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光热疗法（photothermal therapy，PTT）是近年来新兴的肿瘤治疗技术，相比传统的手术治疗、化疗和放疗，具有更小的副作用[1-4]。PTT包含2个要素，即近红外光和光敏剂。近红外光具有较强的组织穿透能力[5-6]，照射后肿瘤组织中的光敏剂可将光能转换为热能，当温度达到42 ℃以上时，可导致肿瘤细胞的凋亡或坏死[7]。
硫化铜（CuS）纳米粒是一种优良的光敏剂。相比广泛研究的金纳米粒，CuS纳米粒具有制备成本低的优点，特别是其具有稳定的光热效应。CuS纳米粒的近红外吸收主要源于Cu2+的d-d能级跃迁，因而其光热效应不受粒径、形状和生理环境的影响，可在肿瘤组织中维持稳定的光热效应[8]。CuS纳米粒具有良好的生物相容性，细胞毒性较低，但与其他多数无机或金属纳米粒同样存在体内发生蓄积的风险，长期使用的安全性未知。肾脏是处理纳米粒的主要器官之一，报道显示，直径小于6 nm的纳米粒可被肾脏滤过，从而使大部分纳米粒经尿液排出体外[9-10]。
因此，本文拟制备粒径小于6 nm的CuS纳米粒，通过深入分析各因素，获得最优的处方工艺，进一步通过光热曲线和细胞实验进行体外评价。
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Litesizer500纳米粒度及Zeta电位分析仪（奥地利Anton Paar公司）；JEOL 2010透射电子显微镜（日本电子株式会社）；MDL-H-980-5W上转换发光用激光器（长春新产业光电技术有限公司）；RX-300红外热成像仪（广东省东莞市不凡电子有限公司）；NVMT SPARTAN夜视仪（梅越电子商务有限公司）；DV215CD精密分析天平（美国Ohaus Discovery公司）；HWS 26电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；H1850R台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；明澈-D24UV纯水/超纯水一体化系统（德国Merck Millipore公司）
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二水合氯化铜（CuCl2·2H2O）、九水合硫化钠（Na2S·9H2O）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；聚维酮（polyvinylpyrrolidone，PVP，MW=10 000，默克生命科学有限公司）；细胞增殖及毒性检测试剂盒（CCK-8，北京索莱宝生物技术有限公司）；RPMI1640培养液，DMEM不完全高糖培养液，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）（江苏凯基生物技术有限公司）；透析袋（MWCO 14000，美国Viskase公司）；去离子水（实验室自制）。
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参考文献确定CuS纳米粒基本处方[11]：取100 μl CuCl2溶液（300 mmol/L）加入10 ml PVP溶液（100 mg/ml）中，再加入30 μl Na2S溶液（1 mol/L），室温磁力搅拌5 min后，转入90 ℃水浴继续磁力搅拌15 min，测定其粒径和多分散指数（polydispersity index，PDI）。
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考察搅拌时间、水浴温度、水浴时间、PVP浓度、CuCl2与Na2S摩尔比（Cu:S）对CuS纳米粒粒径和PDI的影响。
表1结果显示，搅拌时间越长，水浴温度越低，Cu:S越小，则CuS纳米粒粒径呈减小趋势。水浴时间越长，PVP浓度越大，粒径显示了先增大后减小的趋势。综合各因素不同水平对应的纳米粒粒径，发现水浴温度、PVP浓度和Cu:S易产生较大的粒径波动，表明其可能是影响CuS纳米粒粒径的主要因素。另外，各因素不同水平对PDI的影响均不显著。因此，根据单因素考察结果，确定搅拌时间为5 min，水浴时间为15 min，以粒径为评价指标，采用星点设计-响应面法进一步优化水浴温度、PVP浓度、Cu:S三个因素。
表 1 CuS纳米粒单因素考察结果（n=3）
因子 水平 粒子大小 (nm) 多分散指数 搅拌时间 (min) 3 18.13±5.42 0.27±0.01 5 16.12±1.29 0.27±0.01 7 15.40±1.86 0.26±0.01 水浴温度 (℃) 80 14.61±4.35 0.27±0.01 90 16.12±1.29 0.27±0.01 100 22.85±1.71 0.26±0.01 水浴时间 (min) 10 18.12±6.31 0.25±0.02 15 16.12±1.29 0.27±0.01 20 21.30±5.71 0.24±0.01 PVP浓度 (mg/ml) 80 25.56±4.40 0.27±0.01 100 16.12±1.29 0.27±0.01 120 20.72±3.38 0.25±0.02 Cu:S 3:1 15.08±2.92 0.26±0.01 2:1 20.25±1.16 0.27±0.01 1:1 16.12±1.29 0.27±0.01 1:2 11.34±3.08 0.25±0.02 1:3 11.27±2.88 0.25±0.02 -
在单因素考察的基础上，采用中心复合响应面设计（central composite design, CCD），选择上述筛选出的三个因素：水浴温度（X1）、PVP浓度（X2）、Cu:S（X3）为考察因素，粒径（Y1）为评价指标，进行三因素五水平的星点设计。
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星点实验设计的因素、水平及代码值如表2所示，实验设计与结果如表3所示。
表 2 星点设计因素和水平
因子 水平 −1.682 −1 0 +1 +1.682 X1 (℃) 60.00 70 85 100 110.20 X2 (mg/ml) 66.36 80 100 120 133.64 X3 0.25 0.33 1.67 3 4 表 3 星点设计实验安排表和结果(n=3)
序号 X1 (℃) X2 (mg/ml) X3 Y1 (nm) 1 −1 −1 −1 13.04 2 +1 −1 −1 14.23 3 −1 +1 −1 14.48 4 +1 +1 −1 13.39 5 −1 −1 +1 24.37 6 +1 −1 +1 27.30 7 −1 +1 +1 18.62 8 +1 +1 +1 20.73 9 −1.682 0 0 18.87 10 +1.682 0 0 15.62 11 0 −1.682 0 24.01 12 0 +1.682 0 17.06 13 0 0 −1.682 13.92 14 0 0 +1.682 15.11 15 0 0 0 18.81 16 0 0 0 16.84 17 0 0 0 16.14 18 0 0 0 17.89 19 0 0 0 16.20 20 0 0 0 16.30 -
采用Design expert 8.0.6，将各影响因素（X1、X2、X3）和评价指标（Y1）进行二次多项式模型拟合，方程如下：
Y1=4.15−0.0086X1−0.18X2+0.42X3−0.045X1X2+0.064X1X3−0.17X2X3+0.043X12+0.17X22−0.22X32
此时二项式模型达显著水平（P=0.006 5），r=0.9129，说明该方程与实际情况拟合度良好。
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根据表3结果，绘制水浴温度（X1）、PVP浓度（X2）及Cu:S（X3）对粒径（Y1）的响应面。
根据图1的数据进行分析，确定最优参数为：水浴温度100 ℃，PVP浓度为100 mg/ml，Cu∶S为1∶3。按照最优处方工艺平行制备3份样品，粒径分别为9.37、12.39、9.84 nm，平均值为（10.53±1.63）nm，预测值为10.86 nm，根据公式：偏差=（预测值−实际值）/预测值×100%，得出实际值与预测值的偏差为3.04%，说明建立的数学模型较为可靠，预测性良好。
图 1 温度（X1）、PVP浓度（X2）、Cu:S（X3）对粒径值（Y1）的三维响应面图
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取CuS纳米粒适量，加去离子水稀释10倍，取5 μl稀释后的CuS纳米粒，滴于缚有碳支持膜的铜网上，铜网下铺滤纸，用于吸去多余的液体。自然晾干后，用透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）观察纳米粒形态。图2结果显示，CuS纳米粒形态圆整，分散性良好，经Image J软件测量，平均粒径为（3.10±0.81）nm。
图 2 CuS纳米粒TEM图
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将CuS纳米粒分别放置在4 ℃与25 ℃条件下，定时测定粒径。经统计发现，20 d内CuS纳米粒的粒径变化没有明显差异，说明所制的CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性（图3）。
图 3 CuS纳米粒分别在4 ℃与25 ℃下的粒径变化曲线（n=3）
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⑴近红外光功率密度：考察CuS纳米粒浓度为50 μg /ml条件下，不同近红外光功率密度（0.5 、1、1.5、2 W/cm2）对CuS纳米粒光热效应的影响。采用980 nm的近红外激光器，红外热成像仪每隔30 s记录温度，记录10 min，平行测量3组，绘制升温曲线，同时，以水在相同条件下做对照。随着功率密度增大，CuS纳米粒升温加快（图4），而在相同条件下，去离子水的升温速率显著低于CuS纳米粒（图5）。
图 4 CuS纳米粒在不同功率密度下的升温曲线（n=3）
图 5 水在不同功率密度下的升温曲线（n=3）
⑵CuS纳米粒浓度：考察在1 W/cm2功率密度下，CuS纳米粒不同浓度（25 、50 、150 、200 μg/ml）对其光热效应的影响，并以去离子水为空白对照。采用980 nm的近红外激光器，红外热成像仪每隔30 s记录温度，记录10 min，平行3组，绘制升温曲线。结果显示，在相同功率密度条件下，CuS纳米粒浓度越大，升温速率越大（图6）。
图 6 CuS纳米粒在不同浓度下的升温曲线（n=3）
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采用980 nm近红外激光器，选取CuS浓度为50 μg /ml，激光功率密度为1 W/cm2，将激光器“开启-关闭”4个循环，即照射10 min后停止，温度恢复至室温后再次开启照射。如图7所示，CuS纳米粒经近红外光照射4个循环的温度变化曲线基本一致，即反复照射不影响CuS纳米粒的光热效应，表明其具有良好的光热稳定性。
图 7 CuS纳米粒经近红外光照射4个周期的温度曲线
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考察CuS纳米粒对正常人肾小管上皮细胞（HK2）以及乳腺癌细胞（4T1）的毒性。实验前，取适量CuS纳米粒放入透析袋（MWCO=14000）中，透析24 h以除去杂质。取对数生长期细胞，调整HK2细胞浓度为1×105 cells/ml，4T1细胞浓度为5×104 cells/ml，将100 μl/孔的细胞悬液接种于96孔细胞培养板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中。孵育24 h后，每孔加入10 μl不同浓度的CuS纳米粒，使终浓度分别为3.1、6.3、12.5、25、50、100、150及200 μg/ml，继续培养24 h后，去除96孔板中培养基，加PBS洗涤2次（以排除Cu2+对CCK-8试剂的影响），每孔加入100 μl培养基及10 μl CCK-8试剂，于培养箱中孵育4 h后，用酶标仪测定450 nm处的吸光度值（A）。参照公式：
细胞活力（%）=(A加药−A空白)/(A0加药−A空白)×100%，
计算细胞活力百分率，其中A加药指具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度，A空白指具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度，A0加药指具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
结果显示（图8），CuS纳米粒分别在100 μg/ml及150 μg/ml浓度范围内，对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞均无显著的细胞毒性（细胞活力大于80%），表明CuS纳米粒具备良好的生物相容性。
图 8 CuS纳米粒浓度对细胞活力影响
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考察CuS纳米粒的光热效应对4T1细胞的杀伤作用。取对数生长期细胞，调整4T1细胞浓度为5×104 cells/ml，将200 μl/孔细胞悬液接种于96孔细胞培养板，置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养24 h后，去除全部培养基，加入200 μl含CuS纳米粒的培养基（CuS纳米粒的浓度为50 μg /ml）。采用1 W/cm2的近红外光，照射不同时间（0、1、3、5、7、10 min），随后采用CCK-8试剂测定细胞活力百分率，参照“2.5.1”项下公式计算。结果显示（图9），近红外光照射1 min对4T1细胞的活力无明显影响，继续延长照射时间，细胞活力呈显著的降低趋势，照射10 min后的细胞活力仅为28.76 %。
图 9 CuS纳米粒光热效应作用下的4T1乳腺癌细胞的存活率（n=5）
采用与上述相同的方法，改为6孔板，经980 nm近红外光（1 W/cm2）照射10 min后，加入0.2 %台盼蓝对死细胞进行染色（2 min）。去除染液并用PBS清洗2遍后，在倒置相差显微镜下进行观察。如图10所示，激光照射区域，细胞被染为蓝绿色，且显示了明显的边界，而对照组不加CuS纳米粒，仅给予近红外光照射，只有个别零散的细胞着色。图9与图10结果均表明CuS纳米粒对肿瘤细胞具有显著的光热杀伤效果。
图 10 4T1乳腺癌细胞光热杀伤台盼蓝染色图片
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目前光热治疗作为新型的肿瘤治疗技术，寻找合适的光敏剂是亟待解决的重要问题。光热稳定、价格低廉等是CuS纳米粒的主要优点，但目前文献所报道的CuS纳米粒粒径多在10 nm以上[12-13]，可能引起CuS纳米粒在体内的蓄积，将限制其在临床上的使用，而减小粒径可以有效解决这个问题。本研究经单因素考察和星点设计-响应面优化法，得到CuS纳米粒的最优处方工艺，成功制备实际粒径为（3.10±0.81）nm的CuS纳米粒，且制备方法简单，易于工业化生产。该处方中以PVP作为保护剂，使CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性，分散度高，不易发生聚集沉淀，单因素考察分析也可发现PVP浓度对CuS纳米粒粒径具有较大影响，PVP浓度低，CuS纳米粒容易发生聚集，粒径增大；浓度太高，保护层过厚，也会引起CuS纳米粒粒径增大，因此选择合适的PVP浓度，是控制CuS纳米粒粒径关键因素之一。
由于CuS纳米粒在近红外区域（700~1 400）nm具有强吸收，使其在近红外光照射下，具有较强的光热效应，所优选的CuS纳米粒在1 W/cm2的激光功率密度下，照射4 min，温度即可达到42 ℃以上，可引起肿瘤细胞的凋亡或坏死[14]。因CuS纳米粒的光热转换性能来源于Cu2+的d-d能级跃迁，不易受外界环境的影响，所优选的CuS纳米粒具有良好的光热稳定性。本实验所优选的CuS纳米粒生物相容性好，且对肿瘤细胞具有显著的光热杀伤作用，这与多数文献报道相一致[15-16]。
综上，本研究所制备的CuS纳米粒粒径有望解决CuS纳米粒体内蓄积的问题，使其更好地应用于肿瘤光热治疗。本课题将进一步研究所制硫化铜纳米粒在体内的代谢情况以及对肿瘤组织的光热杀伤效果。
Optimization of formulation process and in vitro evaluation of copper sulfide nanoparticles
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摘要:
目的 为避免硫化铜（CuS）纳米粒体内蓄积，制备并优化CuS纳米粒，分析粒径影响因素并评价其光热性能。 方法 在单因素考察基础上，采用星点设计-响应面法进一步分析各因素对CuS纳米粒粒径的影响，获得最佳处方工艺。考察优选的纳米粒的理化性质，包括形态、粒径稳定性、光热转换性能及光热稳定性。采用CCK-8法评价CuS纳米粒对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞的毒性，并考察其光热效应对4T1乳腺癌细胞的杀伤效果。 结果 CuS纳米粒优选处方工艺的水合粒径为（10.53±1.63）nm；透射电镜下显示其粒径为（3.10±0.81）nm；所优选的CuS纳米粒具有良好的粒径稳定性，良好的光热转换性能与光热稳定性。细胞毒研究显示，所优选的CuS纳米粒分别在100 μg/ml及150 μg/ml浓度范围内，对4T1乳腺癌细胞以及HK2肾细胞均无显著的细胞毒性，且其对4T1乳腺癌细胞具有显著的光热杀伤效果。 结论 所制备的CuS纳米粒实际粒径小于6 nm且具有良好的光热效应，有望解决CuS纳米粒体内蓄积的问题，使其更好地应用于抗肿瘤治疗。 Abstract:Objective To avoid the accumulation of copper sulfide (CuS) nanoparticles, prepare and optimize CuS nanoparticles, analyze the factors affecting the particle size and evaluate their photothermal properties. Methods Based on the single factor study, central composite design-response surface methodology was used to optimize the CuS nanoparticle formulation process. The morphology, particle size stability, photothermal conversion efficiency, photothermal stability of optimized CuS nanoparticles were characterized. The toxicity of CuS nanoparticles on 4T1 breast cancer cells and HK2 kidney cells was evaluated by CCK-8 method. In vitro photothermal experiment was used to investigate the ability of CuS nanoparticles on killing 4T1 breast cancer cells. Results The average hydration dynamic diameter of optimized CuS nanoparticles was (10.53±1.63)nm, the actual particle size of CuS nanoparticles showed by TEM image was (3.10±0.81)nm. It had good particle size stability, good photothermal conversion efficiency and photothermal stability. Within the concentration range of 100 μg/ml and 150 μg/ml, it showed no significant toxicity on 4T1 breast cancer cells and HK2 kidney cells, indicating the good stability of CuS nanoparticles. In vitro photothermal therapy showed that CuS nanoparticles had good ability to kill 4T1 breast cancer cells by photothermal. Conclusion The prepared CuS nanoparticles have a small particle size (less than 6nm) and a good photothermal effect, which is expected to solve the problem of CuS nanoparticles accumulation in vivo and make it better for tumor treatment. -
近年来，有研究证实胰高血糖素样多肽-1（GLP-1）受体激动剂和钠-葡萄糖共转运蛋白-2（SGLT-2）抑制剂对2型糖尿病患者具有心血管保护作用[1-12]。中华医学会糖尿病分会第二十四次全国学术会议发布了《中国糖尿病防治指南（2020版）》，指南建议确诊动脉粥样硬化性心血管疾病（ASCVD）或伴有ASCVD高危因素的2型糖尿病患者，不论其糖化血红蛋白（HbA1c）是否达标，只要没有禁忌证都应在二甲双胍的基础上加用具有ASCVD获益证据的GLP-1受体激动剂或SGLT-2抑制剂；合并心衰（HF）的2型糖尿病患者，不论其HbA1c是否达标，只要没有禁忌证都应在二甲双胍的基础上加用SGLT-2抑制剂[13]。根据大型心血管安全性试验的结果，具有ASCVD获益的SGLT-2抑制剂和GLP-1受体激动剂有：恩格列净、卡格列净、利拉鲁肽、索马鲁肽、度拉糖肽和阿必鲁肽，其他SGLT-2抑制剂和GLP-1受体激动剂是否具有ASCVD获益还需进一步研究；具有心衰获益的仅有SGLT-2抑制剂：恩格列净、卡格列净、达格列净和艾托格列净，GLP-1受体激动剂是否具有心衰获益还需进一步研究[14]。本研究基于现有的证据进行系统回顾和网络Meta分析(NMA)，评价已上市的SGLT-2抑制剂和GLP-1受体激动剂对T2DM患者心血管保护作用的疗效差异，对其进行概率排序，形成推荐等级，为我国2型糖尿病临床治疗方案的选择提供循证依据。
1. 资料与方法
1.1 文献检索
检索Medline、Embase和Cochrane Library数据库，检索日期为建库至2020年7月18日。采用主题词结合自由词的方式制定检索策略。检索词包括“diabetes mellitus, type 2” “randomized controlled trial” “empagliflozin” “canagliflozin” “dapagliflozin” “ertugliflozin” “albiglutide” “dulaglutide” “exenatide” “liraglutide” “lixisenatide” “semaglutide” “oral se-maglutide”。
1.2 纳入标准
①随机对照试验；②年龄≥18岁，2型糖尿病患者；③试验组：恩格列净、卡格列净、达格列净、艾托格列净、度拉糖肽、索马鲁肽、利拉鲁肽、利司那肽、艾塞那肽、阿必鲁肽、口服索马鲁肽；对照组：安慰剂或以上SGLT-2抑制剂、GLP-1受体激动剂中除试验组外的任意一种或多种；④干预时长≥24周；⑤结局指标：主要心血管不良事件、全因死亡、心血管死亡、心力衰竭事件。
1.3 研究选择及资料提取
使用Endnote软件进行文献管理，由2名作者独立阅读文献，按照纳入标准提取研究的一般资料、患者基本特征、结局事件等。如意见不一致，通过讨论或第3名作者介入的方式解决。
1.4 偏倚评估
由2名作者根据Cochrane偏倚风险评估工具2.0独立对纳入研究进行质量评价[15]，如意见不一致，通过讨论或第3名作者介入的方式解决。质量评价包括：①随机化过程产生的偏倚；②偏离既定干预措施产生的偏倚；③结局数据缺失产生的偏倚；④结局测量产生的偏倚；⑤结果选择性报告产生的偏倚；⑥整体偏倚。结果表示为“低风险”“需关注”和“高风险”，在5个领域中若出现任意一个或多个偏倚评估为高风险，则整体偏倚评估为高风险。
1.5 统计分析方法
运用R软件 (version 4.0.3) 和GeMTC 包进行贝叶斯网状Meta分析，效应指标为风险比（HR）及其95%可信区间（CI）[16]。运用I2检验来评估研究间的异质性，若I2<50%，表示研究间的误差由抽样误差引起，纳入研究具有同质性；若I2>50%，认为研究间存在异质性[17]。运用节点拆分法检验直接比较结果和间接比较结果是否存在不一致性，若P>0.05，则认为直接比较和间接比较结果一致[18]。运用累积排序概率图下面积（SUCRA）作为累积排序概率的指标，根据SUCRA值的大小对干预措施优劣进行排序，SUCRA值越大表示干预措施获益越多[19]。SUCRA的值介于0到1之间。
2. 结果
2.1 文献检索及筛选结果
检索获得18 294篇文献，剔除5 189篇重复文献，通过阅读题目和摘要剔除11 507 篇文献，通过阅读全文剔除1 464篇文献，最后纳入134项随机对照试验(见图1)，涉及11种降糖药物。
2.2 纳入研究的基本特征
共纳入162 345例患者，平均年龄为58.4岁，男性占56.7%，糖尿病病史约9年，平均HbA1c为8.1%，平均空腹血糖为9.2 mmol/L，平均BMI为31.4 kg/m2，平均体重为87.8 kg，平均收缩压为132.2 mmHg，平均舒张压为78.5 mmHg。
2.3 偏倚风险评估
整体偏倚风险评估中，66项研究为高风险，53项为低风险，14项研究偏倚风险未知。随机化过程、结局测量、结果选择性报告领域中所有研究均为低风险；在结局数据缺失的偏倚评估中，由于研究失访率大于5%、存在组间失访率不均衡，以及缺失的数据等原因，有64项研究为高风险；3项研究因未报告干预分配的分析方法，在偏离既定干预措施的偏倚评估中为高风险。
2.4 异质性检验
纳入试验的临床特征、方法学及统计学相似，结合异质性检验结果I2=0，表明纳入研究具有同质性。
2.5 网状Meta分析的结果
主要心血管不良事件的网状图如图2所示。与安慰剂相比，恩格列净、卡格列净、达格列净、阿必鲁肽、度拉糖肽、艾塞那肽、利拉鲁肽、索马鲁肽，可降低2型糖尿病患者主要心血管不良事件的发生风险（见图3A）；与安慰剂相比，恩格列净、卡格列净、达格列净和艾托格列净均可降低2型糖尿病患者心力衰竭的发生风险（见图3B）；与安慰剂相比，恩格列净、卡格列净、达格列净、艾塞那肽、利拉鲁肽和口服索马鲁肽可降低全因死亡事件的发生风险（见图3C）；与安慰剂相比，恩格列净、卡格列净、利拉鲁肽、口服索马鲁肽可降低心血管死亡事件的发生风险（见图3D）。
图 2 主要心血管不良事件的网状图注：图中的圆形代表一种治疗措施，圆形大小与接受该治疗措施的患者人数呈正比；连线代表两种治疗措施之间有直接比较，连线的粗细与研究数量呈正比
图 3 心血管不良事件终点的森林图注：A.主要心血管不良事件（128项研究, 161 460例患者）；B. 心力衰竭事件（66项研究，130 646例患者）；C. 全因死亡事件（78项研究,140 487例患者）；D. 心血管死亡事件（66项研究，130 646例患者）2.6 不一致性检验
纳入研究的网状Meta分析直接证据和间接证据的不一致性检验，P值均大于0.05，表明直接证据和间接证据具有一致性。
2.7 干预措施排序结果
根据累积排序概率图下面积（见图4），在主要心血管事件方面，获益从高到低的排序依次是：阿必鲁肽、索马鲁肽、卡格列净、口服索马鲁肽、恩格列净、度拉糖肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、达格列净、艾托格列净、利司那肽、安慰剂；在降低心力衰竭的发生风险方面，获益排序依次是：恩格列净、卡格列净、阿必鲁肽、艾托格列净、达格列净、口服索马鲁肽、利拉鲁肽、艾塞那肽、度拉糖肽、利司那肽、安慰剂、索马鲁肽。
3. 讨论
3.1 2型糖尿病合并冠状动脉粥样硬化性心脏病患者的降糖药物选择
本文研究结果显示，恩格列净、卡格列净、达格列净、阿必鲁肽、度拉糖肽、艾塞那肽、利拉鲁肽及索马鲁肽可降低2型糖尿病患者主要心血管不良事件的发生风险。结合多项大型心血管安全性试验及最新的循证医学证据，达格列净与艾塞那肽是否具有ASCVD获益还需要进一步研究，目前具有明确ASCVD获益的SGLT-2抑制剂和GLP-1受体激动剂有恩格列净、卡格列净、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽和索马鲁肽。在我国可供选择的具有明确ASCVD获益的SGLT-2抑制剂和GLP-1受体激动剂有恩格列净、卡格列净、度拉糖肽、利拉鲁肽。结合本文研究结果，2型糖尿病合并ASCVD患者，应用SGLT-2抑制剂或GLP-1受体激动剂心血管获益从高到低分别是：卡格列净、恩格列净、度拉糖肽、利拉鲁肽。
3.2 2型糖尿病合并心衰患者的降糖药物选择
本研究结果显示，恩格列净、卡格列净、达格列净和艾托格列净，均可降低2型糖尿病患者心力衰竭的发生风险，CVOTs及其他循证医学研究与本文研究结果一致，同时4种SGLT-2抑制剂均已进入我国协议期谈判药品目录。结合本文研究结果，降低心力衰竭风险方面，2型糖尿病合并心衰的患者应用SGLT-2抑制剂或GLP-1受体激动剂获益从高到低依次是：恩格列净、卡格列净、艾托格列净和达格列净。
3.3 本研究的不足
前期通过系统检索数据库后发现我国上市的贝那鲁肽、洛塞那肽及tofogliflozin、ipragliflozin等在其他国家上市的SGLT-2抑制剂或GLP-1受体激动剂的随机对照试验较少，报告心血管事件的研究接近于0，因此本研究在制定纳排标准时仅纳入了11种SGLT-2抑制剂和GLP-1受体激动剂。经过筛选后纳入的134篇文献，由于试验失访率高于5%、失访数据存在组间不平衡及失访数据可能影响结果稳定性等原因，在评估偏倚风险时有64项研究在结局数据缺失的偏倚评估中为高风险，为检验研究结果的稳定性，本文通过敏感性分析纳入偏倚风险低的随机对照试验，其结果与主要研究一致。
4. 结论
根据本文的研究结果及目前在我国上市的SGLT-2抑制剂或GLP-1受体激动剂，针对2型糖尿病合并ASCVD患者，心血管获益从高到低分别是：卡格列净、恩格列净、度拉糖肽、利拉鲁肽；针对2型糖尿病合并心衰 的患者，应用SGLT-2抑制剂或GLP-1受体激动剂获益从高到低依次是：恩格列净、卡格列净、艾托格列净、达格列净。
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表 1 CuS纳米粒单因素考察结果（n=3）
因子 水平 粒子大小 (nm) 多分散指数 搅拌时间 (min) 3 18.13±5.42 0.27±0.01 5 16.12±1.29 0.27±0.01 7 15.40±1.86 0.26±0.01 水浴温度 (℃) 80 14.61±4.35 0.27±0.01 90 16.12±1.29 0.27±0.01 100 22.85±1.71 0.26±0.01 水浴时间 (min) 10 18.12±6.31 0.25±0.02 15 16.12±1.29 0.27±0.01 20 21.30±5.71 0.24±0.01 PVP浓度 (mg/ml) 80 25.56±4.40 0.27±0.01 100 16.12±1.29 0.27±0.01 120 20.72±3.38 0.25±0.02 Cu:S 3:1 15.08±2.92 0.26±0.01 2:1 20.25±1.16 0.27±0.01 1:1 16.12±1.29 0.27±0.01 1:2 11.34±3.08 0.25±0.02 1:3 11.27±2.88 0.25±0.02 
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表 2 星点设计因素和水平
因子 水平 −1.682 −1 0 +1 +1.682 X1 (℃) 60.00 70 85 100 110.20 X2 (mg/ml) 66.36 80 100 120 133.64 X3 0.25 0.33 1.67 3 4
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表 3 星点设计实验安排表和结果(n=3)
序号 X1 (℃) X2 (mg/ml) X3 Y1 (nm) 1 −1 −1 −1 13.04 2 +1 −1 −1 14.23 3 −1 +1 −1 14.48 4 +1 +1 −1 13.39 5 −1 −1 +1 24.37 6 +1 −1 +1 27.30 7 −1 +1 +1 18.62 8 +1 +1 +1 20.73 9 −1.682 0 0 18.87 10 +1.682 0 0 15.62 11 0 −1.682 0 24.01 12 0 +1.682 0 17.06 13 0 0 −1.682 13.92 14 0 0 +1.682 15.11 15 0 0 0 18.81 16 0 0 0 16.84 17 0 0 0 16.14 18 0 0 0 17.89 19 0 0 0 16.20 20 0 0 0 16.30
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