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中药知母(Anemarrhenae rhizoma)为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎,始载于《神农本草经》,具有清热泻火,肺热燥咳,滋阴润燥以及肠燥便秘等作用[1]。知母根茎中含有甾体皂苷类、黄酮类、双苯吡酮类、木质素类、多糖类和生物碱类等多种成分,甾体皂苷类是其首要药理活性成分。其中新芒果苷、芒果苷等黄酮苷类单体成分具有降低血糖的作用,知母皂苷BⅡ以及知母皂苷AⅢ等甾体皂苷类单体成分具有改善学习记忆、抗老年痴呆的作用[2]。
《中国药典》(2020年版)将芒果苷和知母皂苷BⅡ作为知母的质量评价指标[3],目前知母中芒果苷和新芒果苷的含量测定方法多采用高效液相-紫外检测法,而知母中另外一类重要的活性成分甾体皂苷类,由于不存在共轭结构、缺少紫外吸收,需通过衍生化技术将其转化成有紫外特征吸收的物质;但这种操作复杂、耗时,且准确度受衍生物稳定性的影响较大[4-5],因此紫外检测器并不适用于甾体皂苷类物质的检测。相比于紫外检测器,蒸发光散射检测器(ELSD)不要求化合物带有发色团或荧光基团,能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品;而且可以在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线和较高的分辨率。目前,已有应用HPLC-ELSD法对知母药材中单种成分或多成分含量测定的报道[6-7],但是所建立的方法往往分析时间较长,消耗试剂较多。
本文建立了一种快速、简便、准确的HPLC-ELSD方法,可同时测定知母中3个黄酮类成分(新芒果苷、芒果苷、宝藿苷Ⅰ)和2个甾体皂苷类成分(知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ)的含量,可为知母药材质量控制提供参考依据。
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精密称取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 对照品适量,置于5 ml容量瓶中,加50%乙醇溶液适量,超声溶解后,加入50%乙醇稀释并定容得到混合溶液,精密量取1 ml该混合溶液置于5 ml容量瓶中,加50%乙醇溶液定容,最终得含芒果苷464 μg/ml,新芒果苷482 μg/ml,知母皂苷BⅡ 1084 μg/ml,宝藿苷Ⅰ 106 μg/ml,知母皂苷AⅢ 200 μg/ml的混合对照品储备液,摇匀备用。
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取知母药材适量,干燥后粉碎,过3号筛得知母药材粉末。取药材粉末0.5 g,精密称定,置于50 ml具塞锥形瓶中,精密加入50%乙醇50 ml,称重,超声(功率300 W,60 Hz)处理30 min。超声结束后放置至室温后再次称定质量,使用50%乙醇补足所减失的质量,摇匀后滤过。取续滤液过0.22 μm微孔滤膜,作为供试品溶液。
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色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18柱(2.1×100 mm,2.7 μm);流动相为乙腈(A)-0.2%醋酸水(B);梯度洗脱程序设定为0~3 min,4%~10%A;3~5 min,10%A;5~7 min,20%A;7~11 min,20%~25%A;11~14 min,25%~90%A;14~18 min,90%A;18~19 min,90%~4%A;19~20 min,90%~4%A。柱温为30 ℃;流速为0.7 ml/min。蒸发光散射器的参数设定雾化气温度为40 ℃;漂移管温度为90 ℃;氮气体积流量为2.0 ml/min。供试品进样量为20 μl。混合对照品和供试品色谱图见图1,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留时间分别为4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min,各成分之间分离度均>1.5。
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精密量取1.6 ml混合对照品储备液和0. 4 ml 50%乙醇溶液,涡旋30 s混匀,后使用50%乙醇依次对半稀释。按上述色谱条件进行测定,以峰面积(A)的对数值与进样浓度(C)的对数值进行线性回归,考察结果见表1,表明知母中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。
成分 回归方程 线性范围(μg/ml) r 新芒果苷 lgA=1.8601×lgC−1.6874 24.1~386 0.9993 芒果苷 lgA=1.8445×lgC−1.3955 23.2~371 0.9986 知母皂苷BⅡ lgA=1.43×lgC−0.184 54.2~867.2 0.9956 宝藿苷Ⅰ lgA=1.4974×lgC+0.3364 5.3~84.8 0.9968 知母皂苷AⅢ lgA=1.4808×lgC+0.2387 10~160 0.9989 -
精密吸取混合对照品20 μl,按上述色谱条件连续进样6次,计算5种成分峰面积的RSD值,结果显示,新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%,表明仪器精密度良好。
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称取知母药材粉末0.5 g,精密称定,平行称取6份,按上述操作制备供试品溶液,进样测定,计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%,RSD分别为1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%,显示方法重复性良好。
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称取知母药材粉末0.5 g,按上述操作制备供试品溶液,分别于制备后0、2、4、6、8、12 h进样测定,结果显示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面积RSD分别为:2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%,说明样品在12 h内稳定。
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称取知母药材粉末0.25 g,精密称定,平行称取6份,分别加入与知母药材粉末各成分含量相近的混合对照品溶液,按上述操作制备供试品溶液,进样测定,计算加样回收率。结果见表2,知母中5种成分的平均回收率为101.8%~105.0%,表明该方法准确度良好。
成分 原有量
(m/mg)加入量
(m/mg)测得量
(m/mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)新芒果苷 4.06 4.80 9.01 103.2 101.8 1.5 4.11 4.80 8.99 101.9 4.19 4.80 9.07 101.8 3.99 4.80 8.87 101.8 4.07 4.80 9.04 103.5 4.09 4.80 8.83 98.69 芒果苷 2.08 2.13 4.26 102.8 102.2 2.5 2.10 2.13 4.20 98.73 2.14 2.13 4.39 105.3 2.04 2.13 4.27 10.0 2.08 2.13 4.19 99.07 2.09 2.13 4.28 102.7 知母皂苷BⅡ 18.45 10.80 29.88 105.77 104.91 1.28 18.65 10.8 29.93 104.5 19.04 10.80 30.59 107.0 18.14 10.80 29.55 105.6 18.50 10.80 29.65 103.2 18.59 10.80 29.75 103.4 宝藿苷Ⅰ 0.17 0.21 0.39 103.4 102.0 1.8 0.17 0.21 0.39 102.2 0.18 0.21 0.39 102.6 0.17 0.21 0.39 100.9 0.17 0.21 0.39 98.57 0.17 0.21 0.39 104.1 知母皂苷AⅢ 0.87 1.17 2.07 103.4 103.2 1.0 0.88 1.17 2.07 102.7 0.90 1.17 2.08 101.7 0.86 1.17 2.05 102.5 0.87 1.17 2.08 104.3 0.88 1.17 2.09 104.7 -
称取知母药材粉末0.5 g,精密称定,按上述操作进样测定,计算各成分含量,最终计算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。
Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD
doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070
- Received Date: 2021-09-13
- Rev Recd Date: 2022-01-05
- Available Online: 2022-01-20
- Publish Date: 2022-01-25
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Key words:
- high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector /
- Anemarrhenae Rhizoma /
- content determination
Abstract:
Citation: | DAI Jianying, YOU Wei, TIAN Tian, HONG Zhanying. Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(1): 34-37. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202109070 |