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姜黄素(Cur)是从姜科姜黄属植物中提取的多酚类化合物,由于安全无毒,被WHO和FDA批准为天然食品添加剂。姜黄素具有抗炎、抗肿瘤、抗抑郁等药理作用[1-2],但由于水中溶解度小,口服难吸收,且在肠道易转化,目前仍处于临床实验阶段。如何提高姜黄素在体内的生物利用度是近年来的研究热点,包括研制新剂型、改变其化学结构及联用生物利用度增强剂[3-4]。胡椒碱(Pip)可作用于P-gp,通过调节胃肠道分泌等机制来增强其他药物的生物利用度[5]。姜黄素与佐剂胡椒碱的联用是近几年的研究热点,胡椒碱不仅能够改善姜黄素生物利用度,还具有药理作用上的协同效果。自乳化药物传递系统(SMEDDS)由药物、油相、表面活性剂和助表面活性剂组成,在体内胃肠道温和蠕动下能够自发形成微乳[6],通过增加难溶性药物的溶解度,从而促进药物在体内的吸收。
姜黄素与胡椒碱比例在各参考文献中不同,本研究项目结合参考文献后尝试不同梯度的质量比,以稳定性和载药量为指标,最终优选姜黄素和胡椒碱的质量比为4∶1。本研究将姜黄素和胡椒碱同时包裹于自微乳制剂中,制备成复方自微乳制剂(Cur+Pip)-SMEDDS,旨在提高姜黄素的溶解度和生物利用度。笔者建立了复方姜黄素自微乳制剂中姜黄素和胡椒碱含量的HPLC测定法,考察药物的体外释放行为,为姜黄素和胡椒碱的新剂型研究提供理论依据。
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按照处方称取油酸乙酯∶吐温-80∶二乙二醇单乙基醚(Transcutol P)=30%∶55%∶15%,置于50 ml烧杯中,25 ℃超声混匀后,得到空白自微乳制剂。称取适量空白自微乳制剂,按照姜黄素40 mg/g,胡椒碱10 mg/g加入原料药,于30 ℃超声混合,至药物完全溶解,得到含姜黄素和胡椒碱的复方姜黄素自微乳制剂(Cur+Pip)-SMEDDS,外观见图1。取本品约1.0 g,加水稀释至10 ml,使用pH计测定自乳化制剂pH值。空白自乳化制剂pH值为5.37;载药自乳化制剂pH值为4.97。
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色谱柱DiamonsilTM C18柱(200 mm×4.6 mm,5 μm);流动相∶乙腈∶4%冰醋酸溶液=48∶52(V:V);流速:1.0 ml/min;柱温:25 ℃;姜黄素检测波长:430 nm;胡椒碱检测波长:343 nm;进样量:20 μl。
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对照品溶液:取姜黄素和胡椒碱对照品各约10.0 mg,精密称定,置于10 ml量瓶中,用甲醇溶解并定容,配成1.0 mg/ml的标准母液备用。
样品溶液:吸取适量(Cur+Pip)-SMEDDS溶液于10 ml量瓶中,加入甲醇溶解并定容,用0.45 μm微孔滤膜过滤后稀释10倍作为样品溶液。
空白溶液:吸取适量空白自微乳制剂于10 ml量瓶中,按照样品溶液的配制方法处理,作为不含药物的阴性样品溶液。
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分别精密吸取空白微乳溶液、姜黄素和胡椒碱对照品溶液和(Cur+Pip)-SMEDDS样品溶液各20 μl,按照“2.2”项下依法操作,记录色谱图,考察辅料是否对药物的测定存在干扰。结果表明,在此条件下,高效液相色谱法专属性强,辅料不干扰药物的测定(图2)。
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姜黄素的线性关系:精密吸取姜黄素母液10、100 μl,1、2、4、6、8 ml于100 ml量瓶中,加流动相定容后混匀,配制成系列浓度为0.1、1.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 µg/ml的姜黄素标准液。吸取胡椒碱母液10、20 、100 μl,0.5、1、2、4 ml于100 ml量瓶中,配制成系列浓度为0.1、0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0 µg/ml的标准液。按照“2.2.1”项下依法操作,记录姜黄素和胡椒碱峰面积。以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标绘制标准曲线,求得回归方程。
姜黄素:Y=36.07X−12.75,(n=7,r=0.999 8);
胡椒碱:Y=34.296X+4.442 3,(n=7,r=0.999 9)。
结果表明,姜黄素在0.1~80 µg/ml浓度范围内,胡椒碱在0.1~40 µg/ml浓度范围内,峰面积与测定浓度呈良好的线性关系。
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分别精密吸取适量姜黄素和胡椒碱低、中、高3种浓度的药物溶液,进行HPLC分析。于1 d内重复进样6次,测定峰面积,计算日内精密度。连续进样5 d,测定峰面积,计算日间精密度。姜黄素和胡椒碱的日内、日间精密度RSD均 < 2.0%(n=6)。说明该方法精密度良好,满足测定的要求。
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取供试品溶液(Cur+Pip)-SMEDDS,分别于0、2、4、6、8、12、24、48 h进样测定,测定峰面积,计算RSD以考察供试品稳定性。结果显示姜黄素和胡椒碱在48 h内RSD分别为1.7%和1.75%,表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。
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取3批样品(批号:20190604、20190608、20190612),按“2.1”项下方法平行制备6份供试品溶液,姜黄素平均含量为81.6 μg/ml,RSD为0.82%(n=6);胡椒碱平均含量为14.58 μg/ml,RSD为0.76%(n=6),结果表明该方法重复性良好。
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精密称取已知含量的同一批复方姜黄素自微乳样品(批号:20190612)9份,约28 mg,分别准确加入对照品溶液(其中,姜黄素10 μg/ml,胡椒碱5 μg/ml)为5、25、50 ml各3份,稀释定容至100 ml,按照“2.2”项下依法测定。结果显示,低、中、高3个浓度的姜黄素和胡椒碱溶液在空白自微乳中的回收率在98.0%~102.0%之间,结果表明回收率满足分析方法的要求,表明该方法准确性良好。
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分别取3批不同批号(20190604、20190608、20190612)的样品,按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液,依法测定峰面积,计算样品中姜黄素和胡椒碱的含量,见表1。
批号 姜黄素(μg/ml) 胡椒碱(μg/ml) 20190604 81.64 14.52 20190608 80.72 13.78 20190612 81.96 14.95 均值 81.34±0.056 14.42±0.068 RSD(%) 0.96 1.15 -
由于姜黄素和胡椒碱溶解度低,因此选择合适的表面活性剂置于透析液中,通过增加药物的溶解度来建立体外释放的漏槽条件。将不同浓度乙醇、吐温-80、十二烷基硫酸钠(SDS)加到磷酸盐缓冲溶液中,加入过量的药物,放入恒温水浴箱中振荡,72 h后离心取上清液进HPLC仪,计算药物饱和溶解度,见表2。
释放介质 溶解度(mg/ml) 姜黄素 胡椒碱 10% 乙醇 0.104 0.094 20% 乙醇 0.245 0.136 30% 乙醇 0.312 0.198 磷酸盐缓冲液 0.08×10−3 0.03×10−3 0.05%吐温-80 0.016 0.015 0.2%吐温-80 0.085 0.064 0.5%吐温-80 0.199 0.095 0.75%吐温-80 0.332 0.260 0.05%SDS 0.044 0.052 0.2%SDS 0.085 0.092 0.5%SDS 0.108 0.312 0.75%SDS 0.198 0.485 结果显示药物在0.75% 吐温-80中溶解度较大且稳定性良好,故选择加入0.75% 吐温-80的磷酸盐缓冲液作为漏槽条件。
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吸取3 ml复方自微乳溶液装于透析袋中,将透析袋置于200 ml释放介质中(n =3),于37.2 ℃,100次/min振荡的条件下进行药物体外释放行为的考察。分别于不同时间点取3 ml释放介质,过滤后使用HPLC测定药物浓度,同时补充相同体积的空白介质。根据HPLC法进行含量测定,计算药物浓度及累积释放率(Q)。结果见图3、图4。
由于肿瘤微环境呈酸性,pH值较低,本研究使用pH 4.8的释放介质来模拟肿瘤环境。由图可知,药物在pH 4.8酸性环境中释放更完全,表明该自微乳制剂中的药物能够在肿瘤部位释放。姜黄素在pH 4.8和pH 7.5释放介质中108 h累积释放率分别为94.85%和84.38%。胡椒碱比姜黄素释放更完全,可能由于胡椒碱在0.75% 吐温-80中的溶解度较高,因此释放量较多。胡椒碱在pH 4.8和pH 7.5释放介质中36 h累积释放率分别为92.85%和90.05%。36 h后,在释放介质中几乎测定不到胡椒碱,而姜黄素能够缓慢释放到108 h。结果表明自微乳制剂具有缓释特性,能够缓慢释放姜黄素。