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表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS)是在拉曼光谱技术上发展起来的，一种快速、灵敏、简便、无损的分析方法[1-2]，可用于食品、药物、环境污染、生物分子、细菌等物质的结构鉴定、定性定量分析等[3-7]。其主要有两种增强机制：化学增强和电磁增强[8-9]。两种机制共同作用，可使SERS信号增强106~1014倍。SERS图谱包含待测物质详细的指纹图谱信息，即使是细微的结构差别，在SERS图谱上均有明显不同，是区分结构类似物很好的技术手段[10]。同时，因其简便、快速等特性使得SERS技术可以应用于原位现场检测。
黄嘌呤、茶碱、可可碱均属于嘌呤类衍生物，在结构上十分相似，其中，茶碱和可可碱与黄嘌呤是同系物，茶碱与可可碱是同分异构体。临床上常用黄嘌呤或茶碱进行支气管扩张、哮喘治疗等，可可碱常用来降低血液黏度[11-13]。较窄的治疗窗使得临床应用此类药物时通常需要对其进行血药浓度监测，以防止用药过量或不足等情况发生。但是，由于这3种物质的结构类似物很多，且常见于普通食品之中。如发生误服，易导致检测到的数据偏高，因此，急需一种实用、高效的分析手段，能够对这类结构类似物进行有效的区分和鉴别。常规分析方法如液相、质谱等[14]要经过复杂的分离手段，操作复杂、耗时长，给临床监测带来诸多不便。笔者利用SERS技术对3种结构类似物进行了有效的区分，并极大地降低了三者的检测限，同时，在实际血清样品的鉴别中也得到了很好的应用。
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DF-101S恒温加热磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）；Vortex-Genie2多功能旋涡混合器（美国Scientific Industries公司）；TG16-WS离心机（上海卢湘仪离心机有限公司）；电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；BWS415-785H便携式拉曼光谱仪（美国必达泰克公司）；TU-1902紫外可见分光计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Zeiss EVO MA-10扫描电子显微镜（德国Carl-Zeiss公司）；
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黄嘌呤、茶碱、可可碱（分析纯）购自上海泰坦科技股份有限公司；硝酸银、柠檬酸三钠、碘化钾、甲醇（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司；血清样品取自SD大鼠；去离子水为实验室自制。
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10 μmol/L黄嘌呤溶液：用精度为十万分之一的电子天平准确称取15.21 mg黄嘌呤粉末，溶于1 L去离子水中，搅拌均匀，待完全溶解后得到浓度为100 μmol/L的黄嘌呤储备液。再利用去离子水按照浓度梯度稀释，依次得到浓度为10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L的黄嘌呤溶液。
10 μmol/L茶碱溶液：用精度为十万分之一的电子天平准确称取18.16 mg茶碱粉末，溶于1 L去离子水中，搅拌均匀，待完全溶解后得到浓度为100 μmol/L的茶碱储备溶液。再利用去离子水按照浓度梯度稀释，依次得到浓度为10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L的茶碱溶液。
10 μmol/L可可碱溶液：用精度为十万分之一的电子天平准确称取18.16 mg可可碱粉末，溶于1 L去离子水中，搅拌均匀，待完全溶解后得到浓度为100 μmol/L的可可碱储备溶液。再利用去离子水按照浓度梯度稀释，依次得到浓度为10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L的可可碱溶液。
1 μmol/L碘化钾溶液：用精度为十万分之一的电子天平准确称取碘化钾粉末16.6 mg，溶于100 ml去离子水中，搅拌均匀，待完全溶解后即得1 mmol/L的碘化钾溶液。
10 mmol/L硫酸镁MgSO4溶液：用精度为十万分之一的电子天平准确称取无水硫酸镁粉末120 mg，溶于100 ml去离子水中，搅拌均匀，待完全溶解后即得10 mmol/L的MgSO4溶液。
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用电子分析天平准确称取硝酸银36 mg，用200 ml 的去离子水充分溶解，将该溶液缓慢倒入500 ml的三颈烧瓶中，不断加热的同时进行磁力搅拌，溶液微沸时，加入4 ml质量分数1%的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌约1 h，溶液的颜色由无色变为灰绿色，停止加热，冷却至室温，倒入棕色瓶中，避光保存[15]。由于溶胶体系的不稳定性，每次使用银胶之前都要摇晃均匀。
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紫外图谱表征：取2 ml纳米银胶溶液离心（7 000 r/min，5 min），尽可能多地去除上清液，然后加入等量的去离子水，吹打混匀，再加入8 ml去离子水稀释5倍，最后在300~700 nm波长范围内进行紫外光谱扫描，观察物质的紫外特征吸收峰。
扫描电镜表征：取1 ml银胶溶液离心（7 000 r/min，5 min），尽可能多地去除上清液，然后加入1 ml去离子水，吹打混匀后，用移液枪吸取2.5 µl银胶溶液滴于硅片上，烘干后电镜扫描，观察纳米银胶颗粒的形态。
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本实验为了增加单位面积内SERS检测的“热点”数目，对银胶溶液进行了浓缩处理。结果发现浓缩约60倍的银胶溶液信号增强效果最好，但是却产生了极强的背景信号，推测可能是由于制备银胶溶液时残留的柠檬酸根导致的。根据任斌课题组的方法[16]，我们用碘化钾溶液对银胶表面进行清洗。首先用移液枪分别吸取10 μl浓缩后的银胶溶液，置于6个1.5 ml离心管中，然后向每个离心管中分别加入0、1、3、5、7、9 μl的碘化钾溶液，涡旋混匀后，室温下孵育20~30 min采集SERS光谱。观察当多少碘化钾用量可使银胶浓缩后的背景信号基本去除。
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本实验所有SERS图谱均由BWS415拉曼光谱仪测得，将待测体系加到96孔板中，置于拉曼显微系统的检测台上，检测过程中，96孔板保持水平的状态，打开激光，将激光聚焦于待测溶液表面，点击开始，然后进行SERS检测。
光谱检测参数如下：激光波长785 nm，分辨率5 cm−1，积分时间10 s，扫描次数为1次，激光功率为100 mW。
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用移液枪吸取10 μl浓缩60倍后的银胶溶液置于1.5 ml离心管中，向其中加入5 μl 1 mmol碘化钾溶液，涡旋混匀后，室温下孵育20~30 min。然后加入10 μl 100 mmol的黄嘌呤（茶碱/可可碱）溶液和2 μl的MgSO4溶液（这里Mg2+的加入是为了对银胶颗粒起到团聚作用，以达到增强检测信号的目的），吹打混匀后，加入去离子水，使最终的溶液体积为100 μl。此时，黄嘌呤（茶碱/可可碱）的最终检测浓度均为10 mmol/L，然后将溶液转移到96孔板中，放到检测台上，打开激光，采集SERS图谱。SERS检测步骤如图1所示。
图 1 SERS检测流程图
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按照上述SERS检测的步骤，分别对已经配好的10、5、1、0.5、0.2、0.15、0.1、0.075 μmol/L的黄嘌呤、茶碱、可可碱溶液进行检测，测定3种结构类似物的最低检测限。
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从SD大鼠眼眶中获取适量全血样品溶液，等比例加入黄嘌呤、茶碱、可可碱粉末，混合均匀后，按照1:3的比例加入纯甲醇溶液，用以沉淀蛋白，获得包含3种物质的血清样品溶液。按照上述拉曼检测步骤对3种物质的血清体系进行检测。
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采用BWSpec4软件对采集到的光谱原始数据进行处理，主要为光谱平滑和基线校正。然后利用Matlab软件对数据进行光谱波段的截取，选取400~1 800 cm−1处的光谱数据进行分析，同时采用Origin 9软件对处理好的数据进行绘图。
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本实验采用的制胶方法来源于Lee法，是银胶最经典的制备方法。大多数实验的银胶制备方法都在Lee法的基础上加以进一步的改进和优化，所以，不同实验室制备的纳米银胶在粒径、形态大小上略有不同。本实验利用紫外光谱和扫描电镜对纳米银胶颗粒进行表征，结果如图2所示。由图2A可见，纳米银胶在300~700 nm扫描范围内，只在419 nm处出现了一个尖锐的单峰，半峰宽较窄。验证本实验制备的溶液确实为银胶溶液，且较小的半峰宽也可以反映出纳米银颗粒具有良好的分散性和均一性[17-18]。图2B可以看出本实验制备的纳米银胶颗粒为球形，大小均一，直径约为60 nm，分布较为松散。而图2C是将银胶溶液浓缩之后的纳米银胶颗粒形态，相比于未浓缩的银纳米颗粒，浓缩之后粒子之间距离极大缩短，单位面积之内的粒子数目增加，SERS检测“热点”也随之增加，极大地提高了待测物质的信号强度。
图 2 银纳米颗粒表征结果
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为了增强待测物质的信号强度，提高SERS检测的灵敏度，本实验将银胶溶液通过离心的方式进行了浓缩。经过一系列浓缩倍数的尝试，发现当浓缩倍数为60倍左右时，信号增强效果最好。但是，与此同时，制备银胶溶液时残留在溶液里的柠檬酸根离子也随之富集，显示了强大的背景信号，严重掩盖了待测物质的信号。所以，本实验采用碘化钾溶液对银纳米颗粒表面进行清洗。由图3可知，当1 mmol/L碘化钾溶液用量为5 μl时，背景信号基本去除干净。碘化钾用量不宜过多，因为过量的I−也会屏蔽待测物质的信号，所以，碘化钾用量为刚好去除背景信号即可。之后的所有实验都会对浓缩后的银胶溶液经历KI清洗步骤，以保证待测物质信号不受背景信号干扰，同时也不会被I−屏蔽。
图 3 加入不同体积碘化钾后银胶的背景信号
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黄嘌呤、茶碱、可可碱是3个结构十分相似的化合物，其中，茶碱、可可碱与黄嘌呤是同系物，而茶碱与可可碱之间是同分异构体，如图4所示。所以在实际应用中，对于三者的鉴定检测十分困难。通过SERS特有的指纹图谱特性，可以对三者进行很好的区分。由图5可知，黄嘌呤的特征峰主要出现在400~800 cm−1处，其中，522、577、660 cm−1处峰强明显；茶碱的特征峰主要出现在400~600 cm−1以及1 300~1 700 cm−1处，其中，520、567、932、1 306、1 380、1 440、1 587 cm−1峰强明显；而可可碱出峰较多，在400~1 800 cm−1均有出峰，其中，474、639、698、1 316、1 355、1 594 cm−1峰强较高。由此可见，尽管3种物质的结构十分类似，但是在SERS图谱中的特征峰却完全不同。所以SERS技术对于这类结构类似物具有很好的区分效果。
图 4 黄嘌呤、茶碱、可可碱的结构式
图 5 10 μmol/L黄嘌呤（A）、茶碱（B）、可可碱（C）及三者对比（D）SERS图谱
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上述对银胶溶液进行浓缩，不仅是为了增强待测物质的信号强度，同时也有降低检测限的目的。现利用浓缩银胶对3种物质检测限分别测定，由图6可知，黄嘌呤和可可碱的最低检测限为0.075 μmol/L，而茶碱的最低检测限为0.1 μmol/L，相比于液相等方法[19-21]，该方法对三者的检测灵敏度更高，检测限更低，完全能满足实际应用中对3种物质含量的检测。
图 6 黄嘌呤（A）、茶碱（B）、可可碱（C）的检测限
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黄嘌呤、茶碱以及可可碱都是常见药物成分，临床上常对3种物质的血药浓度进行监测。但是三者之间互为结构类似物，常常对监测过程产生干扰，使得测定结果偏高，故而本实验利用SERS技术对3种物质同时存在的血清溶液进行测定，观察SERS图谱是否可以很好地将其区别开来。结果如图7所示。由图7A可知，单独对血清空白样品进行检测，是没有SERS信号产生的。表明血清体系不对测定结果产生干扰。而含有3种物质的血清样品溶液可以检测到三者的特征信号。尽管信号强度对比水溶液来说弱了许多，但是与图7B对比可知，3种物质的特征峰均可以在混合血清溶液中一一对应。以上表明，利用SERS技术可以有效检测血清样品中是否包含黄嘌呤、茶碱、可可碱中一个或多个物质的存在。
图 7 混合3种物质的血清SERS图谱与3种物质水溶液SERS图谱对比
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本实验利用SERS技术对结构类似物黄嘌呤、茶碱、可可碱进行测定。结果表明，尽管3种物质在结构上相差不大，但是其各自的SERS图谱却完全不同，特征峰各异，可以很好的区分。整个实验过程操作简单、耗时短、样品需求少，证明了SERS技术对结构类似物具有很好的区分鉴别作用。同时，我们通过将SERS技术应用到检测3种物质的血清样品溶液中，证明该方法可以有效地对 三者混合物进行鉴定。综上，SERS在对结构类似物进行定性鉴别等方面具有巨大优势。
Identification of structural analogues xanthine, theophylline and theobromine by surface-enhanced Raman spectroscopy
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摘要:
目的 采用表面增强拉曼光谱技术对结构类似物黄嘌呤、茶碱、可可碱进行区分。 方法 通过制备浓缩的银胶增强试剂作为拉曼基底，增加单位面积内的“热点”数目，从而提高表面增强拉曼光谱的灵敏度，增强待测样品的信号强度，实现对结构类似物进行有效区分的目的。同时，通过测定包含3种混合物的血清样品，验证表面增强拉曼光谱在实际应用中的可行性。 结果 浓缩后的银胶极大地提高了3种结构类似物的信号强度，分别得到3种物质各自的特征光谱图，以及混合物在血清体系下的光谱图。3种物质水溶液的检测限依次为：0.005、0.01、0.005 μmol/L。 结论 表面增强拉曼光谱是一种很好的用于区分结构类似物的分析方法，具有简便快捷、灵敏度高、对样品无损等特点，可广泛应用于检测、分析、临床治疗和诊断等领域。 -
关键词:
- 表面增强拉曼散射光谱 /
- 黄嘌呤 /
- 茶碱 /
- 可可碱 /
- 鉴别
Abstract:Objective To distinguish the structural analogues xanthine, theophylline and theobromine by surface-enhanced Raman spectroscopy. Methods Concentrated silver colloid enhancement reagent was prepared as the Raman substrate to increase the number of "hot spots" per unit area, improve the sensitivity of surface-enhanced Raman spectroscopy, enhance the signal strength of the samples and achieve the effective discrimination of structural analogues. Meanwhile, the feasibility of surface-enhanced Raman spectroscopy in practical application was verified by determining serum samples of three mixtures. Results The concentrated silver colloid greatly increased the Raman intensity of the three structural analogues. The spectra of each individual compound and the mixture in the serum system was obtained. The detection limit of the three substances in aqueous solution were 0.005, 0.01 and 0.005 μmol/L respectively. Conclusion Surface-enhanced Raman spectroscopy is a potent technique for distinguishing structural analogues. It is rapid, sensitive and nondestructive to samples. Hence, it can be widely used in the fields of detection, analysis, clinical treatment and diagnosis. -
Key words:
- surface-enhanced Raman spectroscopy /
- xanthine /
- theophylline /
- theobromine /
- distinguish
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1. 病例报告
患者，女，44岁，因宫颈糜烂口服宫炎康颗粒（湖北纽兰药业有限公司，批准文号：Z20054677）18 g bid以及替硝唑胶囊（山东罗欣药业股份有限公司，批准文号：H10970233）0.5 g bid。服用7 d后出现小便颜色发黄，伴有间断乏力，停用上述两种药物，但未给予足够重视。患者停药7 d后出现皮肤及巩膜黄染，就诊于当地医院，急查肝功能：总胆红素（TBIL）135.1 μmol/L，直接胆红素（DBIL）77.4 μmol/L，谷丙转氨酶（ALT）1566 U/L，谷草转氨酶（AST）1327 U/L，碱性磷酸酶（ALP）151 U/L，γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）130 U/L。
患者在停药11 d后就诊于本院，入院后查肝功能：TBIL 107.6 μmol/L，DBIL 87.7 μmol/L，ALT 938 U/L，AST 478 U/L，ALP 203 U/L，γ-GT 137 U/L；病毒性肝炎抗体以及自身免疫抗体均为阴性，既往一般健康状况良好。入院后静脉给予复方甘草酸苷注射液200 mg qd、注射用还原型谷胱甘肽2 g qd、注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸2 000 mg qd和前列地尔注射液20 μg qd，同时口服熊去氧胆酸软胶囊200 mg tid进行保肝利胆治疗。治疗4 d后复查肝功能：TBIL 93.6 μmol/L，DBIL 77.3 μmol/L，ALT 408 U/L，AST 279 U/L，ALP 189 U/L，γ-GT 109 U/L，皮肤及巩膜黄染减退。继续原治疗方案7 d后，再次复查肝功能：TBIL 47.1 μmol/L，DBIL 38.2 μmol/L，ALT 316 U/L，AST 315 U/L，ALP 163 U/L，γ-GT 81 U/L，皮肤及巩膜黄染消失，肝功能显著好转出院，出院后继续口服药物复方甘草酸苷片75 mg tid以及熊去氧胆酸软胶囊200 mg tid治疗。患者出院2周后再次复查肝功能，胆红素和转氨酶等指标均恢复正常。
2. 讨论
患者为中年女性，无吸烟饮酒以及食物、药物过敏史，既往无肝脏疾病史；本次因宫颈糜烂口服宫炎康颗粒和替硝唑胶囊1周，因出现尿黄伴乏力停用药物，继而出现皮肤及巩膜黄染，同时肝脏转氨酶显著升高；经过11 d的入院治疗以及两周的出院口服保肝利胆药物治疗，肝功能恢复正常。根据最新的药物性肝损伤诊治指南[1]进行临床分型、因果关系评估（采用RUCAM评分法）以及严重程度分级，同时排除了其他原因如病毒性、酒精性或自身免疫性肝病，并结合用药史、疾病进程以及实验室指标，该患者诊断为药物性肝损伤，肝细胞损伤型，急性，RUCAM 7分（很可能），严重程度3级。
宫炎康颗粒为一种中成药，具有活血化瘀、解毒消肿的功效，用于慢性盆腔炎，其组方成分包括当归、赤芍、北败酱、香附(醋制)、炮姜、泽兰、川芎、红花、柴胡、车前子(盐炙)、海藻、延胡索。药品说明书中其不良反应、禁忌以及注意事项等均为尚不明确，未提示可能存在肝功能损害。此外，有关宫炎康颗粒的不良反应报道较少，且尚无引起肝损害的报道，仅有一例致面部针刺样疼痛的病例报告[2]。
大多数中成药的组方较为复杂，其引起不良反应包括肝损伤的机制很难阐明。宫炎康颗粒组方包含十二味中药，含有的化学成份尚不十分清楚，其中的柴胡和延胡索中药单方有引起肝损害的病例报道。延胡索中含有的延胡索乙素具有与有肝毒性的吡咯里西啶生物碱类似的结构，可能引起肝损害[3-4]。柴胡中的皂苷以及挥发油是主要的毒性成分，且肝脏是主要毒性靶器官[5]。因此，宫炎康颗粒中柴胡和延胡索可能在该患者的肝损害中发挥重要作用。
替硝唑作为新一代硝基咪唑类药物，常用于抗厌氧菌以及原虫。替硝唑在药品说明书以及现有报道中的不良反应一般是轻微和自限性的，主要包括恶心、呕吐、腹痛、便秘、厌食以及口腔金属味等胃肠道反应，皮疹、瘙痒、头痛和眩晕等不适，以及白细胞或中性粒细胞减少、双硫仑反应或黑尿等。替硝唑可能引起的严重不良反应主要包括过敏性休克或过敏性哮喘、癫痫或精神障碍、肾损害或肾衰竭等[6-7]。目前，有关替硝唑引起肝损害的报道较少，只有较早的1例牙周炎患者口服替硝唑胶囊后出现严重药物性肝损害[8]。本病例患者在发病前后未服用其他药物，因此推测宫炎康颗粒和替硝唑胶囊可能是引起急性药物性肝损害的原因。
药物性肝损害的发病机制复杂，至今尚未完全阐明，而中（成）药制剂以及抗感染药物是国内报道的最主要病因[1]。目前，药物性肝损害机制研究的热点是特异质性肝毒性，即与机体的基因多态性和表观遗传学差异具有重要相关性，而与药物的剂量不呈依赖性[1]。
宫炎康颗粒联合抗生素是目前常用的治疗慢性盆腔炎方法之一，尤其是宫炎康颗粒联用甲硝唑或替硝唑，两种药物均为常规剂量，疗程一般为2周时间，能够明显改善患者症状，降低不良反应风险以及疾病复发率[9-11]。针对细菌性阴道病以及滴虫性阴道炎，替硝唑与第一代硝基咪唑类药物甲硝唑相比，具有更好的疗效和安全性[12-13]。本病例患者的宫炎康颗粒和替硝唑胶囊均按照说明书常规剂量服用，未出现剂量过高或超说明书用药的情况，而且用药时间未超过常规的2周疗程，因此推测药物性肝损伤是由特异质性肝毒性引起。
目前，中成药联合抗菌药物广泛应用于多种疾病的治疗中，具有较好的应用前景。本病例首次报道了中成药宫炎康颗粒联用抗菌药物替硝唑胶囊后出现急性药物性肝损害，提示临床医生、临床药师以及患者，在联合治疗时应密切关注用药前后变化，定期监测肝功能指标，尤其是肝功能不全患者更应该慎重，以减少药物性肝损害的发生，提高用药安全性。
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