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槟榔为棕榈科植物槟榔的干燥成熟种子，居“四大南药”之首，入药最早记录在《李当之药录》中[1]，具有行气利水，消积杀虫，截疟等功效，用于治疗寄生虫病、关节炎、青光眼、水肿、脚气、疟疾等疾病[2]。槟榔主要含生物碱、多酚、多糖、脂肪酸、鞣质、氨基酸、三萜类、矿物质、槟榔红色素、粗纤维、油脂、维生素等多种物质[3-4]。药理研究表明其具有抗氧化、抗抑郁、抗炎、抗寄生虫、抗老化、清除自由基、修护神经系统、抗疲劳、改善胃肠功能、治疗糖尿病、抑菌等作用[5]，文献报道槟榔的抗氧化作用与其含有的多酚类物质有关[6-12]。
课题组前期的研究发现，槟榔醇提取物能显著增强H9c2细胞的耐缺氧能力[13]，进行高原实地研究发现，槟榔多酚能够显著改善高原实地缺氧大鼠的血气指标，能提高其肝、肺、心组织中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶活性，降低其肝、肺、心组织中丙二醛的含量，槟榔多酚提取物的抗缺氧作用与消除过量的氧自由基，减轻脂质过氧化和氧化应激损伤有关[14-15]。同时，课题组进一步研究还发现，槟榔多酚提取物能预防高原肺水肿的发生，该作用与其减轻肺水肿、维持肺泡毛细血管通透性、改善氧化应激损伤及病理损伤有关[16]。由此可见，将槟榔多酚提取物开发为新的抗高原缺氧药物具有很大的潜力。槟榔多酚成分复杂，文献报道槟榔多酚中含有儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸、没食子酸等，另外药理研究表明，儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸具有抗氧化、抗炎等作用[17-21]，基于此，本研究采用紫外分光光度法对槟榔多酚提取物中总多酚的含量进行测定；并建立槟榔多酚提取物中儿茶素类成分的HPLC测定方法，以期为槟榔多酚提取物的质量控制和标准制定提供实验依据。
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槟榔由联勤保障部队第九四〇医院药剂科中药房提供，没食子酸（上海源叶生物科技有限公司，批号Y19M8C36143，质量分数≥98%）、儿茶素（中国食品药品检定研究院，批号110877-201604，质量分数99.2%）、表儿茶素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号K2009336，质量分数≥98%）、原儿茶酸（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-20110310，质量分数99.78%)，甲醇、乙腈均为色谱纯；酒石酸钠钾、七水合硫酸亚铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、甲酸均为分析纯。
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Ultimate 3000DGLC高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技）、超微量分光光度计NP80（德国IMPLEN公司），电子分析天平（上海梅特勒-托利多有限公司），超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），多功能动态热回流提取浓缩机（上海天巨源设备有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）。
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取槟榔药材20 kg，粉碎后过3号筛，分别加入10倍、8倍、6倍量的80%乙醇，80 ℃加热回流提取3次，时间分别为2、1.5、1.5 h，合并提取液，过滤，滤液减压回收乙醇，得浸膏。浸膏加入等体积水悬浮，加入到已经处理好的AB-8大孔吸附树脂柱上，纯水洗脱除杂，20%乙醇洗脱，收集20%洗脱液，减压回收乙醇得浸膏，真空60 ℃干燥，制得干燥槟榔多酚提取物1，命名为：BLDF202001。大孔吸附树脂经80%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收乙醇得浸膏，真空60 ℃干燥，制得干燥槟榔多酚提取物2，命名为：BLDF202002。提取物2加水悬浮，加入到已经处理好的聚酰胺层析柱上，纯水洗脱除杂，80%乙醇洗脱，收集80%洗脱液，减压回收乙醇得浸膏，真空60 ℃干燥，制得干燥槟榔多酚提取物3，命名为：BLDF202003。
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精密称取没食子酸对照品5 mg，置于5 ml容量瓶中，加蒸馏水超声使其充分溶解，定容，配制成1 mg/ml的对照品溶液。
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分别精密称取各对照品适量，加甲醇制成含儿茶素1.92 mg/ml、表儿茶素2.46 mg/ml和原儿茶酸1.12 mg/ml的单一对照品储备液。
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精密称取槟榔多酚提取物10 mg，置于10 ml容量瓶中，加乙醇超声，使其充分溶解，定容，配制成1 mg/ml的供试品溶液。
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精密称取槟榔提取物50 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，用甲醇超声使其充分溶解，定容，配制成浓度为5 mg/ml的供试品储备液。精密吸取供试品储备液2 ml，置于5 ml容量瓶中，用50%的甲醇定容至刻度，摇匀，临用前过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
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采用酒石酸亚铁法测定槟榔多酚的含量[14]，精密吸取“2.2.1”项下的没食子酸对照品溶液各0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 ml，置于5 ml容量瓶中，加蒸馏水至1 ml，再加入酒石酸亚铁溶液1 ml，用pH 7.5的磷酸缓冲溶液定容，混匀，静置15 min，以蒸馏水为空白参照，在540 nm处测定吸光度值。以吸光度值（A）为纵坐标，浓度（X，μg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，得没食子酸对照品的线性回归方程：A=12.44X+0.0731，r=0.999 4，表明没食子酸对照品溶液在9.8~58.8 μg/ml范围内线性关系良好。
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精密吸取没食子酸对照品溶液0.1 ml，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，重复测定6次，没食子酸对照品溶液的吸光度RSD值为0.40%，表明该方法精密度良好。
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取同一供试品溶液（BLDF202001）6份，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，槟榔提取物中总多酚的吸光度RSD值为1.1%，表明该方法重复性良好。
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取同一供试品（BLDF202001）10 mg，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、5、10、15、30 min和1、2、4、8、12、24 h后，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，槟榔提取物中总多酚吸光度的RSD值为2.8%，表明该供试品在24 h内稳定性良好。
取同一供试品溶液（BLDF202001）0.1 ml，按“2.3.1”项下方法分别于7、9、11、13、15、17、21 min测定吸光度，槟榔提取物中总多酚吸光度的RSD值为0.93%。表明该供试品溶液在21 min内显色稳定，提示总多酚含量测定应等待7 min之后，在21 min之前完成。
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取同一批（BLDF202001）已知含量的槟榔多酚提取物，平行6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液0.1 ml，置于5 ml棕色容量瓶中，加入没食子酸对照品溶液0.1 ml，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，没食子酸的加样回收率为98.44%，RSD值为1.4%。。
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吸取0.3 ml的供试品溶液，按“2.3.1”项下方法测定吸光度，平行测定3次，计算总多酚的含量。3批槟榔提取物中总多酚的含量见表1。
表 1 3批槟榔多酚提取物中总多酚的含量（n=3）
批号 总多酚含量（%） BLDF202001 51.45 BLDF202002 51.82 BLDF202003 52.70 -
色谱柱：AcclaimRSLC120 C18柱（3 mm×150 mm，3 µm）；流动相为：乙腈（A）-0.3%甲酸溶液（B），梯度洗脱程序见表2；检测波长：280 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μl。
表 2 梯度洗脱程序
时间（t/min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0~5 5~10 95~90 5~7 10~15 90~85 7~9 15~20 85~80 9~12 20~5 80~95 -
分别精密吸取50%的甲醇，混合对照品溶液，供试品溶液各5 μl，按“2.4.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。结果表明，各峰分离度均较好，各组分的分离度大于1.5，符合定量分析要求，理论板数以儿茶素计，不低于6 000。其中原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素的保留时间分别为4.273、7.017和8.433 min，色谱图见图1。
图 1 各成分的HPLC色谱图
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分别精密吸取“2.2.2”项下儿茶素对照品储备液0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 ml；表儿茶素储备液0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6 ml；原儿茶酸储备液0.005、0.010、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 ml，用50%的甲醇定容于5 ml容量瓶中，配制成不同浓度的对照品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件进样，以对照品的浓度（X，μg/ml）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，结果见表3，表明儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸分别在相应的线性范围内线性关系良好。
表 3 槟榔多酚提取物中儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的线性方程
成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 儿茶素 Y=0.0436X−0.0201 0.999 7 3.84~307.2 表儿茶素 Y=0.0415X+0.0395 0.999 8 4.92~295.2 原儿茶酸 Y=0.0833X+0.0113 0.997 7 1.12~89.6 -
取各成分浓度约为20 μg/ml的混合对照品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件连续进样6次，记录峰面积。儿茶素、表儿茶素和原儿茶酸峰面积的RSD值分别为0.65%、0.96%、2.3%，表明仪器精密度良好。
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取同一供试品溶液（BLDF202001）按“2.4.1”项下的色谱条件分别于0、4、8、12、18 h进样分析，记录峰面积。儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸峰面积的RSD值分别为1.1%、1.6%、1.1%，表明供试品溶液在18 h内稳定。
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取槟榔多酚提取物（BLDF202001）约50 mg，精密称定，平行6份，分别按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件测定，计算供试品中儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的质量分数分别为5.9%、2.4%、0.10%，RSD值分别为1.0%、2.1%、2.1%，表明该方法的重复性良好。
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精密称取已知含量的槟榔多酚提取物（BLDF202001）25 mg，置于5 ml容量瓶中，共6份，分别精密加入一定量的儿茶素、表儿茶、原儿茶酸对照品溶液，分别按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件测定，计算回收率和RSD值。儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的平均回收率为99.17%、101.67%、101.18%；RSD值分别为2.5%、1.2%、1.8%，表明该方法准确度良好。
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取3批按“2.2.4”项下方法制备的供试品溶液，按“2.4.1”项下的色谱条件分别测定。3个批号的供试品中儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的含量见表4。
表 4 3批槟榔多酚提取物中儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的百分含量（%, n=3）
批号 儿茶素 表儿茶素 原儿茶酸含量 BLDF202001 5.90 2.40 0.10 BLDF202002 0.52 0.43 / BLDF202003 1.30 0.77 /
Determination of total polyphenols and catechins in betel nut polyphenol extract
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摘要:
目的 建立槟榔多酚提取物中总多酚和儿茶素类含量的测定方法，为槟榔多酚提取物的质量控制提供参考。 方法 采用紫外分光光度法对槟榔提取物中总多酚的含量进行测定；高效液相色谱法对儿茶素类物质进行含量测定。 结果 紫外分光光度法测定槟榔提取物中总多酚含量在9.8~58.8 μg/ml范围内线性关系良好，平均加样回收率为98.44%，RSD为1.4%；在高效液相色谱测定中，儿茶素、表儿茶素和原儿茶酸3种主要成分完全分离，在各自范围内线性关系良好，平均加样回收率为99.17%~101.67%，RSD为1.2%~2.5%。 结论 建立的含量测定方法简单、稳定可靠，可用于槟榔多酚提取物的定量分析，为槟榔多酚提取物的质量控制提供实验依据。 Abstract:Objective To establish a method for the determination of total polyphenols and catechins in betel nut polyphenols extract, and provide reference for the quality control of betel nut polyphenols extract. Methods The content of total phenol in betel nut extract was determined by ultraviolet spectrophotometry. The content of catechins was determined by HPLC. Results The linear range of total polyphenols in betel nuts extract was 9.8~58.8 μg/ml. The three components of catechin, epicatechin and protocatechuic acid were completely separated by HPLC, and the linear relationship was good in their respective ranges, with the recoveries between 99.17% and 101.67%, the RSD between 1.2% and 2.5%. Conclusion The established method is simple, stable and reliable, which could be used for the quantitative analysis of betel polyphenol extract, and provide experimental basis for the quality control of betel polyphenol extract. -
Key words:
- betelnut total polyphenols /
- catechins /
- HPLC /
- UV spectrophotometry
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糖尿病患者长期的高血糖环境显著影响自主神经系统，导致消化系统功能紊乱，表现为腹胀、便秘或腹泻等一系列消化不良的现象[1]。结肠镜检查作为评估结直肠疾病的关键工具，特别是在早期结肠癌的检测中扮演着不可或缺的角色。然而，不充分的肠道准备工作会直接影响检查的有效性。临床实践中，3 000 ml复方聚乙二醇电解质散剂被广泛采纳作为肠道准备的标准方案[2]。但对于糖尿病患者群体，一方面，自主神经损害减弱了胃肠道的正常蠕动；另一方面，部分患者接受的胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1Ra）治疗进一步延缓了胃排空速度。在这两重因素共同作用下，糖尿病患者面临肠道清洁不佳的难题，严重影响了结肠镜检查的质量和病变检出率[3, 4]。胆宁片能改善消化过程，减少肠道负担，进一步促进排便[5]，可显著优化糖尿病患者在接受结肠镜检查前的肠道准备状态，进而提升检查的准确性和舒适度。既往曾有研究报道胆宁片可改善2型糖尿病患者的便秘，但未见探讨其在肠道准备中的作用[6]。本研究旨在探索将胆宁片与复方聚乙二醇电解质散的预处理方案应用于糖尿病患者的结肠镜检查，评估胆宁片对提高肠道准备合格率的应用效果，现报告如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2022年11月至2024 年5月在海军军医大学第一附属医院内分泌科住院并行结肠镜检查的100例2型糖尿病患者为研究对象。根据是否使用GLP-1Ra类降糖药物（使用GLP-1Ra类药物共22名患者）进行分层随机，分为两组，每组各50例。所有研究对象均签署了知情同意书，本研究已通过我院伦理委员会批准。
纳入标准：①患者必须满足世界卫生组织（WHO）确立的2型糖尿病确诊标准；②研究对象的年龄≥30岁；③日常生活能力评估，即Barthel指数得分，须高于60分。④文化程度高中及以上。
排除标准：①糖尿病病情波动不定，且伴有如心脑血管突发事件等严重并发疾病的患者；②正处于糖尿病急性并发症发作期的患者；③患有急性胆囊炎、急性化脓性胆囊炎或任何急腹症状况、炎症性肠病、消化道梗阻、腹腔手术史、肝硬化、严重肾功能不全、帕金森病、心力衰竭的患者；④存在精神心理性疾病病史或近1周服三环类药物的患者；⑤过度肥胖（BMI>30）的患者[7-9]。
1.2 方法
1.2.1 对照组
①患者教育与心理准备：在肠道准备阶段之初，对参与者进行详尽的教育宣讲，着重说明肠道准备的必要性及其实施步骤，旨在减轻或消除患者面对结肠镜检查时可能产生的焦虑感，营造积极合作的氛围[10]。②膳食管理：要求受试者在结肠镜检查前1 d采用低残渣、半流质饮食模式，晚餐只可吃易消化的半流质食品，避免摄入富含纤维的食物。于检查当日清晨开始禁食，以减少肠道内容物，便于后续检查顺利进行[11]。③药物准备：在进行结肠镜检查前10 h，受试者应分次服用完68.56 g复方聚乙二醇电解质散（组成包括聚乙二醇4 000、无水硫酸钠、氯化钠、氯化钾和碳酸氢钠），药物需溶解在1 000 ml温水中。检查前6 h，受试者再次分次服用完137.12 g复方聚乙二醇电解质散，药物溶解在2 000 ml温水中，以确保肠道得到充分的清洁准备[12]。
1.2.2 实验组
在对照组的基础上从检查前2 d开始，口服胆宁片每日3次，每次5片，共服2 d，其余常规准备方案同对照组。
1.3 观察指标
肠道准备质量评估：采用波士顿量表（Boston Bowel Preparation Scale，BBPS），由肠镜室医生评估各组肠道准备质量。该量表将全结肠分为3个主要的结肠区域，分别为右半结肠（盲肠和升结肠）、横结肠（肝曲到脾曲的部分）、左半结肠（降结肠、乙状结肠和直肠）。每个区域的清洁度分数如下：0分：由于无法清除的固体或液体粪便导致整段肠黏膜无法观察；1分：由于污斑、混浊液体、残留粪便导致部分肠黏膜无法观察；2分：肠道黏膜观察良好，但残留少量污斑、混浊液体、粪便；3分：肠道黏膜观察良好，基本无残留污斑、混浊液体、粪便。每个区域的评分范围是从0～3分，总评分范围是0～9分，最终得分<6分为差，6～7分为良，8～9分为优。总评分越高表明肠道准备质量越好，有助于提高结肠镜检查的准确性和效率[13, 14]。
1.4 统计学方法
采用 SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（均数±标准差）表示，组间比较用t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数和四分位数区间表示，组间比较用非参数检验。计数资料（n, %）用卡方检验比较，以P<0.05 为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 一般资料
本研究共收集100名2型糖尿病患者，随机分为对照组和实验组，每组各50名，对照组和实验组各有11例患者使用GLP-1Ra类降糖药物。其中，对照组平均年龄（56.38±9.44）岁，男性占比72.0%（36/50），平均糖尿病病程（11.26±6.59）年，BMI为（24.21±1.76）kg/m2，糖化血红蛋白为（7.93±1.21）%；实验组平均年龄（57.42±9.99）岁，男性占比68.0%（34/50），平均病程（9.52±7.23）年，BMI为（24.31±2.47）kg/m2，糖化血红蛋白为（7.89±1.21）%。两组间基础资料对比，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2 BBPS评价两组患者肠道准备质量
根据BBPS评分，评分为“优”的，实验组占66%，显著高于对照组的28%。评分为“良”的，两组都占30%。评分为“差”的，实验组仅4%，远低于对照组的42%。实验组平均分为（7.44±1.03），对照组为（5.58±1.98）。实验组在肠道准备方面表现明显优于对照组，且差异具有统计学意义（P<0.001），见表1。
表 1 BBPS评价肠道准备情况组别 评分 t值 P值 优 良 差 卡方值 P值 对照组 5.58±1.98 −0.589 <0.001 14
（28%）15
（30%）21
（42%）23.377 <0.001 实验组 7.44±1.03 33
（66%）15
（30%）2
（4%）2.3 BBPS评价两组使用GLP-1Ra药物的患者肠道准备质量
对照组和实验组各有11例患者使用GLP-1Ra类降糖药物，对使用GLP-1Ra的糖尿病患者单独进行比较：实验组的BBPS平均得分为（6.64±0.81），高于对照组的平均得分（3.64±0.92）；实验组BBPS评分有1人被评为优，10人被评为良，而对照组全部为差。因两组样本量过小，无法进行统计学分析，但以上结果仍提示在使用了GLP-1Ra的情况下，实验组的肠道准备质量优于对照组。
3. 讨论
在进行结肠镜检查前的肠道准备中，糖尿病患者遇到的挑战尤为显著，这与他们复杂的生理病理特征密切相关。血糖水平对胃部活动和排空有直接调控作用。高血糖状态下，胃排空速度受到抑制，造成胃肠道的感觉与运动功能紊乱。病程较长的糖尿病患者可能存在神经病变，尤其是在消化系统方面导致一系列消化不良的症状，如腹胀、便秘或腹泻，影响胃肠道平滑肌的健康与功能，从而影响肠道准备的充分性[15]。
结肠镜检查对于评估结直肠疾病至关重要，尤其在早期结肠癌筛查中发挥关键作用。然而，若肠道准备不充分，可能会延长检查时间并增加并发症风险，直接影响检查的准确性和安全性[16]。尽管3 000 ml复方聚乙二醇电解质散剂是肠道准备的常用标准方案，但糖尿病患者因自主神经受损和使用GLP-1Ra药物治疗的影响，胃肠道蠕动减慢，胃排空延迟，使得肠道清洁难度增加，将直接影响结肠镜检查的效果[17]。
本研究结果显示，胆宁片能够显著改善糖尿病患者的肠道准备效果，尤其是在使用GLP-1Ra的患者中，作用更为明显。胆宁片是一种中药制剂，含有大黄、虎杖、青皮、陈皮、郁金和山楂等成分。山楂促进消化液分泌，增强胃肠蠕动，帮助消化油腻食物，同时还有一定的降脂作用；大黄具有较强的泻下作用，可以清除体内积热，改善便秘症状，并且有解毒、清热的效果；陈皮燥湿化痰，对脾胃功能不佳、消化不良有一定的辅助治疗效果；虎杖具有解毒、活血化瘀的功效，对于体内瘀血、炎症有一定的缓解作用；青皮疏肝理气，适用于肝气郁结引起的消化不良等症状。几种成分共同作用能有效清热、促进肠道运动、疏肝解郁、促进消化酶分泌、加速食物消化、减少肠道负担，同时增强胆汁分泌，帮助脂肪乳化，软化大便，利于排便[18]。
本研究同样面临一些局限性：第一，样本规模较为局限；第二，在探究糖尿病患者治疗方案时，未能细致分类伴随病症及所用降糖药物，此疏忽可能模糊了药物效能与不良反应情况；第三，缺乏对患者依从性的详细记录。未来仍需增加样本量、完善干预措施、评估相关药物以进一步验证和完善方案。
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表 3 槟榔多酚提取物中儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的线性方程
成分 回归方程 r 线性范围（μg/ml） 儿茶素 Y=0.0436X−0.0201 0.999 7 3.84~307.2 表儿茶素 Y=0.0415X+0.0395 0.999 8 4.92~295.2 原儿茶酸 Y=0.0833X+0.0113 0.997 7 1.12~89.6 
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表 4 3批槟榔多酚提取物中儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸的百分含量（%, n=3）
批号 儿茶素 表儿茶素 原儿茶酸含量 BLDF202001 5.90 2.40 0.10 BLDF202002 0.52 0.43 / BLDF202003 1.30 0.77 /
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