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金沸草（Inulae Herba）为菊科（Asteraceae）植物条叶旋覆花（Inula linariifolia Turcz.）或旋覆花（Inula japonica Thunb.）的干燥地上部分，被列入2015年版《中国药典》，具有降气、消痰、行水的功效，临床上应用广泛 [1]。金沸草的不同基源中，已有多篇文献报道过旋覆花的含量测定，而条叶旋覆花的含量测定目前尚未见报道[2-6]。
前期研究发现线叶旋覆花内酯A（britanin）是从条叶旋覆花中分离得到的含量较高且抗炎活性显著的一个倍半萜内酯，其结构式如图1所示。据文献报道，线叶旋覆花内酯A可应用于慢性阻塞性肺疾病[7]及心肌炎[8]的预防和治疗，具有神经保护[9]功能，能够通过抑制NF-κB和MAPK信号通路降低脂多糖（LPS）诱导的一氧化氮（NO）、前列腺素和炎性细胞因子的分泌水平[10]。这些功能与金沸草治疗“外感风寒，痰饮蓄结，胸膈脾满”相对应，因此可将其作为条叶旋覆花的重要质量标志物[1]。本研究优化了线叶旋覆花内酯A的提取方法和色谱条件，并开展系统适应性试验，建立了HPLC-UV法测定条叶旋覆花的干燥地上部位和头状花序中线叶旋覆花内酯A的含量测定方法，确定了含量较高的部位，有助于药材的合理应用。该方法操作简单，方便快捷，可为金沸草的基源药材条叶旋覆花的质量标准制定提供数据支持和科学依据。
图 1 线叶旋覆花内酯A的结构式
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HP-1100系列高效液相色谱仪（惠普，美国）；G1311A 四元泵、G1313A 自动进样器、G1316A 柱温箱、G1314A VWD可变波长检测器、G1315B DAD二极管阵列检测器（安捷伦，美国）；Agilent Zorbax SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 µm；安捷伦，美国）；BP211D 型电子天平（Sartotius，德国）。
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7批条叶旋覆花的干燥地上部分购自不同地区，获得的头状花序部位经由海军军医大学药学院生药学教研室张汉明教授鉴定；线叶旋覆花内酯A对照品（britanin）为实验室自制，化学分子式为C19H26O7，相对分子质量为366。经紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）、核磁共振（NMR）和质谱（MS）分析，纯度≥98%，符合中药化学对照品的含量测定要求；乙腈为J.T Baker 色谱纯，水为Milli-Q超纯水，其他试剂均为分析纯。
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超声法提取，超声时间为40 min。溶剂：100%甲醇。溶剂体积倍数：40倍。
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色谱柱为Agilent Zorbax SB C18柱（250 mm×4.6 mm，5 µm；安捷伦，美国）；初始流动相为乙腈-水（30:70），在20 min内升至乙腈-水（40:60）进行梯度洗脱，流速始终为1.2 ml/min；柱温为恒温30 ℃；检测波长212 nm。
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精密称取1.21 mg线叶旋覆花内酯A对照品，置于10 ml容量瓶中，用100%甲醇溶解后定容，摇匀，获得1 ml中含有线叶旋覆花内酯A 0.121 mg的对照品溶液（浓度为0.121 mg/ml），冷藏备用。
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精密称定条叶旋覆花（头状花序）粉末(过3号筛) 和条叶旋覆花（干燥地上部分）粉末(过3号筛) 各1.0 g，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入40 ml 100%甲醇，密塞，称重，超声提取60 min后，静置放冷，再称重，加100%甲醇溶液补足失重，摇匀，过滤，取续滤液，在5 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，即得条叶旋覆花头状花序和干燥地上部分的供试品溶液。
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取“2.3”项下制备的对照品溶液（0.121 mg/ml）和“2.4”项下制备的两种供试品溶液，分别按“2.2”项下的色谱条件进样测定，采用二极管阵列检测器（DAD）进行全波长扫描，记录并查看保留时间为12.2 min处峰上5点的紫外吸收图。如图2所示，两种供试品溶液的最大吸收波长与对照品溶液的最大吸收波长一致，峰形均为单一峰，分离度达到规定的要求，该方法的专属性良好。
图 2 对照品溶液和两种供试品溶液（批号000 3）的HPLC图
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精密吸取“2.3”项下制备的浓度为0.121 mg/ml的线叶旋覆花内酯A对照品溶液各0.5、1、2、4、10、16、20、24 µl，根据“2.2”项下的条件进行色谱测定，记录峰面积积分值。以线叶旋覆花内酯A的进样量为横坐标（X，相当于µg数），峰面积积分值为纵坐标（Y），计算并绘制标准曲线。计算得线叶旋覆花内酯A含量测定的回归方程为Y = 1 040.5X+1.379（r = 1.000 0），理论板数平均为25 554。结果显示线叶旋覆花内酯A在0.060～2.904 µg范围内呈现良好的线性关系。
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精密吸取等量 “2.3”项下制备的线叶旋覆花内酯A对照品溶液（0.121 mg/ml），根据“2.2”项下的条件进行色谱测定，记录线叶旋覆花内酯A的峰面积，连续测定6次。计算结果显示6份线叶旋覆花内酯A对照品溶液的峰面积RSD值为0.59%。表明仪器和方法具有较高的精密度，符合要求。
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取 “2.4”项下制备的同一供试品，分别于提取后0、1、2、4、6、8、10、12 h按“2.2”项下的条件进行色谱测定，记录各谱图中线叶旋覆花内酯A的峰面积。结果显示，12 h内线叶旋覆花内酯A的峰面积的RSD为0.97%，具备良好的稳定性。
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取样品批号为000 3的条叶旋覆花5份，分别精密称重，按照“2.2”项下的色谱条件，测定并计算线叶旋覆花内酯A的峰面积。根据结果计算得到其平均峰面积积分值为399.9，平均峰面积积分值的RSD值为1.04%，表明该方法测定线叶旋覆花内酯A的含量重现性良好。
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在“2.2”项下的色谱条件下，以100%的甲醇为溶剂对线叶旋覆花内酯A对照品溶液（0.121 mg/ml）进行倍比稀释，按信噪比为3测定最低检测限。结果表明，当线叶旋覆花内酯A对照品的浓度为1.51 µg/ml、进样量为1 µl时，峰信号约为噪声的2 ~ 3倍，即最低检测限为1.51 ng。将线叶旋覆花内酯A对照品溶液稀释至浓度为0.453 µg/ml且信噪比约为10时，重复进样6次，计算得峰面积的RSD为1.96%，表明线叶旋覆花内酯A对照品的定量限为0.453 µg/ml，即4.53 ng。
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取同一批号的样品6份（批号为000 3），分别精密加入与样品中线叶旋覆花内酯A含量相等的对照品，按“2.2”项下的色谱条件进行测定，计算线叶旋覆花内酯A的含量、回收率和RSD值。结果如表1所示，线叶旋覆花内酯A的平均回收率为95.77%，RSD为1.80%，表明该方法测定线叶旋覆花内酯A的加样回收率良好。
表 1 回收率试验结果
取样量（m/g） 样品中的含量（m/mg） 对照品加入量（m/mg） 测定量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%) 0.505 0 0.803 0.770 1.555 97.8 95.77 1.80 0.524 2 0.834 0.770 1.557 94.3 0.502 8 0.799 0.770 1.519 93.7 0.509 1 0.809 0.770 1.562 97.8 0.504 9 0.803 0.770 1.534 95.2 0.509 6 0.810 0.770 1.546 95.8 -
分别精密称取对照品与7个批次样品的头状花序和干燥地上部分，按“2.3”项下与“2.4”项下分别制备对照品溶液和供试品溶液，按“2.2”项下的条件进行色谱测定分析，每批样品平行3次，记录峰面积。根据上述标准曲线计算7批样品中线叶旋覆花内酯A的平均含量。结果如表2所示，条叶旋覆花的头状花序中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.732%，干燥地上部分中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.125%，仅为头状花序的1/7。
表 2 条叶旋覆花的头状花序及地上干燥部分的含量测定结果
部位 编号 采集点 含量（%） 平均含量（%） 头状花序 0001 江苏省南京市玄武区 0.733 0.732 0002 江苏省南京市溧水区 0.693 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.936 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.509 0005 安徽省滁州市明光市 0.709 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.564 0007 安徽省六安市霍邱县 0.983 干燥地上部分 0001 江苏省南京市玄武区 0.202 0.125 0002 江苏省南京市溧水区 0.141 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.158 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.123 0005 安徽省滁州市明光市 0.059 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.068 0007 安徽省六安市霍邱县 0.122 -
提取方法和色谱条件是经过优化后选用的。本研究考察了超声、回流、浸渍3种提取方法，其中冷浸法提取出的线叶旋覆花内酯A含量最高，尽管提出率高，但提取的杂质最多，影响测定，热回流法提出的含量最低。考虑提取方法的提出率及操作的可行性和便捷性，选用超声法提取条叶旋覆花中的线叶旋覆花内酯A。随后本研究考察了选择不同溶剂（水、不同浓度的乙醇或甲醇等）、不同溶剂倍数的溶剂体积（10、20、40、60倍）及不同超声时间（10、20、40、60 min）等条件对线叶旋覆花内酯A的提取效果。结果显示，当溶剂为100%甲醇、体积倍数为样品质量的40倍、超声时间为40 min时，可以将条叶旋覆花中的线叶旋覆花内酯A充分提出。
通过比较 Inertsil ODS-3 C18（250 mm×4.6 mm，5 µm；岛津，日本）、Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 µm；瑞典）和 Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 µm；安捷伦，美国）3种色谱柱，发现Agilent Zorbax SB C18 柱能更好地分离条叶旋覆花药材的化学成分，而且线叶旋覆花内酯A峰峰形较好，理论板数较高，故选用该色谱柱分析。另外，本研究考察了不同柱温（20、25、30 ℃）、不同流动相系统（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-甲酸等系统）、不同流速（0.8、1.0、1.2 ml/min）等条件对分离效果的影响，结果表明柱温在30 ℃，以乙腈-水为流动相在1.2 ml/min的流速下梯度洗脱时，线叶旋覆花内酯A峰能较好地与其他峰达到基线分离。通过上述优化实验最终确定了方法部分所用的提取条件和色谱条件。
本文建立的以线叶旋覆花内酯A为标志物的金沸草的质量控制方法，能够帮助研究人员在对金沸草的研究开发过程中，对线叶旋覆花内酯A的含量进行质量控制，区分伪劣及混淆药材，选择质量合格的金沸草药材。另外，本研究发现相对于条叶旋覆花的干燥地上部分，线叶旋覆花内酯A在条叶旋覆花的头状花序中含量更高，是更有效的用药部位，为临床医师用药提供了参考。
Determination of britanin content in different parts of Inula linariifolia Turcz by HPLC
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摘要:
目的 利用HPLC法对7批不同产地金沸草基源植物之一条叶旋覆花的干燥地上部分中线叶旋覆花内酯A的含量进行测定，并与其在头状花序中的含量比较，为金沸草药材质量标准的制定及合理应用提供依据。 方法 Agilent Zorbax SB C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在柱温为30 ℃、流速为1.2 ml/min下以乙腈-水为流动相梯度洗脱，检测波长为212 nm。 结果 实验结果符合《中华人民共和国药典》（2015版）方法学验证的要求，金沸草基源条叶旋复花的头状花序中线叶旋覆花内酯A的平均含量为0.732%，在干燥地上部分的平均含量为0.125%，仅为头状花序的1/7，差异显著。 结论 建立的质量控制方法简单易行，可为条叶旋覆花的质量控制及合理用药提供数据支持和科学依据。 Abstract:Obejctive To determine and compare britanin content in dried aerial parts and capitulum of Inula linariifolia Turcz from 7 different origins by HPLC. Methods Analysis was performed on Agilent Zorbax SB C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm). Acetonitrile and water were used as mobile phase for gradient elution at 1.2 ml/min. Column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength at 212 nm. Results The results meet the requirements of the method validation in 2015 edition of Chinese Pharmacopeia. The average britanin content in dried aerial parts of Inula linariifolia Turcz is 0.125% vs 0.732% in capitulum, which is significantly different. Conclusion The established method is simple and convenient. It can be used for quality control of Inula linariifolia Turcz. -
Key words:
- Inula linariifolia Turcz. /
- dried aerial parts /
- capitulum /
- britanin /
- content determination
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图 2 对照品溶液和两种供试品溶液（批号000 3）的HPLC图
A.对照品溶液；B.条叶旋覆花（头状花序）供试品溶液；C.条叶旋覆花（干燥地上部分）供试品溶液；1. 线叶旋覆花内酯A
表 1 回收率试验结果
取样量（m/g） 样品中的含量（m/mg） 对照品加入量（m/mg） 测定量（m/mg） 回收率（%） 平均回收率（%） RSD(%) 0.505 0 0.803 0.770 1.555 97.8 95.77 1.80 0.524 2 0.834 0.770 1.557 94.3 0.502 8 0.799 0.770 1.519 93.7 0.509 1 0.809 0.770 1.562 97.8 0.504 9 0.803 0.770 1.534 95.2 0.509 6 0.810 0.770 1.546 95.8 
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表 2 条叶旋覆花的头状花序及地上干燥部分的含量测定结果
部位 编号 采集点 含量（%） 平均含量（%） 头状花序 0001 江苏省南京市玄武区 0.733 0.732 0002 江苏省南京市溧水区 0.693 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.936 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.509 0005 安徽省滁州市明光市 0.709 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.564 0007 安徽省六安市霍邱县 0.983 干燥地上部分 0001 江苏省南京市玄武区 0.202 0.125 0002 江苏省南京市溧水区 0.141 0003 安徽省马鞍山市含山县 0.158 0004 江苏省淮安市盱眙县 0.123 0005 安徽省滁州市明光市 0.059 0006 安徽省滁州市凤阳县 0.068 0007 安徽省六安市霍邱县 0.122
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