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侧流免疫层析（LFIA）是一种基于抗原抗体免疫反应的新型检测技术[1]，该技术具有操作简单、检测时间短、灵敏度高和特异性好等特点，因此被广泛应用于医学、食品、农业、环境等领域，对特定生物分子进行快速检测，是迄今为止对目标物质进行即时现场检测（POCT）的最成功的检测技术之一[2]。目前可检测的样品种类很多，例如血液、汗液、尿液、唾液等，LFIA使用范围非常广泛，在医药检测、食品安全、农业、工业方面都有涉及[3]。
LFIA试纸主要由样品垫、结合垫、层析膜、吸水垫和底板五部分组成[4]。样品垫用于吸收待测样品，并通过毛细作用力将样品传送到结合垫；结合垫上负载标记材料，与待测样品中的目标物质在检测时结合，形成可检测的复合物，再将复合物传送至层析膜；层析膜上的检测线和质控线用于显色，同时也可观察检测结果[5]；吸水垫用于带动样品在层析膜上侧向流动，同时也可吸收废液；底板可用于粘连检测试纸各个部分。
检测线（T线）用于检测目标分子是否存在，质控线（C线）用于验证试纸是否有效。待测样品加入后，目标分子和结合垫上的标记抗体结合，随着层析作用到达层析膜被T线上的单抗捕获，过量的标记抗体在C线上被二抗捕获[6]。利用专业的检测仪器对T线和C线条带的颜色进行扫描并转换成数值，将结果代入预先建立的标准曲线中，从而实现对目标分子的定性和定量分析。
识别元件是LFIA的重要组成部分，其中最常见的是抗体和适配体。抗体与目标分析物结合，通常用于检测待测样品中的目标分子。抗体具有较高的灵敏度和特异性，能够识别极小量的目标分子，具有广泛的应用领域。然而，抗体也存在一些缺点，例如制备过程繁琐、热稳定性差、易受交叉反应和失活的影响等等[7]。适配体是一种新兴的识别元件。与抗体不同，适配体是一种可以通过体外筛选而得到的人工寡核苷酸序列，具有与抗体相当的特异性和亲和性。此外，适配体稳定性高、易于合成，因此备受关注，在药物分析、临床医学、靶向治疗及基因调控等领域已成为非常重要的研究工具。
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在LFIA中，标记材料是至关重要的组成部分，它们用于标记免疫反应的产物，并用于可视化检测结果。常用的标记材料可分为三类，分别是有色标记物、荧光标记物和其他标记物，它们都具有不同的优点和适用范围，可以根据具体应用场景进行选择和优化。随着新技术的不断涌现，LFIA技术的标记材料也将不断发展和创新，为快速、准确、方便的生物检测提供更好的解决方案。
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有色型标记物是指可产生肉眼可见颜色的标记物，常用的有色型标记物有胶体金和胶体碳等。
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胶体金是一种含有纳米尺寸的金颗粒，通过氯金酸中的金离子还原成金颗粒制备，通常用于标记蛋白质或抗体等生物分子[8]。胶体金是LFIA中最常用的标记材料，其显色是由于大量聚集从而形成红色条带。胶体金的标记受多种因素影响，如胶体金的酸碱度和配体蛋白的比例等[9]。胶体金制备方便、性质稳定、吸附能力较强，对蛋白质和其它生物分子具有高亲和力，同时也具有较高的电荷转移值和良好的光信号。徐子健等[10]使用胶体金作为标记材料检测水果中残留的三唑磷，检测限为15 μg/kg，检测时间为5 min。涂晓波等[11]使用胶体金作为标记材料检测食品中四氢大麻酚，检测限为1 μg/ml，检测时间为5 ～10 min。
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胶体碳是碳黑经过表面处理所得。胶体碳灵敏度较高，较胶体金材料更加环保，且黑色信号更有利于肉眼观测。胶体碳可以与多种生物分子一起功能化，用于检测低分子量和高分子量的分析物[12]。使用胶体碳的LFIA的灵敏度与酶联免疫吸附测定（ELISA）相当[13]。但是胶体碳存在不规则形状的大颗粒，非蛋白质和生物分子的特异性吸附是胶体碳存在的主要问题。陈发容等[14]使用胶体碳作为标记材料制作检测试纸检测花生油中黄曲霉毒素B1，结果显示检测限为2.0 ng/g，检测时间为5～10 min，表明该检测试纸特异性良好，与其他结构类似物无交叉反应。曾艳等[15]使用SB4型炭黑作为标记材料制作检测试纸，用于呋喃妥因代谢物1-氨基-乙内酰脲的检测，其检测限为0.2 μg/kg，检测时间短，可在15 min内完成。
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荧光标记物在特定的光源激发下会产生荧光，常用的荧光标记物有镧系元素、量子点等，目前许多新型荧光标记物也已用于LFIA定量检测。
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镧系元素也可称为稀土元素，由于电子壳层间产生跃迁，从而产生强烈的荧光。镧系元素具有灵敏度高、特异性好、稳定性好、动态检测范围广等特点，并且不依赖复杂的专业仪器设备就能即时获得检测结果。李艾哲等[16]使用铕纳米颗粒制备荧光探针来制作试纸检测猪旋毛虫病，采用15头不同剂量人工感染旋毛虫猪的全血评估试纸的性能，结果显示，不同剂量的试纸都呈阳性，使用集样消化法进行检测，结果并未全部呈现阳性，表明该检测方法具有更高的灵敏度，且操作简便，检测限为0.05 ng/ml，仅需5～10 min即可检测出结果。黄文颖等[17]以羧化铕微球为荧光标记材料制作了试纸，检测牦牛肉中磺胺类药物残留，检测限为1.97 μg/kg，所有样品的添加回收率在90%～115%，其中批内离散系数均低于10%、批间离散系数均低于13%。
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量子点是一种半导体材料，粒径属于纳米级别。量子点吸收光子后价带的电子跃迁到导带，导带上的电子也可以跃迁到价带发射光子，不同量子点粒子的大小可发出不同波长的光[18]。量子点具有良好的稳定性和吸收系数，易于与生物分子结合，并且具有水溶性[19]。由于其独特的光学特性，可用于监测广谱波长等，量子点已经成为有机荧光染料的替代品[20]。徐志远等[21]根据非洲猪瘟病毒（ASFV）VP72蛋白的氨基酸序列筛选合成多肽，并与载体蛋白BSA进行偶联，用来制备鼠源抗ASFV-VP72蛋白的单克隆抗体，将该单抗作为荧光量子点标记的抗体，建立了一种简便、快速、准确的用于ASFV抗原检测的荧光量子点免疫层析试纸，结果阳性符合率为82.1%，阴性符合率为93.8%，该试纸条特异性好、灵敏度高。毛永强等[22]使用量子点检测氨苄青霉素，氨苄青霉素在5.0 ～ 140.0 μmol/L范围内对碳量子点的荧光增强程度呈良好的线性关系，检出限为1.0 μmol/L。
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表面增强拉曼技术（SERS）是一项利用金属的纳米结构增强待测物电磁场的技术，从而使吸附于基底上的拉曼信号放大。SERS增强基底常使用贵金属，例如金、银等。可将多种贵金属组合使用制作基底，不同金属内部的纳米结构不同，因此放大信号的能力也不同，可通过改变基底材料的组成、尺寸、间距、聚焦方式等优化基底。SERS常用于食品安全、医疗诊断、生物分析等领域。SERS技术具有优异的特异性和灵敏度，检测结果准确度高，但是同时需要昂贵的拉曼检测仪配合使用。韦伟等[23]自制金银纳米梭基底，结合癌胚抗原（CEA）的单克隆抗体，实现胃癌的早期诊断。经过实验证明，该检测方法灵敏度高、特异性好，对血清中CEA检测限低至1.22 pg/ml，基于SERS分析平台在胃癌诊断中具有应用价值。冯笛等[24]基于SERS开发了一种银立方体基底和酶促反应相结合的检测方法，检测汗液中的葡萄糖，检测限为0.5 mmol/L，整个过程可在7 min内完成。
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最初，研究人员使用胶体金制备试纸条，用于尿人绒毛膜促性腺激素检测，检测结果依据目测判定，但是该检测方法假阴性率高、检测灵敏度低。随着LFIA技术的发展，也出现了通过图像采集的方法处理检测线的仪器，LFIA测量逐渐实现定量、半定量化。
定量检测的原理是通过对T线和C线的颜色进行定量或半定量分析。为了方便定量检测，通常采用专业仪器测量T线和C线颜色的强度。目前广泛应用的LFIA定量检测仪器主要包括金标检测仪和荧光检测仪，此外，新型的智能手机相机作为检测仪器也开始广泛的应用，可作为家用便携式检测仪进行检测，基于SERS的检测仪等也在逐步的发展研究中。
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胶体金检测技术使用纳米级的胶体金作为标记材料并进行检测，表面带负电荷的胶体金颗粒可以与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合[25]。金标检测仪主要有基于光敏电阻法和图像处理法的检测仪，从而将T线和C线的颜色信号转换成电信号或灰度图像。
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基于光敏电阻法的检测仪是基于朗伯-比尔光吸收定律，利用光电二极管接收试纸条反射光，用相关算法对待测区域采样数值进行处理。光敏电阻法是使用光电导探测器，其阻值会随着照射光信号的强度发生变化，因此入射光强时输出电流大，入射光弱时输出电流小，通过拟合待测物浓度与相关检测值的曲线，从而求出未知检测物的浓度。
该类检测仪的结构一般由信号采集板、LED光源、步进电机组成。检测系统通过步进电机对试纸进行扫描，步进电机的固定架与仪器外壳底部固定连接[26]。试纸两侧位置有光源，试纸条置于信号采集板上。步进电机水平匀速移动，对下方的试纸条进行扫描检测，根据不同测量物选用不同颜色和波长的发光二极管作为系统检测的光源。通过光电二极管接收胶体金试纸条反射光，通过计算转换获得检测结果。
利用嵌入式微控制器，软件部分包括主程序、电机控制模块软件、人机交互模块软件、显示模块软件、存储模块软件。这些软件共同完成仪器的检测流程，包括从开机自检到检测完成的全部流程。
王振江[27]利用绿色光源激发的光敏电阻法开发了一种基于硅光电池的便携金标检测仪。选取0、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 ng/ml这7种不同浓度的克伦特罗溶液作为样品进行检测，结果显示变异系数分别为2.27%、1.92%、2.13%、2.08%、2.18%、1.8%、2.25%，变异系数均低于3%，证明了该便携检测仪具有较高的稳定性。
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基于图像处理的检测仪通过将试纸进行图像信息采集，使用算法进行特定处理，从图像中提取试纸图像的特征值。通常使用CCD或者CMOS来进行光电转换[28]，当光照射到像元上时产生光电流，光强度越强，在每个像元上累积电荷量就越多。主控芯片获得显色图片后，通过算法处理得到T线和C线的显色结果，图像信息经数据转换后在LCD显示。
该类检测仪的硬件主要包括图像传感器、LED光源、电源。依据胶体金的吸收峰波长以及图像传感器的光谱响应，可以选择不同颜色的LED作为系统照明光源[29]。输出的图像在电脑上进行分析处理，得出相应的检测结果[30]。LED光源照射在试纸条带反应区，反射光被图像处理器捕捉，图像传感器将经过滤光片的光信号转化为电信号，通过信号放大等处理后形成原始图像数据。
软件部分是将原始图像数据通过算法进行计算，提取T线和C线的条带信息，获取吸收特征峰曲线，并对曲线进行平滑处理，提取特征峰曲线的特征值并且建立模型，获得浓度拟合曲线，从而输出定量检测值。
郑宇[31]等开发了一种利用图像处理对尿素酶进行定量检测的检测仪。使用CMOS传感器获取图片信息，然后使用k-means均值聚类算法提取T线和C线，T线和C线被转换成灰白色，并且提取出进行计算。采用该仪器检测了3种不同浓度的试纸条的色带的平均灰度值，检测结果显示差异非常小，波动范围小于3%，设备的检测下限为5 mIU/ml，符合临床检测的需要。
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随着许多新型的荧光标记物的广泛使用，也出现了灵敏度更高的荧光检测仪。现有的荧光检测仪主要有基于光电转换的检测仪和智能手机两种模式。基于光电转换的检测仪是通过光电传感器获取T线和C线中的荧光信号并转换成电信号[32]，这种模式需要完整的机电检测系统，使得整套仪器笨重不方便携带，不利于即时检测。新型检测模式使用智能手机自带的相机，利用手机软件可对荧光及化学发光信号进行分析处理，该检测方法在疾病的家庭自检中具有极大的应用前景。
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基于光电转换的检测仪采用光电扫描方式进行荧光层析试条的定量检测[33]。当激发光照射在层析试条上，荧光标记物获得能量发出荧光，光学传感器捕捉到发出的荧光，进而将光信号转化成为电信号，发出的光信号越强，转换的电信号也就越强，根据荧光信号强度进行待测样品溶液的浓度分析[34]。
该类检测仪的硬件系统主要由激发光源、光电检测系统、步进电机等组成。随着步进电机在试纸上方匀速运动，激发光扫描整个试条，在激发光和试纸中放置一面二向色镜，二向色镜用来反射激发光照射到试纸上，待测物由于激发光照射发出荧光，被光电二极管接收，根据获取的电信号强弱进行分析，通过滤波放大电路对信号进行放大，通过模数转换器进行分析，得出数据结果。
姜海燕等[35]利用基于STM32的荧光测流免疫分析仪定量检测C反应蛋白，并通过传统的荧光分析仪平行测定，与该检测装置进行对比，证明其性能。使用3种不同浓度的样品溶液，分别在该检测装置和ESE分析仪进行多次测试，使用检测线峰值和控制线峰值的比值作为信号特征量，检测出该装置的灵敏度为1.95 µg/ml，ESE的灵敏度为1.95 µg/ml，因此该检测仪器的灵敏度较高；线性度测试结果显示，该检测装置的线性相关系数r=0.996，ESE的线性相关系数 r=0.9947，在线性度上该检测装置接近ESE，但ESE检测范围为0.98～32µg/ml，该检测装置检测范围为1.95～256 µg/ml，检测范围更宽；重复性测试结果显示，对应质量浓度ESE的变异系数分别为0.5%、0.2%，该检测装置分别为1.65%、0.6%。由结果可知，该检测装置具有较高的灵敏度、线性度、重复性，可用于临床。
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基于智能手机的检测仪是利用智能手机相机进行图像收集，利用手机应用程序对图像进行分析处理。开发适配手机的配件暗盒，其中可插入检测试纸，从而隔绝外部环境光线变化等对结果分析的影响[36]。暗盒可以通过简单的手动操作使用，因此使用智能手机CMOS相机作为光探测器，非专业操作员也可以进行整个分析。
该类检测仪的硬件系统包括手机配件暗盒以及智能手机，手机配件上包含一个与相机对齐的平凸透镜和一个用于插入暗盒的插槽。
Zangheri等[37]又开发了一种用于赭曲霉毒素A检测的智能手机定量检测仪，在葡萄酒和速溶咖啡两种基质中获得的校准曲线彼此非常相似，这表明预处理程序有效地去除了可能干扰测定的任何样品组分。该测定还显示出良好的再现性，与校准曲线的点相关的相对标准偏差（RSD）始终低于12%（葡萄酒基质）和7%（速溶咖啡基质）。
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SERS作为一种高度灵敏的分析技术，已被用于鉴定各种分析物，如核酸、蛋白质、细菌、细胞和重金属。这种光谱检测方法利用金属表面激发的低能电子使等离子体表面的局域光电场增强，从而引起SERS信号的极大提高。基于SERS的LFIA将SERS的高灵敏度和特异性[38]与LFIA技术的简单、快速和易于操作相结合，因此非常适合临床POCT。然而基于SERS的LFIA的主要不足是测试结果的读数效率较低[39]，并且商用的拉曼散射仪价格昂贵。
基于SERS的LFIA读卡器包括LFIA反应通道、二极管激光器、光谱仪、光纤拉曼探头、步进电机、两轴手动可调平移台、光电开关传感器和触摸屏计算机主板。步进电机安装在可手动调节的平移载台上，并且配有支架，装有LFIA试纸的集成LFIA通道安装在固定在步进电机上的支架上，并且可以通过调整两轴平移台上下移动或来回移动。平移级的上下运动可以控制拉曼探头，使其在T线和C线之间切换检测。
史巧巧等[40]利用基于SERS的检测仪检测猪肉中喹乙醇的浓度。取不同浓度的喹乙醇标准溶液建立标准曲线，结果是随着分析物浓度的升高，拉曼峰强度逐渐降低，在0.1 pg/ml～1.0 ng/ml浓度范围内均呈现较好的线性关系，根据获得的拟合方程，计算出检测灵敏度为0.025 ng/ml，检测限为0.31 pg/ml。测定实验的重现性，在相同浓度的试纸条中，随机测定的点的RSD分别为5.6%、6.3%、3.7%、4.8%和3.1%，说明该方法对于SERS信号检测的精密度较高。
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LFIA检测正在向着精准化的方向发展，传统的标记材料检测灵敏度偏低，因此研究人员致力于研究出更高效的新型标记材料。除了上文中提到的标记材料，还有一些新型标记材料，例如上转换荧光纳米材料，在红外线区域激发，可用于检测核酸、呼吸道合胞病毒等；磁性材料，广泛应用于生物检测和分离之中，纳米级别的磁性材料与抗体结合形成的磁珠可以对分析物进行预浓缩和纯化，从而显著提高灵敏度。随着新型标记物的产生，LFIA的应用也会更加方便和灵敏，趋向家用化，以满足用户日常健康监测的需求。
LFIA检测仪也正在趋向便捷化。目前胶体金检测仪、荧光检测仪以及基于SERS的检测仪的检测精确度和灵敏度都达到了可用于临床检验的程度，但是对高浓度分析物的检测具有限制、重现性较差。对于胶体金检测仪，光敏电阻法的信号响应会因为T线和C线的宽度受到限制，图像处理法也存在对灰度图像的利用不充分的缺点。目前出现多种新型金标检测仪，可通过分析仪检测T线和C线的温度、气压等变化，经过数字转换获得定量检测结果，灵敏度比光敏电阻法高数十倍。对于荧光检测仪，目前出现的新型智能手机荧光检测仪，可通过使用暗盒避免外界环境带来的影响，进一步提高了准确性，使荧光检测仪摆脱需要专用检测仪的限制，逐渐向家用的方向发展。对于SERS检测仪，其灵敏度高、特异性强、检测速度快，但是SERS基底与生物分子会互相作用影响精度、制备复杂，该技术还处于摸索阶段，仍需大量的临床试验进行验证。
随着新型灵敏标记物、新型LFIA检测仪器的发展和应用，LFIA检测项目会更多、更普及，其操作方式会更加智能、便携、家用，其定量结果输出也会更加快速、灵敏、准确，在即时现场检测领域必将发挥巨大的作用。
Research progress on quantitative detection methods of lateral flow immunochromatography assay
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摘要: 侧流免疫层析技术是一项新型的即时检测技术，采用层析膜和标记材料进行检测。该检测技术具有方便快捷、成本低廉的特点，因此被广泛应用于生物医药、疾病检测、食品安全、环境保护等多个领域。传统的侧流免疫层析需要使用肉眼观测，因此只能提供至多半定量的结果，并且有可能存在观测误差。随着各种类型的标记材料和灵敏检测仪器的出现及广泛应用，侧流免疫层析技术逐步实现了对待检测物的定量检测。通过综述识别元件、标记材料、检测仪器等，阐述侧流免疫层析检测系统的研究进展以及目前的应用情况。Abstract: Lateral flow immunochromatography assay is a new instantaneous detection technology that employs a chromatographic membrane and labeling materials for detection. This detection technology is convenient, fast, and inexpensive, and is therefore widely used in a number of different fields, such as biomedicine, disease detection, food safety, environmental protection, and so on. Traditional lateral flow immunochromatography assay relied on visual observation and provided only qualitative or semi-quantitative results. By utilizing various types of markers and sensitive detection devices, lateral flow immunochromatography assay enables quantitative and multi-component detection of the analytes. The research progress on the lateral flow immunoassay detection system and its current applications in the context of recognition elements, labeling materials, and detection instruments were reviewed in this paper.
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Key words:
- lateral flow immunochromatography assay /
- detector /
- biomarker
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拉莫三嗪是一种苯基三嗪类药物，化学名为6-（2,3-二氯苯基）-1,2,4-三嗪-3,5-二胺，属于第二代抗癫痫药物，临床上常被用于治疗部分性发作癫痫、难治性癫痫、青少年肌阵挛癫痫、癫痫持续状态等[1-4]。拉莫三嗪不经细胞色素P450酶代谢，主要由尿苷二磷酸葡醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）作用，与葡萄糖醛酸键合，生成无药理活性的代谢物[5]。同其他抗癫痫类药物一样，拉莫三嗪治疗范围（3～14 μg/ml）较窄，易发生中毒反应。
研究拉莫三嗪治疗的446例患者中有20.88%发生不良反应，最常见的有头痛、皮疹、乏力等，严重不良反应有DIC、Lyell综合征、Stevens-Johnson综合征等，研究认为这可能与拉莫三嗪的血药浓度有关[6-7]。因此，随着拉莫三嗪在临床上的广泛应用，治疗药物监测（TDM）成为指导拉莫三嗪合理用药的一种安全有效的手段。本研究旨在通过中心切割二维液相色谱法，建立测定人血浆中拉莫三嗪药物浓度的方法，便于临床开展拉莫三嗪血药浓度监测工作，为临床个体化用药指导提供监测数据支持。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
Shimadzu LC-20A日本岛津高效液相色谱仪（真空脱气机，分析型色谱泵，SPD双波长检测器）；ALK-108二维液相色谱耦合仪（湖南德米特仪器有限公司）；色谱柱SNCB（T）-1A（硅胶，4.6 mm ×50 mm, 5 µm）、Symmetry C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）、SBX4-MA（树脂，3.0 mm×10 mm,5 µm）均购自湖南德米特仪器有限公司；QUINTIX125D-1CN精密电子天平（赛多利斯（上海）贸易有限公司）；超纯水机（德国Think-lab Corporation）；HC-2062高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。
1.2 试药与试剂
拉莫三嗪标准品（批号：100775-201902，纯度99.9%，中国食品药品检定研究院）；乙酸铵（批号：5666364，纯度98.0%，天津迪马科技有限公司）；甲醇（色谱纯，上海科丰实业有限公司）；乙腈（色谱纯，默克股份两合公司）；VCV-1D移动相（湖南德米特仪器有限公司）；空白血浆（联勤保障部队第九〇〇医院血库提供）；超纯水（实验室自制）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件与原理
第一维色谱系统中，一维色谱柱：SNCB（T）-1A（硅胶，4.6 mm×50 mm, 5 µm），流动相A：VCV-1D移动相[甲醇-乙腈-磷酸铵水溶液（V/V/V=1∶3∶3，氨水调pH至7.0）]，流速：0.4 ml/min；流动相B：水，流速：1.0 ml/min。第二维色谱系统中，二维色谱柱：Symmetry C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm），流动相：乙腈:10 mmol/L乙酸铵溶液（25∶75），流速：1.0 ml/min；中间色谱柱：SBX4-MA（树脂，3.0 mm×10 mm,5 µm）。柱温：45 ℃，紫外检测波长：306 nm，进样量：200 μl。时间程序：0～2 min样品进样和第一维色谱分离；2～4 min目标物通过中间色谱柱转移至第二维色谱；4～10 min目标物在第二维色谱中分离分析。
二维液相色谱将分离原理不同的两支色谱柱经一定接口和柱切换技术耦合在一起，通过加入不同的流动相进行选择性分离。样品在第一维色谱进行初步富集分离，经过纯化后将目标组分利用柱切换技术由中间柱转移系统转移到第二维中，最后目标组分在第二维色谱中分离分析。当目标组分在第二维色谱中分离分析时，纯化柱已经逐渐开始清洗，以备样品的再次进入，由此间隔不断地运行。二维液相色谱系统结构见图1；工作原理示意图见图2。
2.2 拉莫三嗪标准品储备液的配制
精密称取拉莫三嗪标准品7.90 mg,置于100 ml容量瓶中，用甲醇稀释到刻度，摇匀，配制成浓度为79.00 μg/ml的拉莫三嗪标准品储备液，存放在−80 ℃冰箱中备用。
2.3 含药血浆样品的处理
精密吸取含药血浆样品200 μl至1.5 ml EP管中，再精密加入甲醇600 μl沉淀蛋白，涡旋混合1 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液，进样分析。
2.4 方法学验证
2.4.1 专属性
制备空白血浆、空白血浆+拉莫三嗪对照品溶液（浓度为7.90 μg/ml），按照“2.3”项下方法处理，将空白血浆、拉莫三嗪对照品、空白血浆+拉莫三嗪对照品按“2.1”项下色谱条件进样测定，观察有无内源性干扰，如图3所示。结果表明，拉莫三嗪出峰时间为8.506 min左右。血浆中的内源性物质对拉莫三嗪的出峰时间和峰面积无明显干扰（理论踏板数为8 843，对称因子为1.13）。
2.4.2 标准曲线及检测限
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液配制成系列浓度梯度溶液（39.50、19.75、9.88、4.94、2.47、1.24 μg/ml），按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性拟合。得到线性回归方程：Y=146 470X-36 830,r=0.999 9，表明拉莫三嗪血药浓度在1.24～39.50 μg/ml时，线性关系良好，定量下限浓度为1.24 μg/ml（S/N=10），检测限为0.02 μg/ml（S/N=3）。
2.4.3 精密度与准确度
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液配制成浓度为高、中、低（31.60、7.90 、1.98 μg/ml）以及定量下限（1.24 μg/ml）4个浓度的含药血浆样品，每个浓度设置5组平行，按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定。1 d内不同时间测定5次及3 d内每天进样1次，考察其日内和日间精密度/准确度。结果如表1～2所示，高、中、低3个浓度的日内RSD均小于5%，日间RSD均小于10%；日内准确度范围为102.17%~111.17%，日间准确度范围为99.80%~107.31%；定量下限浓度的日内、日间RSD均小于5%，日内准确度为100.65%，日间准确度为100.50%。
表 1 日内精密度/准确度测定结果（n=5）理论浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）标准差 RSD/准确度
（%）31.60 32.28 0.65 2.02/102.17 7.90 8.27 0.24 2.93/104.66 1.98 2.20 0.06 2.74/111.17 1.24 1.25 0.01 0.58/100.65 表 2 日间精密度测定结果（n=5）理论浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）标准差 RSD/准确度
（%）31.60 31.57 1.34 4.23/99.92 7.90 7.88 0.67 8.54/99.80 1.98 2.12 0.19 9.15/107.31 1.24 1.25 0.01 0.52/100.50 2.4.4 回收率
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液稀释成浓度为高、中、低（31.60、7.90、1.98 μg/ml）3个浓度的含药血浆样品，每个浓度设置5组平行，按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果如表3所示，回收率RSD均小于5%，其变化范围在89.95%～96.15%之间。
表 3 回收率测定结果（n=5）理论浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）标准差 RSD
（%）回收率
（%）31.60 30.03 0.58 1.92 95.04 7.90 7.11 0.30 4.19 89.95 1.98 1.90 0.02 0.90 96.15 2.4.5 稳定性
用空白血浆将拉莫三嗪标准品储备液稀释成浓度为高、中、低（31.60、7.90、1.98 μg/ml）3个浓度的含药血浆样品，每个浓度设置5组平行，按照“2.3”项下方法处理后，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别考察血浆样品室温放置24 h、反复冻融3次以及−40 ℃保存2周的稳定性。结果如表4所示，测定浓度/标准浓度比值范围在87.01%~115.88%。符合《中华人民共和国药典》2020版四部通则中，9012生物样品定量分析方法验证指导原则的要求。
表 4 稳定性测定结果（n=5）检测条件 药物浓度
（μg/ml）测定浓度平均值
（μg/ml）测定浓度/标示浓度
（%）室温放置24 h 31.60 33.50 106.02 7.90 8.39 106.25 1.98 2.29 115.88 反复冻融3次 31.60 29.29 92.67 7.90 6.87 87.01 1.98 2.04 103.00 −40 ℃保存2周 31.60 31.05 98.25 7.90 7.80 98.70 1.98 2.11 106.73 3. 讨论
3.1 检测方法的选择
查阅国内外文献可知，目前拉莫三嗪血药浓度测定方法[8-15]有HPLC法、液-质联用法、免疫荧光法。HPLC法测定血药浓度时，须经过复杂的前处理；质谱法的仪器成本和检测成本都较高，且对操作人员要求高，不利于临床推广使用；免疫分析操作简单、速度快，但其检测试剂盒价格昂贵。本研究采用的中心切割二维液相色谱系统是将分离机理不同、互相独立的两根或三根色谱柱以串联方式组合，目标化合物被转移至分析柱后，可对一维柱及中间柱进行在线反向冲洗，可有效减少色谱柱的污染。且与传统HPLC相比，二维液相具有进样体积大（最高可达1 000 µl）、在线净化除杂、富集等功能，可有效避免传统液相色谱测定中因仪器灵敏度和色谱柱分离度的限制，提高临床样本检测的准确性；若质控样品在允许的靶值范围内，则无需每天测定随行标准曲线，可有效缩短临床样本的检测时间，提高仪器的使用率。
高效液相色谱法和液-质联用法大多采用内标法定量，而内标物的选择需考虑其与待测物的物理化学性质是否相似，有时候难以找到合适的内标物；此外，内标物的纯度对定量结果也有很大影响。而二维液相色谱法则采用了外标法定量，在本实验中日内、日间精密度RSD均小于10%，日内准确度的范围为102.17%~111.17%，日间准确度的范围为99.80%~107.31%，以上结果均证明采用外标法是可靠的，不仅实现准确地定量分析，还避免了选取内标的繁琐操作，使得临床上大量样本的检测更具可操作性。除此之外，流动相B还可根据时间程序设定进行自动化调控，早期阶段可增加第一维色谱柱的极性，使待测组分聚集于色谱中，减少损失。一旦样品进入分析阶段，后台即可启动自动清洗系统，自动清洗二维色谱的连接管路、微流控部件与色谱柱，从而确保连续分析期间的系统可靠性，且延长了色谱柱的使用寿命。
3.2 二维液相色谱的优势
本实验选用200 µl的进样量，相比传统HPLC法仅几微升的进样量来说，二维液相色谱法可在线处理大体积进样，实现样品的在线浓缩与富集，有效消除基质干扰，且二维液相色谱法具有的全息反射长光程检测技术可将检测器提高1.2~1.8倍，使得灵敏度大幅度提高；二维液相色谱法还利用双级流体调制控制技术，巧妙的通过辅助流动相-水在线调制一维流动相-VCV-1D移动相，改变流动相特性、提高分离能力；本次实验过程中，通过组合调配理化性质不同的色谱柱，利用其分离能力的不同，增加色谱柱对目标物质的选择性，精准控制目标物质的迁移。对比其他色谱法，二维液相色谱法的分离能力大幅度提高[16]。
3.3 生物样品前处理
目前常用的生物样品前处理方法有蛋白沉淀法、液-液萃取法和固相萃取法。液-液萃取法以及固相萃取法过程复杂且成本较高[17-18]，而蛋白沉淀法能够最大限度地保留样品中的物质，操作简单且成本较低[19]，其中，有机溶剂沉淀法是蛋白沉淀法最常用的方法。血浆或血清样品常采用甲醇或乙腈沉淀蛋白，样品与沉淀剂比例为乙腈最低1∶2，甲醇最低1∶3（通常1∶5以上效果最佳）。本研究实验样品为血浆，且配置标曲所用的溶剂为甲醇，为了避免不同有机试剂对检测的干扰，因此选择甲醇为沉淀试剂，样品与甲醇的比例为1∶3。
3.4 色谱柱的筛选以及流动相的选择
预实验时采用的一维色谱柱是SNCB-1A色谱柱，固定相为硅胶，当含药血浆样品通过色谱柱时，其中的各组分会因其与固定相的亲和力差异而发生不同的吸附或扩散现象，与湖南德米特公司提供的配套试剂VCV-1D移动相互相作用，能实现在线萃取聚焦功能，极大地简化了前处理过程，提高仪器的灵敏度，其结果分离度良好，有较好的峰型，且无拖尾现象，采用“中心切割技术”只将一维中洗脱出来的目标组分切割后再转入第二维分析。而二维色谱柱采用的是非极性的C18柱，进行洗脱时选择性差异取决于不同pH下的溶解性。拉莫三嗪在水中不易溶解，但在氯仿、二氯甲烷等有机溶剂中易溶解。目前常用的流动相包括甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸盐缓冲液等。参考以上流动相进行预实验，拉莫三嗪并不能完全分离分析。考虑到拉莫三嗪是一种弱碱性的药物，在酸性条件下易于质子化，而在碱性条件下易于去质子化。因此，为了保证其在分离过程中的稳定性和分离效果，需选择适当的缓冲液进行调节；又因拉莫三嗪分子结构中含有芳香环，具有一定的极性，则需选择一定极性的流动相来实现其与固定性的相互作用，从而实现有效分离。经多次实验后，确定二维流动相（乙腈-乙酸铵）比例为25:75，在此条件下拉莫三嗪具有良好的峰型且无拖尾现象。
综上考虑，本研究选用色谱柱SNCB-1A、Symmetry C18作为二维液相色谱法的第一维色谱柱、第二维色谱柱，VCV-1D移动相为第一维流动相，乙腈-乙酸铵溶液为第二维流动相。
3.5 进样量的选择
相比于普通液相的进样量，二维液相色谱的要大十几倍，主要是因为一维色谱柱的柱长比较短，仅50 mm，因此，柱压不会因为较大的进样量而明显增加。除此之外，还有流动相B的洗脱作用，可使待测样品在色谱柱上富集，故当进样量增加时，峰型也不受影响。本实验中进样量采用200 μl，是基于定量限需满足临床血药浓度的测定要求来确定的。若还需提高检测灵敏度，进样量最高可以达到1 ml。
4. 结论
本研究建立的中心切割二维液相色谱测定方法操作简单、稳定性好、灵敏度高、重现性好，便于临床开展拉莫三嗪血药浓度监测工作，可为临床个体化用药指导提供可靠的监测数据支持。
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