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目前全球尚无预防和治疗新冠肺炎（COVID-19）确认的特效药物。有学者试图遴选已有的抗病毒药物，以期尽快开发“老药新用”的治疗方案。国家卫生健康委员会陆续发布了7版试行《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》，其中，广谱抗病毒药物利巴韦林被作为可试用的临床治疗药物。
利巴韦林（ribavirin）常用剂型有注射剂、片剂、口服液、气雾剂等，国外临床上多以雾化剂用于成人和儿童的呼吸道合胞病毒性肺炎的治疗[1]。体外研究表明[2]，利巴韦林可增强干扰素的体外活性，在治疗SARS-CoV感染者中，诊断后立即使用利巴韦林时治疗效果较好[3]。利巴韦林对DNA和RNA病毒均具有抑制作用，通常以雾化剂用于成人和儿童的呼吸道合胞病毒性肺炎的治疗。美国食品药品管理局（FDA）于1986年首次批准利巴韦林吸入溶液气雾剂（Virazole®，USP）[4]，于1992年上市，而说明书中明确规定用于严重下呼吸道感染的住院患儿，且全程气雾治疗3～7 d，可见其应用的严格限制。根据国内多家临床中心的试验数据表明，与利巴韦林颗粒剂相比，国内的利巴韦林气雾剂（信韦林）达到同等的治疗效果时，虽然用药剂量大幅下降，但不良反应率无明显差异[5-8]，表明利巴韦林吸入溶液气雾剂（Virazole®，USP）和利巴韦林气雾剂（信韦林）可能存在不良反应较大的缺陷，临床应用受到一定的限制。
脂质体定量吸入粉雾剂（DPI）是肺部给药系统的研究热点之一。脂质体由于类似细胞结构而具有被动靶向性，作为药物载体常用于肺部给药，有利于抗病毒药物直接递送并作用于肺部细胞，抑制病毒的繁殖，特定粒径的脂质体粉雾剂可使药物不同程度地的分布于人体上、下呼吸道，从而发挥更好的临床治疗效果[9-10]。利巴韦林水溶性较好，亲脂性较差，如图1的结构式所示，不易被细胞渗透吸收，采用脂质体包裹，并制成粉雾剂给药至呼吸道或肺泡组织，可实现肺部沉积增强的作用效果，同时降低不良反应。本文根据临床急需及利巴韦林的药物理化性质，结合吸入制剂肺部给药方面的治疗优势，设计研制了一种利巴韦林脂质体吸入粉雾剂。以此开展设计研究，尝试开发抗病毒药物新型给药系统，以期为扩大利巴韦林临床使用范围，也为制剂学基础研究提供参考。
图 1 利巴韦林化合物的结构式
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高效液相色谱仪（Agilent 1200）；ME104E电子天平（METTLER TOLEDO）；EYELA N-1000旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；Niro NS2006L高压匀质机（意大利GEA Niro Soavi公司）；Nano NS90粒度检测仪（英国马尔文仪器有限公司）；Hitachi S-3400N扫描电子显微镜（日本日立公司）。
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利巴韦林原料药（纯度>98%，西安康诺化工有限公司）；利巴韦林对照品（629-200202，中国食品药品检定研究院）；大豆卵磷脂（SPC）、脱氧胆酸钠（SDC）（北京化学试剂公司）；N，N-二甲基甲酰胺、无水乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯，北京化学试剂公司）；蒸馏水。
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参照美国药典第40版中“利巴韦林”含量测定方法[11]，采用高效液相色谱法测定。色谱条件：色谱柱为Carbomix H-NP5（7.8 mm×100 mm，5 μm）；流动相硫酸溶液调整pH至2.5±0.1；流速：0.6 ml/min；柱温：60 ℃；检测波长UV 207 nm；进样量10 μl，取利巴韦林对照品适量，流动相溶解稀释至浓度为0.025 mg/ml，过滤，进样检测。取利巴韦林脂质体冻干粉适量，加入无水乙醇少量破乳，呈透明溶液后流动相稀释，制成浓度0.025 mg/ml供试品溶液；同样方式处理阴性样品溶液。在该色谱条件下得到图2的色谱图，图中利巴韦林峰型较佳，出峰时间适宜，阴性对照无干扰。
图 2 利巴韦林高效液相色谱图（依次为空白样品、对照品溶液、供试品溶液）
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取大豆卵磷脂（5 mmol/L），脱氧胆酸钠（5 mmol/L），为制备具有高稳定性的双分子膜，在处方中加入适量维生素E置于250 ml的茄形瓶中，加入无水乙醇溶解，超声，至呈透明黄色溶液；将此溶液置旋转蒸发仪上旋转蒸发除去溶剂成膜；另取利巴韦林原料药溶解于磷酸盐缓冲液中（20 mg/ml），溶解完全后匀速加入至茄形瓶内，并于40 ℃水浴温度水化薄膜，直到完全水化呈近均一透明的乳白色溶液；高压均质机下将上述溶液均质，即得到粒径100~200 nm的利巴韦林脂质体溶液。加入冻干保护剂乳糖, 溶解摇匀后置西林瓶中，启动冷冻干燥程序，即得疏松利巴韦林脂质体冻干粉。
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取载药脂质体经处理后于透射电镜下观察，呈类圆形球状物，直径约200 nm，见图3。
图 3 自制利巴韦林脂质体（左）透射电镜图与脂质体冻干粉（右）高倍镜图
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将粉末通过下孔径为5 mm 的玻璃漏斗，从10 cm的高度缓慢、均匀地落入平板上，形成圆锥体。测量圆锥体的高度（h）和基底的半径（r），按公式计算休止角（θ，tanθ＝h/r）。粉末休止角为37～40°，流动性较好。取量筒，自由落体方式装入脂质体冻干粉，记录质量与体积，计算松密度约0.25 g/ml。
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取利巴韦林脂质体冻干粉适量，纯化水溶解得脂质体复溶物，取复溶物适量加入无水乙醇少量破乳，呈透明溶液后用流动相稀释，制成0.025 mg/ml供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测冻干粉含量。
经过前期实验对比，本研究采用Sephadex G-50柱层析法测定包封率。分别精密量取1 ml脂质体和冻干粉复溶物上柱，用纯化水洗脱，流速0.5 d/s，从洗脱液由澄清变乳白色开始收集至洗脱液再次变澄清（约15 ml），置50 ml容量瓶中，以乙醇定容至刻度，振摇破乳；10 μl进样分析，记录色谱图，计算包封药物含量（W包）；另各取1 ml脂质体溶液及冻干粉复溶物置50 ml容量瓶中，乙醇稀释至刻度，振摇破乳，10μl进样分析，记录色谱图，计算总药量（W总）。以包封率=（W包/W总）×100%，计算结果见表1。
表 1 利巴韦林脂质体冻干粉含量与包封率
项目 样品 No.1 No.2 No.3 平均值 含量（mg/g） 脂质体冻干粉末 9.4 8.6 9.3 9.1 包封率 /% 冻干前脂质体溶液 64.23 63.83 66.34 64.80 脂质体冻干粉复溶液 63.43 61.65 64.10 63.06 结果表明，按照初步拟定方法制得的脂质体包封率约63%，冻干前后数据无明显差别，复溶效果较好，载药量较高，但包封率较低，处方工艺需要进一步优化。
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取本品复溶液适量，纯化水再次稀释100倍，于马尔文粒径仪检测，如表2所示，本品冻干前后溶液粒径约160 nm，聚合物分散指数（PDI）、电位均较好，表明稳定性较好。
表 2 利巴韦林脂质体冻干复溶液粒径、PDI与电位
样品 No.1 No.2 No.3 平均值 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径 电位 冻干前溶液 148.3 nm/0.57 −45.4 mv 163.7 nm/0.63 −41.8 mv 172.6 nm/0.39 −40.5 mv 161.5 nm −42.6 mv 冻干复溶液 147.8 nm/0.58 −42.5 mv 161.8 nm/0.65 −38.6 mv 181.7 nm/0.41 −39.1 mv 163.8 nm −40.1 mv -
脂质体具有优良的两亲性，冻干保护剂亦有很好的亲水性。取本品冻干粉5 g置10 ml容量瓶中，加水10 ml，轻轻振摇即刻溶解完成，形成均一的乳白色胶束溶液，说明本品溶解性较好。
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病毒通过侵入人体呼吸道黏膜上皮细胞而感染，并在细胞内进行复制与表达，再释放至细胞外感染宿主其他细胞，最终导致机体产生过度免疫反应。与一些在下呼吸道的细胞内进行复制繁殖的高致病性病毒类似，COVID-19导致下呼吸道症状较为明显。故若将抗病毒药物递送至下呼吸道，直达病灶，并进入被感染的机体上皮细胞内，可能更好地发挥抑制或清除病毒的作用。通常肺吸入给药后可直接将药物运送至肺组织，在局部起效，与全身给药治疗肺部疾病相比较，可明显减少药物用量，降低药物在其他部位分布与吸收造成的不良反应，加之粉雾剂具备给药剂量准确、无需抛射剂、方便、易用及肺部靶标部位药物沉积量高等优势，是肺部疾病治疗药物较为理想的给药途径。
将利巴韦林通过脂质体包裹技术实现粉雾剂肺部细胞靶向治疗，相比普通口服与常规气雾剂可减少用药剂量和降低不良反应，理论上具有一定的可行性。因而，对轻、中度COVID-19感染患者也许是一种潜在的抗病毒药物治疗方式。
经对利巴韦林脂质体粉雾剂的初步制剂技术探究，结果证明制备的制剂满足粉雾剂的基本要求。由于粉雾剂具有无需抛射剂、药物相对稳定的优势[12]，而且给药装置易于携带，操作简单、给药剂量相对准确等优点，故适合开发研制成利巴韦林脂质体吸入粉雾剂。此外，制备的利巴韦林脂质体冻干粉还可开发为溶液气雾剂，故在药剂开发方面也有较好前景。然而，本实验尚为初步研究，仍需要对制剂处方工艺进一步优化，以进一步提高包封率与改善整体粒径分布等性能。如要进入临床试用，还需对给药装置筛选、体内外药物沉积、药效学等进行深入考察，以满足临床使用的基本要求。
Preparation and preliminary evaluation of ribavirin liposome-powder inhaler
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摘要:
目的 为解决利巴韦林存在的明显不良反应问题，研制利巴韦林脂质体吸入粉雾剂，并初步评价其质量特性。 方法 采用薄膜分散法制备利巴韦林脂质体，再冻干制备成利巴韦林脂质体粉雾剂，并考察制剂的外观形态、流动性、松密度、包封率、复溶液粒径、聚合物分散指数、电位及亲水性。 结果 利巴韦林脂质体粉雾剂形态、粒径、电位、流动性与亲水性均较好，能满足粉雾剂給药的基本要求。 结论 应用该方法制备利巴韦林脂质体粉雾剂的制剂技术是可行的，为后续体内外研究提供制剂学技术依据。 Abstract:Objective In order to solve the obvious adverse reactions of ribavirin, to develop ribavirin liposome inhalation powder and to evaluate its quality characteristics. Methods The ribavirin liposomes were prepared by the thin film dispersion method, and then lyophilized to prepare ribavirin liposome powder. The appearance, fluidity, bulk density, encapsulation efficiency, particle size of the complex solution, PDI, potential and hydrophilicity were examined. Results Ribavirin liposome powder has good morphology, particle size, potential, fluidity and hydrophilicity, which can meet the basic requirements of powder medicine for drug administration. Conclusion The technique of preparing ribavirin liposome powder aerosol preparation by this method is feasible, and it provides the basic technology for future in vivo and in vitro studies. -
Key words:
- ribavirin /
- liposomal /
- lyophilized /
- powder inhalers
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胃康颗粒由黄芪、三七等九味中药经微粉化制粒而成，具有通降气机、和胃健运的功效[1]，在临床上主要用于治疗慢性胃炎、溃疡性结肠炎、术后残胃炎、胃癌合并上消化道出血等疾病[2-3]。方中黄芪可以补气健脾、固表、利尿脱毒[4]，三七可以散瘀止血，消肿定痛[5]。黄芪中所含的黄芪甲苷以及三七中所含的人参皂苷Rb1是胃康颗粒的主要活性成分，也是其含量测定的重要检测指标。《中国药典》2015版中采用HPLC-ELSD法测定黄芪中黄芪甲苷的含量，用高效液相色谱-紫外检测（HPLC-UV）法测定三七中人参皂苷Rb1的含量，无法按药典方法同时测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷。有关文献[6-9]采用HPLC-ELSD法同时测定制剂中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd的含量，该方法简便、准确、分离好，灵敏度高，重复性好，无干扰，对建立三七药材及其制剂的质量控制方法有参考价值。陈骁勇[10]、王银[11]等采用HPLC-ELSD分别测定参芪五味子片、益肺清化颗粒中的有效成分的含量，该方法可以同时测定皂苷类成分和黄芪甲苷的含量，简便快捷、结果准确、重复性好。因此，本研究参考相关文献，优化胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取方法，并建立同时测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的方法，作为控制胃康颗粒质量的方法之一。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
98-1-B型电子调温电热套(天津泰斯特仪器有限公司）；RE-2000A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；Agilent 1220高效液相色谱仪、Agilent G4260B型蒸发光散射检测器、Splaris 230 Vac型空气发生器（均为安捷伦科技有限公司产品）；BSA223S-CW型电子分析天平（德国赛多利斯）。
1.2 材料
胃康颗粒（宁夏医科大学自制）；黄芪甲苷对照品（批号：110781-201616，纯度为96.9%）、人参皂苷Rb1对照品（批号：110704-201827，纯度为91.2%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯；水为娃哈哈水；其他为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：XBridge ®Shield RP18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（32：68，V/V）；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；蒸发光检测器，漂移管温度为60 ℃，雾化室温度为33 ℃，载气流量为1.7 SLM。
2.2 黄芪甲苷和人参皂苷Rb1的提取工艺考察
综合相关文献及2015版《中国药典》关于测定芪参胶囊中三七皂苷R1和黄芪甲苷含量的方法，初步拟定胃康颗粒的提取方法：取装量差异项下的本品内容物，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇，密塞，称定重量，超声处理，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液，回收溶剂至干，残渣加水使溶解，加水饱和的正丁醇振摇提取，合并正丁醇提取液，用浓氨试液洗涤，弃去洗涤液，正丁醇提取液回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解并转移至量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。本研究筛选并优化该提取工艺中的提取方式、提取溶剂、提取料液比、提取时间、正丁醇提取次数和氨水洗涤次数。
2.2.1 提取方式的筛选
实验时曾采用相关文献[9]中供试品处理的方法，发现供试品溶液的HPLC图谱在黄芪甲苷处峰形较小，故本研究在保证人参皂苷Rb1含量的前提下，采用相关文献中甲醇超声提取和回流提取两种方式，结果如表1所示，可知回流提取人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量较高，故综合考虑认为选择回流提取较为适宜。
表 1 不同提取方式对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响提取方式 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 超声 1.4443±0.0182 0.1849±0.0049 回流 2.4407±0.0032 0.2463±0.0696 2.2.2 提取溶剂的筛选
皂苷类成分常采用水、甲醇、乙醇作为提取溶剂，因此分别用上述3种提取溶剂，对供试品进行提取并测定含量，结果如表2所示，水的提取效果较差，而以甲醇提取时，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量最高，故选择甲醇为提取溶剂。
表 2 不同提取溶剂对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响提取溶剂 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 水 0.4566±0.0029 ND 甲醇 2.3946±0.0164 0.2336±0.0397 乙醇 1.3876±0.0158 0.1049±0.0263 2.2.3 提取料液比的筛选
参照相关文献分别选取1∶3、1∶6、1∶10、1∶20、1∶50的5种料液比进行提取，并测定提取液中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量，考察结果如表3所示，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量在料液比1∶6时达到峰值，且从节省溶剂的角度考虑，选择料液比1∶6提取较为适宜。
表 3 不同提取料液比对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响提取料液比(V∶V) 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 1∶3 2.4385±0.0179 0.1971±0.0065 1∶6 3.1305±0.0354 0.3647±0.0083 1∶10 2.6230±0.0261 0.2259±0.0146 1∶20 1.8379±0.0010 ND 1∶50 0.6474±0.0273 ND 2.2.4 提取时间的筛选
分别采用0.5、1、1.5、2 h的4种提取时间，对供试品进行提取并测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量，结果如表4所示，随着提取时间的延长，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量也随之逐渐上升，不过1.5 h后，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量不增反降，考虑可能是因为浸提液受热时间长，破坏了药材成分，从而导致人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量不增反降，故提取时间选择1.5 h较为适宜。
表 4 不同提取时间对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响提取时间(h) 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 0.5 1.9815±0.0591 0.1764±0.0107 1 2.2053±0.0154 0.1951±0.0026 1.5 2.2086±0.0377 0.2184±0.0032 2 0.0806±0.0015 ND 2.2.5 正丁醇提取次数的筛选
分别采用正丁醇提取3、4、5、6次，并对提取液测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量，结果如表5所示，正丁醇提取5次时，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量较高，但是继续增加正丁醇提取次数，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量的增幅不大。综合考虑后续试验及成本等因素，选择正丁醇提取5次较为适宜。
表 5 正丁醇提取次数对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响正丁醇提取次数 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 3次 1.6452±0.0234 0.1459±0.0214 4次 1.9642±0.0063 0.1874±0.0209 5次 2.5756±0.0213 0.2379±0.0030 6次 2.4577±0.0178 0.2384±0.0081 2.2.6 氨水洗涤次数的筛选
分别采用氨水洗涤1、2、3次，对供试品进行提取并测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量，结果如表6所示，氨水洗涤2次时，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量最高，故选择氨水洗涤2次较为适宜。
表 6 氨水洗涤次数对人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的影响氨水洗涤次数 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 1次 2.3970±0.0851 0.2776±0.0201 2次 2.4393±0.0236 0.2875±0.0050 3次 2.1734±0.0009 0.2766±0.0024 2.3 人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量测定
2.3.1 对照品溶液的制备
精密称定黄芪甲苷5 mg和人参皂苷Rb1 4 mg，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。
2.3.2 供试品溶液的制备
取本品5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇30 ml，称定重量，回流提取1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液20 ml，蒸干，残渣加水20 ml使溶解，加水饱和的正丁醇提取5次，每次20 ml，合并正丁醇提取液，用浓氨试液洗涤2次，每次30 ml，弃去洗涤液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.3 阴性对照溶液的制备
分别按处方比例取除黄芪和三七的其余中药饮片，照胃康颗粒的制法制成黄芪阴性样品和三七阴性样品，取黄芪阴性样品4.09 g和三七阴性样品4.55 g，照供试品溶液的制备方法分别制成缺黄芪和缺三七的阴性对照溶液。
2.3.4 系统适用性实验
取对照品、供试品和阴性对照品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，人参皂苷Rb1的保留时间约为8 min，黄芪甲苷的保留时间约为12 min，峰形对称尖锐，基线平稳，与其他色谱峰分离良好，阴性样品无干扰，详见图1。
2.3.5 线性关系考察
精密吸取混合对照品溶液1、3、9、12、15、18、21、24 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积积分值。分别以人参皂苷Rb1和黄芪甲苷对照品进样量的对数值为横坐标（X1和X2），峰面积积分值的对数值为纵坐标（Y1和Y2），绘制标准曲线，计算回归方程。得人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的回归方程分别为：
Y1 = 1.4444X1 + 4.3621，r=0.9995
Y2 = 1.5656X2 + 3.9467，r=0.9999
结果表明，人参皂苷Rb1在1.70~40.80 μg/ml的浓度范围内、黄芪甲苷在5.03~120.72 μg/ml的浓度范围内，与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。
2.3.6 精密度试验
取同一供试品溶液，精密吸取20 μl，按上述色谱条件，重复进样6次，记录色谱峰面积，计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷色谱峰面积积分对数值的RSD值分别为0.21%、0.39%，表明该方法日内精密度良好。
取同一供试品溶液，精密吸取20 μl，按上述色谱条件，重复进样2次，连续3 d，记录色谱峰面积，计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷色谱峰的峰面积积分对数值的RSD值分别为0.22%和0.36%，表明该方法日间精密度良好。
2.3.7 重复性试验
取本品同一供试品（批号20200112）约5.0 g，共6份，精密称定，照供试品溶液的制备方法制成供试液。按“2.1”项下色谱条件，测定峰面积并计算含量，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的平均含量分别为2.8609和0.2530 mg/g，RSD分别为1.97%和2.89%，表明此法重复性良好。
2.3.8 回收率试验
取已知含量的同一批胃康颗粒约5.0 g，共6份，精密称定，分别精密加入一定量的人参皂苷Rb1对照品和黄芪甲苷对照品，按供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定含量，计算人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的加样回收率分别为95.65%和 100.57%，RSD分别为1.06%和0.62%。
2.3.9 样品含量测定
取3批样品，按建立的方法测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量。分别精密吸取对照品溶液10、20 μl，供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪测定，以外标两点法对数方程计算，即得。结果如表7所示，胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的平均含量分别为2.8630和0.2576 mg/g，RSD分别为0.62%和1.51%。
表 7 3批胃康颗粒的含量测定结果批号 人参皂苷Rb1（mg/g） 黄芪甲苷（mg/g） 20200112 2.8534 0.2594 20200115 2.8521 0.2531 20200118 2.8836 0.2602 平均值 2.8630±0.0178 0.2576±0.0039 RSD（%） 0.62 1.51 3. 讨论
3.1 提取方法
皂苷类成分的提取方法有很多，如有机溶剂提取法、超声波提取法等，在生产中由于不同的提取方法，其有效成分的含量也会出现差别，本实验在胃康颗粒的人参皂苷Rb1和黄芪甲苷提取方法筛选和优化过程中，发现超声提取所得供试品溶液的HPLC图谱在黄芪甲苷处峰形较小，而回流提取既可以保证人参皂苷Rb1的含量，又可以改善黄芪甲苷的峰形与含量，且提取效率高、生产成本低。皂苷类成分常采用水、乙醇、甲醇作为提取溶剂，当胃康颗粒以甲醇提取时，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量最高，故选择甲醇提取。我们尝试直接测定经甲醇提取后的胃康颗粒，发现色谱图中干扰物质多，故考虑采用正丁醇萃取黄芪甲苷和人参皂苷Rb1，再以氨水洗涤溶解提取浓缩的残渣，且由于黄芪甲苷在碱性环境下存在转化的过程，结合实验结果和药典方法，最终经甲醇提取胃康颗粒后，再选择正丁醇为萃取溶剂、氨试液为洗涤剂，从而除去干扰杂质，并且对氨水洗涤次数以及正丁醇萃取次数进行了考察，最终确定了最佳提取方法。本研究建立的提取方法的最大改进之处在于采用甲醇回流同时提取胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷两种成分，采用该提取方法制备的供试品溶液色谱的杂质峰少，且可提高人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取含量。
3.2 含量测定
三七中所含的皂苷类成分的紫外吸收均为末端吸收，常使用203 nm波长检测，易受噪音和梯度洗脱的影响，灵敏度低，基线噪音大；黄芪中黄芪甲苷的含量多采用ELSD测定。ELSD仅对不挥发成分产生信号，其信号响应值仅取决于被分析物质颗粒的大小和数量，不存在紫外末端吸收的问题，且通过调节漂移管温度、气体流速等参数可以使基线平稳。因此，本研究拟建立同时测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量的HPLC-ELSD法。本实验考察了各个参数对含量测定结果的影响，发现流速为1.0 ml/min、漂移管温度为60 ℃、雾化室温度为33 ℃，载气压力为1.7 SLM时，仪器的灵敏度高，基线噪声小、信号稳定。ELSD的流动相不能使用非挥发性的试剂，可以使用的流动相仅有乙腈-水、甲醇-水。本实验考察了两种流动相对含量测定结果的影响，发现采用甲醇-水作为流动相或乙腈-水梯度洗脱，结果分离效果不好，改用乙腈-水（32∶68，V/V）作为流动相，人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的出峰时间适宜，峰形对称，且相邻杂质峰无干扰。本实验建立的HPLC-ELSD法最大的改进之处在于同时测定人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的含量，且操作简单，灵敏度、稳定性及重现性很高，是一种值得推广应用的检测制剂中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷成分的方法。
4. 结论
本研究建立了胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷两种指标性成分的提取方法，该方法采用回流提取同时提取了人参皂苷Rb1和黄芪甲苷两种成分，采用正丁醇萃取和氨水洗涤除去干扰杂质，可大幅缩短提取时间，提高效率，降低能量损耗，节约成本，有效提高了人参皂苷Rb1和黄芪甲苷的提取含量，在大规模生产中也具有可行性。
本研究建立了同时测定胃康颗粒中人参皂苷Rb1和黄芪甲苷含量的HPLC-ELSD法，该方法采用乙腈-水（32∶68，V/V）作为流动相等度洗脱，选择ELSD作为检测器并优化了相关检测参数。该方法操作简便、精密度高、稳定性好，可作为胃康颗粒指标性成分含量测定和质量控制的方法，为胃康颗粒质量标准的建立提供依据。
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表 1 利巴韦林脂质体冻干粉含量与包封率
项目 样品 No.1 No.2 No.3 平均值 含量（mg/g） 脂质体冻干粉末 9.4 8.6 9.3 9.1 包封率 /% 冻干前脂质体溶液 64.23 63.83 66.34 64.80 脂质体冻干粉复溶液 63.43 61.65 64.10 63.06 
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表 2 利巴韦林脂质体冻干复溶液粒径、PDI与电位
样品 No.1 No.2 No.3 平均值 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径/PDI 电位 粒径 电位 冻干前溶液 148.3 nm/0.57 −45.4 mv 163.7 nm/0.63 −41.8 mv 172.6 nm/0.39 −40.5 mv 161.5 nm −42.6 mv 冻干复溶液 147.8 nm/0.58 −42.5 mv 161.8 nm/0.65 −38.6 mv 181.7 nm/0.41 −39.1 mv 163.8 nm −40.1 mv
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