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小檗碱是从毛茛科植物根茎中提取的一种季胺类异喹啉类生物碱,又称黄连素,为中药黄连的主要成分,临床多用其盐酸盐。盐酸小檗碱(BBR)的药理作用主要为清热解毒,属于传统的消化系统用药,临床上常用作抗菌剂,用于治疗细菌性痢疾、肠胃炎等肠道感染[1-2]。盐酸小檗碱溶解度低, 渗透性差,在口服给药时,还存在药物释放快、半衰期短、生物利用度低等缺陷。对于需要达到一定血药浓度为疗效前提的疾病来说,盐酸小檗碱的传统剂型还无法达到理想的治疗效果[3]。
纳米乳(NE)是由油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂组成的脂质纳米给药载体。粒径范围为1~100 nm,液滴呈大小均匀的球形,外观呈透明或半透明。纳米乳是一种热力学稳定的胶体分散体系,制备工艺简单,所需能量低甚至能够自发形成。纳米乳处方中油相和表面活性剂、助表面活性剂等组成成分的增溶效果,可以显著提升难溶性药物的溶解度。纳米乳小且均匀的粒径,可透过胃肠道的水化层,改善胃肠上皮细胞对药物的吸收。纳米给药体系具有较低的表面张力,可提高膜的通透性,促进药物吸收,提高其生物利用度[4]。纳米乳自身的独特优势,使其具有广泛的临床应用范围,可通过口服、透皮、注射等多种途径给药[5-6]。
本研究结合纳米乳剂型的优势,制备了盐酸小檗碱口服纳米乳(BBR-NE),采用伪三元相图法和星点设计-效应面法优化了制备工艺,并对其体外特性进行表征,从而解决盐酸小檗碱口服给药剂型溶解度差、生物利用度低等问题,提高药物的疗效,为小檗碱的临床应用提供新的给药剂型[4]。
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色谱柱:Hypersil BDS C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流动相:乙腈-0.05 mol/L与磷酸二氢钾(0.5 %三乙胺,磷酸调至pH=3)等度洗脱,比例:30∶70,流速1.0 ml/min,紫外检测波长345 nm,柱温25 ℃,进样量20 μl。
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精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg,用甲醇稀释定容于10 ml量瓶中作为储备液,用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液,按上述色谱条件进样测定。称取适量盐酸小檗碱纳米乳于10 ml 量瓶中,加入甲醇超声破乳30 min,10000 r/min离心5 min,取1 ml上清液于10 ml 量瓶中,加甲醇定容后过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液。方法学考察表明,盐酸小檗碱在1.00~100.00 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系,回归方程为:Y=37.059 X+16.952 (r=0.999 9)。低、中、高浓度的盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度分别为0.68 %、1.64 %、0.80 %,日间精密度分别为0.95 %、0.23 %、013 %,加样回收率RSD分别为1.42 %、0.70 %、1.57 %,表明该方法可用于纳米乳中盐酸小檗碱的含量测定。
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采用水滴加法制备盐酸小檗碱纳米乳。根据各类溶剂口服的安全性,筛选出以下各相备选溶剂,以BBR的溶解度为指标,确定各相最佳选择。
油相:Capryol 90、蓖麻油、橄榄油、大豆油、IPM、MCT;表面活性剂:吐温-80、APG、RH-40;助表面活性剂:1,2-丙二醇、PEG400、甘油。在具塞玻璃离心管中加入5 ml 上述各溶剂与过量盐酸小檗碱,置于恒温(25 ℃)振荡器振摇(100 r/min)72 h,得到以上各溶剂的饱和盐酸小檗碱溶液。取该饱和溶液于5000 r/min 条件下离心10 min,吸取1 ml上清液置于5 ml量瓶中,加甲醇稀释定容之后过0.45 μm微孔滤膜,按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。
结果如图1所示:油相中盐酸小檗碱的溶解度从大到小依次为:Capryol 90> MCT>蓖麻油>大豆油>橄榄油>IPM;表面活性剂的顺序为:吐温-80>APG>RH-40;助表面活性剂的顺序为:1,2-丙二醇>甘油>PEG400。即盐酸小檗碱在Capryol 90、吐温-80、1,2-丙二醇中溶解度最大,故选择Capryol 90为油相,吐温-80为表面活性剂,1,2-丙二醇为助表面活性剂。
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按照上述筛选的结果,将表面活性剂和助表面活性剂按照Km分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例混合,再取油相与此混合表面活性剂按照1∶9、2∶8;3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比配制成混合溶液,在磁力搅拌下滴加蒸馏水。观察溶液的颜色、乳光和澄明度,判断临界点,记录体系由浑浊变澄清时的加水量,计算临界点时各组分的比例。用Origin 10.0软件绘制伪三元相图,图中各临界点连线下方的区域即为纳米乳区,比较该区域面积大小,确定表面活性剂与助表面活性剂的质量比[9-11]。结果见图2。图中阴影部分即为成乳区,且当Km为2∶1时达到最大,故将Km定为2∶1。然而在实际制备纳米乳过程中,处方中各组分的不同比例会产生交互影响作用,因此,需要进一步采用星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳的制备工艺。
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选择对纳米乳影响较大的表面活性剂与助表面活性剂质量比Km(X1)和油相质量百分数(X2)作为考察因素,以多分散系数(PDI,Y1)和载药量(Y2)为考察指标。实验过程中发现当Km≥4时,大部分处方难以成乳;当Km≤1:2时,平均粒径>100 nm,故将Km范围定在1∶1至3∶1。当含油量增至0.5 g(50 %)时,平均粒径已接近100 nm,而当含油量范围在0.2~0.5 g(20 %~50 %)时,可将粒径控制在100 nm之内。根据单因素试验结果确定了Km的取值范围和油相质量百分数,并将两个评价指标进行归一化,将每个指标换算成0~1之间的“归一值(OD)”,并求算几何平均数,得总评“归一值”。计算公式如下: OD=(d1d2d3…... dk)1/k(k为指标数)。对取值越小越好的因素(PDI)和取值越大越好的因素(载药量)采用Hassan法[9]分别进行数学转换,求归一值dmin和dmax,公式如下:dmin=(Ymax−Yi)/(Ymax−Ymin);dmax=(Yi−Ymin)/(Ymax−Ymin)。采用2因素5水平星点设计优化处方,因素水平见表1,星点设计各组实验结果见表2。
因素 水平 −1.41 −1 0 +1 +1.41 X1(Km) 1∶1 1.29∶1 2∶1 2.71∶1 3∶1 X2(含油量/g) 0.2 0.24 0.35 0.46 0.5 编号 X1 X2 平均粒径
(l
/nm)Y1 Y2
(mg/g)dmin dmax OD 1 0 −1.41 46.32 0.29 0.72 0.54 0 0 2 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.367 0.558 3 −1 1 85.3 0.25 0.91 0.78 0.820 0.800 4 0 0 74.06 0.23 0.84 0.85 0.53 0.67 5 1 −1 76.58 0.35 0.72 0.21 0.01 0.04 6 1.41 0 59.8 0.36 0.76 0.12 0.15 0.13 7 1 1 101.4 0.38 0.78 0.04 0.34 0.12 8 −1.41 0 58.68 0.21 0.80 1.00 0.36 0.60 9 −1 −1 45.8 0.21 0.84 0.99 0.51 0.71 10 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 11 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 12 0 0 74.06 0.23 0.80 0.85 0.37 0.56 13 0 1.41 91.88 0.39 0.95 0.00 1.00 0.00 对X1进行二次式回归,得到方程R1=0.23+0.06 A+3.22×10−3B−2.75×10−3AB+0.03A2+0.03B2 ,(r=0.970 8),P<0.001;对X2进行二项式回归,得到方程R2=0.81−0.04A+0.06B+1.37×10−3AB−0.01A2+0.01B2,(r=0.913 5),P<0.05;对总归一值(OD)进行二项式回归,方程为OD=0.87−0.28A+0.03B−0.01AB−0.03A2−0.34B2,(r=0.910 2),P<0.05。以OD作为指标时,为使方程有效,对其进行方差分析,结果见表3。由表3可知,模型的P < 0.05,说明OD与X1、X2回归方程的非线性关系显著。回归方程的相关系数r=0.910 2,表明模型能说明91.02 %响应值的变化,拟合情况良好,回归方程具有较好的代表性,能准确预测实际情况[12]。
来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 1.48 5 0.18 5.88 0.0190 A-A 0.65 1 0.51 12.82 0.0090 B-B 7.73 1 3.600 0.15 0.7067 AB 4.40×10−5 1 0.016 8.74×10−3 0.9281 A2 6.32×10−3 1 0.37 0.13 0.7335 B2 0.83 7 0.026 16.41 0.0049 残差 0.35 3 0.058 纯误差 0.011 4 8.70×10-3 42.60 0.0017 总和 1.83 12 r 0.90 校正后r 0.82 C.V.% 35.29 信噪比 7.05 由拟合曲线可绘制X1、X2和OD值的关系,所绘制的三维效应面和二维等高线如图3所示。利用Design Expert 8.0软件的预测分析功能,根据拟合回归方程、三维效应面图和二维等高线图综合分析,得到最佳处方为X1= 0,X2=0.53,预测值OD为0.6214。故优化后的盐酸小檗碱纳米乳处方为:油相Capryol 90占体系的32.84 %,表面活性剂吐温-80占体系的33.90 %,助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %,水相占体系15.25 %[4]。
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对最优处方进行处方验证,结果如表4所示,预测值OD为0.6214,实际OD值为0.6510,偏差为4.76 %。表明预测值与实测值之间偏差较小,表明星点设计-效应面法(CCD-RSM)可用于筛选盐酸小檗碱纳米乳,筛选的处方预测良好、可靠。
评价指标 实测值 实际OD值 预测OD值 偏差(%) PDI 0.235±0.03 0.6510 0.6214 4.76 载药量(mg/g) 0.829 -
取适量BBR-NE于10 ml量瓶中,加甲醇超声破乳30 min,加甲醇稀释定容。4 ℃离心(10000 r/min,5 min),吸取1 ml上清液置于10 ml容量瓶中,加甲醇稀释定容后即得样品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样检测,计算纳米乳的载药量。测定结果如表5。
批号 盐酸小檗碱(mg/g) RSD(%) 201118 0.83±0.01 0.16 201119 0.83±0.02 0.21 201120 0.83±0.01 0.17 -
按照最优处方制备BBR-NE,稀释到适宜浓度,均匀分散后,采用马尔文激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径大小。粒径结果如图4和图5所示。所制备的BBR-NE粒径分布范围窄且呈正态分布,平均粒径为(68.85±8)nm,PDI为(0.245±0.03),表明该制剂粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。
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采用透射电镜(TEM)观察所制备的BBR-NE的形态。取适量BBR-NE滴于铜网上,自然干燥后滴加2 %磷钨酸(pH=7.4)溶液于铜网上负染3 min,晾干后置于透射电镜下观察其外观形貌。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图6所示。结果表明,BBR-NE呈均一圆整的球形,具明显层状结构,粒径大小约为68 nm。
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取制备好的盐酸小檗碱纳米乳2 ml,置于透析袋(分子截留值为7 000)中。于pH 1.2的人工胃液中释放2 h,再于pH 6.8的人工小肠液中释放22 h,溶出介质体积满足漏槽条件。将透析袋置于离心管中(含30 ml透析液),在恒温振荡器(37 ℃,100 r/min)中释放24 h,分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h定时取样1 ml,随后立即补加等温等体积释放介质。收集的样品过0.45 μm滤膜后,按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定,记录峰面积,计算累积释放度。释放曲线如图7所示,拟合方程如表6所示。
释药模型 拟合方程 r 零级动力学方程 Q=29.352 t–4.123 0.816 4 一级动力学方程 ln(1–Q)=92.395 t+0.240 0.962 3 希古契(Higuchi)方程 Q=20.952 t 1/2–6.735 0.889 6 由释放曲线可以看出,BBR-NE在人工胃液中(0~2 h)累积释放度很低(<20%),进入人工小肠液后(2~24 h)释放度逐渐上升,累积释放度达到80 %以上,表明该制剂具有一定缓释效果,其释药行为符合一级动力学方程。
Preparation and in vitro evaluation of berberine hydrochloride nanoemulsion oral drug delivery systems
doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202107081
- Received Date: 2021-07-24
- Rev Recd Date: 2022-01-05
- Available Online: 2022-01-20
- Publish Date: 2022-01-25
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Key words:
- berberine hydrochloride /
- nanoemulsion /
- pseudoternary phase diagram /
- central composite design-response surface method /
- in vitro release
Abstract:
Citation: | DAI Weili, JIN Ying, WANG Ting, TANG Xiaomeng, GU Qing. Preparation and in vitro evaluation of berberine hydrochloride nanoemulsion oral drug delivery systems[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 28-33, 43. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202107081 |