完整，间隔无增厚，肺泡腔内无渗出物；HBO暴露后，肺泡间隔出现水肿、增厚，肺泡腔内可见红细胞渗出，肺间质见大量炎性细胞浸润（图1B）；给予新斯莨菪碱治疗后，肺水肿明显减轻，肺泡内炎性细胞浸润以及红细胞渗出减少，肺组织病理损伤减轻（图1C～D）。以上结果表明新斯莨菪碱治疗能减轻肺型氧中毒后肺组织的病理损伤。
图 1 新斯莨菪碱对高压氧诱导的肺损伤的作用（n=3，重复3次）
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从图2可以看出，模型组伊文思蓝染色加深，表明HBO暴露后肺渗透性增加，而新斯莨菪碱治疗后上述情况明显改善（图2A～B）。与正常组相比，模型组肺组织湿干比重明显增加，而新斯莨菪碱治疗后能够显著降低肺湿干比（图2C）。此外，HBO暴露后肺泡灌洗液中蛋白含量升高，新斯莨菪碱治疗能够有效减少肺泡灌洗液中蛋白的渗出（图2D）。这些结果表明，新斯莨菪碱治疗能够有效改善肺型氧中毒后的肺水肿及肺组织渗出。
图 2 新斯莨菪碱对肺组织渗透性的影响（n=3，重复3次）
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从图3中可以看出，HBO暴露后，肺组织中促细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的mRNA显著增高，抗炎因子IL-4及TGF-β则显著降低，而新斯莨菪碱能显著降低促炎因子的表达，同时提高抗炎因子的水平（图3A～F）。HBO暴露后肺组织氧化指标MDA升高，而抗氧化指标GSH降低，给予新斯莨菪碱治疗后，能明显逆转上述变化（图3G～H）。由此说明，新斯莨菪碱能降低HBO诱导的肺型氧中毒引起的炎症反应及氧化应激水平。
图 3 新斯莨菪碱治疗对炎症因子mRNA水平的影响（n=3，重复3次）
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铁元素是维持正常生理活动所必需的，但过量的铁会产生对细胞有害的自由基。在病理状态下，铁蛋白的破坏导致细胞内游离铁的增高，脂质过氧化反应和游离铁的增高会导致细胞的铁死亡。如图4所示，HBO暴露后普鲁士蓝染色可见肺组织中铁含量增高，对肺组织铁离子含量进行检测得到了同样的结果（图4A～C）。GPX4是一种重要的抗氧化酶，HBO暴露后GPX4的表达降低（图4D～E），导致机体抗氧化应激能力减弱，对细胞有害的自由基无法被有效清除。而新斯莨菪碱治疗后可以改善GPX4的表达，降低肺组织铁含量，从而减少细胞铁死亡的发生，对肺组织起到保护作用。
图 4 铁死亡途径在新斯莨菪碱治疗HBO诱导的肺型氧中毒的作用（n=3，重复3次）
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HBO已被广泛用于多种疾病的治疗以及潜水作业中，并发挥了难以替代的作用[10]。然而，在饱和潜水或重型减压病患者加压治疗以及临床上用于治疗新生儿呼吸窘迫时，HBO诱导的肺损伤已成为最常见的并发症[11]。研究发现，当HBO环境持续存在时，将出现小气道功能障碍，表现为肺活量降低、气体扩散功能减弱和肺顺应性降低[12]。与之前的报道一致，本研究结果表明，与正常组相比，模型组的肺组织损伤显著加重；伊文思蓝染色显示HBO暴露后染色加深，肺湿/干比增加，同时肺泡灌洗液中的蛋白含量也显著增加，新斯莨菪碱治疗后这些变化被显著抑制，这些结果初步表明新斯莨菪碱与HBO诱导的肺型氧中毒的发生密切相关。
ANI属于传出自主神经M受体阻断剂，阻断M受体引起交感神经优势。NEO是一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，可有效延长乙酰胆碱的作用时间，同时激活胆碱能抗炎通路[11]。Sun等[4]研究证实，两药物联合使用，不仅可以加强胆碱能抗炎通路的炎症抑制作用，还可降低NEO的不良反应，达到协同增强作用。本课题组前期的研究发现ANI和NEO联合使用，能够通过阻断巨噬细胞上的毒蕈碱型受体，使更多的乙酰胆碱作用于α7尼古丁乙酰胆碱受体，进而对胆碱能抗炎通路起到双向活化调节作用，进一步加强了对炎症反应的抑制作用[7]。本研究发现新斯莨菪碱能够显著降低肺组织中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的表达。由此说明，新斯莨菪碱可减轻HBO导致的肺部炎症反应。
肺型氧中毒包括高压力损伤和高浓度氧损伤，目前认为ROS 及其代谢产物介导的生化紊乱是导致肺型氧中毒发生发展的主要因素。HBO环境下会产生大量氧自由基，可能导致细胞因子释放和炎症反应的增加，而异常的炎症反应可加剧肺损伤[13]。研究发现，HBO 暴露后肺组织中氧化指标MDA 显著升高、抗氧化指标 GSH 则显著降低，而给新斯莨菪碱治疗能明显改善肺组织氧化损伤情况。
铁死亡作为一种新发现的细胞死亡方式，其释放出内源性损伤相关分子（DAMPs）与炎症和氧化应激之间存在着诸多途径的交互作用。GPX4作为铁死亡的核心调控因子，近年来受到广泛关注。研究表明GPX4的缺乏或功能丧失会加剧铁死亡的发生，并促使细胞进一步受到氧化应激的影响[14]。Kang等[15]的研究发现在LPS诱导的脓毒症模型中，敲除GPX4导致脂质过氧化的加剧并进一步促进铁死亡的发生。本研究发现，HBO暴露后肺组织中铁含量增高、GPX4的表达量降低，而新斯莨菪碱治疗后可以逆转这些变化。
综上所述，新斯莨菪碱可能通过激活胆碱能抗炎通路，从而抑制炎症的和氧化应激的发生，进而减少了肺组织中游离铁的含量，最终抑制细胞铁死亡。下一步我们将通过体外实验，进一步验证在HBO诱导的肺型氧中毒模型中，新斯莨菪碱是否通过抑制铁死亡的产生从而减轻肺组织的损伤情况，以期为防治HBO诱导的肺型氧中毒提供新的策略。
Protective effect and mechanisms of neostigmine in combination with anisodamine against pulmonary oxygen toxicity
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摘要:
目的 高压氧（HBO）诱导的肺型氧中毒尚无有效的防治措施。该研究旨在阐明新斯的明（NEO）与山莨菪碱（ANI）联合（简称新斯莨菪碱）应用对肺型氧中毒的作用并初步探讨其机制。 方法 将C57BL/6小鼠暴露于2.5 ATA 99.9%氧气6 h制备肺型氧中毒模型，对照组小鼠给予生理盐水腹腔注射，治疗组小鼠给予ANI（25 mg/kg，腹腔注射）和NEO （50 μg/kg，腹腔注射），暴露结束后取肺组织进行检测。HE染色观察肺组织的病理损伤情况；伊文思蓝染色通过检测肺通透性以及测定肺湿/干比及肺泡灌洗液中的蛋白含量来衡量肺损伤的严重程度；同时测定肺组织中炎症因子、氧化应激指标以及铁含量变化情况。 结果 与正常组相比，模型组的肺损伤程度显著加重，肺通透性、肺湿/干比以及肺泡灌洗液中蛋白含量同步增加；肺组织中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的mRNA水平显著增加，抑炎因子IL-4、TGF-β明显降低；氧化指标MDA 显著升高、抗氧化指标 GSH 则显著降低；铁含量升高，铁死亡的标志物GPX4表达量增加，而给予新斯莨菪碱治疗后能明显逆转上述变化。 结论 新斯莨菪碱对肺型氧中毒具有保护作用，可能通过激活胆碱能抗炎通路，从而抑制炎症和氧化应激的发生，进而减少了肺组织中游离铁的含量，最终抑制细胞铁死亡。 Abstract:Objective Pulmonary oxygen poisoning resulting from hyperbaric oxygen, frequently occurs in specialized operations, without any current effective prevention or treatment measures. To elucidate the impact and mechanism of neostigmine （NEO） in combination with anisodamine （ANI） （neoscopolamine） on pulmonary oxygen toxicity. Methods The animal model of pulmonary oxygen poisoning was established. C57BL/6 mice were exposed to 2.5 ATA 99.9% oxygen for 6 h. The control group mice were injected with normal saline ip, while the treatment group mice received injections of ANI （25 mg/kg, ip）and NEO （50 μg/kg, ip）. Lung tissues were collected and stained with HE to observe any pathological injuries after exposure. Evans blue stain was utilized to identify lung permeability, wet/dry lung ratio, and protein concentration in the bronchoalveolar lavage fluid （BALF） to assess the lung injury’s severity. The modifications in inflammatory factors, oxidative stress indicators, and iron content in lung tissue were assessed. Results The results showed that the 2.5 ATA 99.9% oxygen-exposed group experienced a significant worsening of lung injury, as well as increased lung permeability, lung wet/dry ratio, and protein content in alveolar lavage fluid when compared to the control group. Moreover, mRNA levels of pro-inflammatory cytokines IL-1β, IL-6, TNF-α, and IFN-γ in the lung tissue of the model group were significantly elevated, while the levels of anti-inflammatory cytokines IL-4 and TGF-β were significantly reduced. The oxidative index MDA also significantly increased, while the antioxidant index GSH significantly decreased. Additionally, the expression of GPX4, a marker of ferroptosis, increased with an increase in iron content. Neoscopolamine treatment successfully reversed those effects. Conclusion The combined use of ANI and NEO had a protective effect on pulmonary oxygen poisoning. Neoscopolamine may inhibit inflammation and oxidative stress by activating the cholinergic anti-inflammatory pathway, thereby reducing the content of free iron in lung tissue and finally inhibiting cell ferroptosis. -
Key words:
- hyperbaric oxygen /
- pulmonary oxygen toxicity /
- neoscopolamine /
- inflammation /
- oxidative stress
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临床药物研究需要严格、标准、规范的数据管理[1]，众多文献阐述了统计分析前临床试验数据核查的相关问题及改进措施[1-4]，然而，对于统计分析所得数据的核查却鲜有报道。本文以生物等效性（BE）研究为例，介绍统计分析数据核查的要点，包括：试验分组的随机数字表、药代动力学（PK）主要参数以及BE的分析计算数据和结果在相应的软件中是否能够重现、与原统计分析报告是否一致。同时，统计专业人员对核查提出的问题进行敏感性分析，并出具相关报告。
1. 资料与方法
1.1 资料来源
本文所使用的数据来自我部于2019－2021年间所接受的18项BE研究统计分析数据核查的结果，所测试的药物分别为抗病毒、抗菌药物以及治疗心脑血管疾病、糖尿病等疾病的药物。
1.2 统计学方法
1.2.1 采用SAS软件运行得出随机数字表
随机指利用SAS软件中的随机化功能，事先给出种子数，进行随机化分组。该方法简便易行、可重复、符合随机化要求[5]。通过SAS系统的“PROC PLAN SEED=种子数”过程实现两组等比例随机化。例如，将001~010这10个数随机分配为A、B两组，种子数设定为20200506，则生成的结果A组为002、003、006、008和009，B组为001、004、005、007和010。核查时，只要采用试验时设定的种子数，则通过SAS运行得到的A组和B组的数据不变。用同样的随机种子，通过SAS程序运行，能够得出相同的随机表。由此证明研究对象进入试验组和对照组机会均等。
1.2.2 采用WinNonlin软件计算主要PK参数、SAS软件进行BE评价
BE指药学等效制剂或可替换药物在相同的试验条件下，给予相同的剂量，其活性成分吸收速度和程度的差异无统计学意义[6]。BE研究给药后，通过测量不同时间点的生物样本（全血、血浆、血清等）药物浓度，得出药物浓度-时间曲线，经过计算得出血药浓度-时间曲线下面积（AUC）、药物达峰浓度（cmax）、达峰时间（tmax）（图1）等PK参数后，再通过统计学分析比较，判断两种制剂是否生物等效。
目前，BE评价方法是置信区间法。当主要PK参数AUC和cmax的几何均值比值的90%置信区间在80%~125%内时，受试制剂吸收的速度和程度与参比制剂相当，视为生物等效[7]。
核查时，首先需要核对申办方提供的统计分析前的原始数据。统计专业人员向核查人员展示数据传输协议（由申办方提供）；然后，根据原始样本浓度数据，现场使用WinNonlin 8.1软件处理各组血药浓度测定数据，采用非房室模型计算出主要PK参数，包括AUC0-t、AUC0-∞、cmax，其他数据则使用SAS 9.4软件分析。如果受试制剂与参比制剂的AUC0-t、AUC0-∞和cmax几何均数比值的90%置信区间均落在80%~125%范围内，则两种制剂生物等效；否则，两种制剂不存在生物等效。将核查所得结果和结论与原统计分析报告核对，检查一致性。
2. 结果
2.1 一般情况
18项BE研究的分组随机数字表均可重现；18项研究均符合生物等效的判定标准，且BE评价结果与原统计分析报告一致；其中有13项研究的PK参数与原统计分析报告相同，其余5项研究的PK参数则有差异，见“2.2”项。
2.2 问题及处理结果
有12项研究存在个别样本采样时间偏差，其中，2项研究被要求补充敏感性分析，3项研究的分析数据集被要求进行受试者数据的重新纳入或剔除后，也进行了敏感性分析。
上述5项研究敏感性分析的结果显示：PK参数AUC0-t、AUC0-∞和cmax的几何均值比值的90%置信区间虽在数值上有所变化，但仍然在80%~125%范围内，维持原统计分析报告的BE评价。
3. 讨论
3.1 BE研究中随机化和等效性评价的意义
BE试验通常采用随机交叉等试验设计，随机和盲法因其有效控制偏倚而成为BE试验注册和核查的关键内容[8]。由于随机化即随机分配的优点，随机对照试验被广泛认为是评价新的药物、新的医疗器械或新的治疗方法疗效的最佳设计[9]，是评价医学新疗法的金标准[10]。
在过去的二十年里，许多第一代专利药品的专利和上市许可的到期，导致了仿制药的兴起。进行BE研究被认为是确定仿制药与专利药具有相同的有效性和安全性的关键[7]。BE研究在化学药物仿制药的申请、新药评价以及已上市药物的变更申请中，具有不可替代的作用[6, 8, 11]。
3.2 核查发现的问题
3.2.1 采样时间偏差
在药物临床试验方案中，试验期间各个样本采集的时间点有严格规定。由于操作技术、环境及其它因素的影响，可能导致样本采集的时间与计划采样时间有所偏差、且超过了方案允许的偏差范围，这种情况视为超窗[12]。超窗会否影响统计分析的结果，需要通过敏感性分析予以证明。
敏感性分析指通过改变方法、模型、未测量的变量值等考查结果的改变程度，以确定评估方法的稳健性。敏感性分析结果与主要分析结果一致，表明主要分析的结果稳健，反之亦然[13]。对BE研究而言，考查的关键便是生物等效这一评估结果对PK参数的变化是否敏感。
核查发现，有2项BE研究分别存在个别受试者采血时间超窗问题。例如，在某研究中，某受试者计划采血时间为给药后5 min，方案规定的允许偏差范围为30s之内，但实际采血时间为5min32s，即超窗2s。在原统计分析报告中，PK参数按照计划采血时间加2s，即5min2s计算。核查人员要求按照实际采血时间重新计算主要PK参数，即按照5min32s计算，并做敏感性分析，与原统计分析结果进行比较，考查所得结论的一致性。
由此可见，对样本采集的环节进行严格、科学的管理非常重要。另外，无论采样时间是否存在偏差甚至超窗，应尽可能获取所有数据，真实记录采样时间，并做出敏感性分析报告。
3.2.2 受试者数据重新剔除或纳入
临床试验有效性分析应涵盖随机化分组后的所有受试者，而不仅限于实际完成的受试者数据。按照这种意向性治疗原则所做的分析是最好的分析。
BE研究的统计分析集除全分析集（FAS）和安全数据集（SS）外，最主要的数据集为PK参数集（PKPS）和BE集（BES）[14]，BES是推断受试制剂和参比制剂是否生物等效的数据集。
在撰写统计报告时，如果剔除了某受试者数据，或者有受试者出现种种事故但没有被剔除，核查时可能被要求重新纳入或剔除受试者的数据，并进行敏感性分析，以考查是否对最终结果造成影响。例如，某BE试验对照组某受试者第二周期无给药后3.50 h、3.75 h、4.00 h、4.25 h、4.50 h及以后共13个时间段的血药浓度数据，原报告将该受试者纳入PKPS与BES，在核查时，将该受试者第二周期剔除PKPS与BES；或者，原报告将类似受试者剔除PKPS与BES，核查时又将该受试者重新纳入PKPS与BES。
需要注意的是，BE研究通常样本量相对较小，受各种原因数据剔除造成数据缺失的影响相对较大，可能对BE统计分析结果的稳健性带来挑战。因此，BE研究须严格质量管理，事先没有规定的不做剔除处理[11]。
4. 结论
统计分析数据是临床研究结果的呈现，是撰写统计分析报告和临床研究报告的依据。为确保临床研究最终结果和结论没有争议，国家药品监督管理局核查中心对药物临床研究的统计分析数据进行核查非常必要。
本文从统计学角度介绍了BE研究统计分析数据现场核查的主要内容，并对相关统计方法、核查发现的问题、原因和对策进行逐一分析和讨论。考虑到BE研究通常样本量较小，采样时间出现偏差、剔除或纳入数据可能影响统计结果的稳健性，因此，敏感性分析在BE研究中尤为重要，用于评估主要分析结果和结论的稳健性。敏感性分析和主要分析结果一致，则补充、巩固和加强研究结论，进一步证实试验药物的有效性和安全性[15-17]。本文建议，BE研究在统计分析计划的制定与统计分析报告的撰写中，对核查的内容、可能涉及敏感性分析的相关问题，特别是敏感性数据集PKPS和BES的调整，应予以充分考虑，以便在数据分析阶段采用多种敏感性分析方法，综合考虑结果的稳健性，为评估不同制剂临床治疗的可替换性提供扎实的研究数据。
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图 1 新斯莨菪碱对高压氧诱导的肺损伤的作用（n=3，重复3次）
A−C. 小鼠肺组织HE染色；D. 肺组织病理学损伤评分*P<0.05，与模型组比较；△△P<0.01，与正常组比较。
图 2 新斯莨菪碱对肺组织渗透性的影响（n=3，重复3次）
A. 不同组别肺组织伊文思蓝染色后；B. 肺组织伊文思蓝定量检测；C. 肺组织干湿比；D. 肺泡灌洗液蛋白含量测定**P<0.01，与模型组比较；△△P<0.01，与正常组比较。
图 3 新斯莨菪碱治疗对炎症因子mRNA水平的影响（n=3，重复3次）
A−F. 肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-4和TGF-β的mRNA水平的表达；G. MDA含量；H. GSH含量*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；△P<0.05，△△P<0.01，与正常组比较。
图 4 铁死亡途径在新斯莨菪碱治疗HBO诱导的肺型氧中毒的作用（n=3，重复3次）
A. 不同组别肺组织普鲁士蓝染色；B. 肺铁染色；C. 肺组织铁含量；D. 肺组织GPX4的表达*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；△P<0.05，△△P<0.01，与正常组比较。
表 1 实时定量PCR引物序列
引物名称 引物序列（5′—3′） IL-6（F） CCAGAAACCGCTATGAAGTTCC IL-6（R） GTTGGGAGTGGTATCCTCTGTGA IL-1β（F） GTTCCCATTAGACAACTGCACTACAG IL-1β（R） GTCGTTGCTTGGTTCTCCTTGTA TNF-α（F） CCCCAAAGGGATGAGAAGTTC TNF-α（R） CCTCCACTTGGTGGTTTGCT GAPDH（F） GTATGACTCCACTCACGGCAAA GAPDH（R） GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 注：F: 正向引物; R: 反向引物。 
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