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微透析(microdialysis,MD)在体取样新技术[1-4]逐渐成为药动学研究中一种日趋成熟和实用的方法。由于其探针开发的多样性和微型化,定位更加准确,并利用极微量(一般若干微升)的透析装置实现在体、实时、在线取样和监测。能在微创条件下满足定量、定性、定位、连续动态取样分析等要求,且不破坏生物体内环境对靶器官或组织内的内源性和外源性物质进行取样[5-6],在采用微透析技术进行体内采样测定前,必须先在体外进行微透析探针增量、减量两种方法的回收率测定,以摸索出适合体内测定时的条件,以确保将微透析样品测得的浓度准确地折算为采样部位的组织浓度。
头孢拉定(cephradine)又称先锋霉素Ⅵ、头孢菌素Ⅵ等,其结构式见图1,是临床常用的第一代头孢菌素。头孢拉定耐酸,可以口服、吸收好、血药浓度较高,特点是耐β内酰胺酶,对耐药性金黄色葡萄球菌及其他多种对广谱抗生素耐药的杆菌等有迅速而可靠的杀菌作用,主要以原形经尿排泄,尿中浓度较高。临床主要用于呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织等的感染,如支气管炎、肺炎、肾盂肾炎、膀胱炎、耳鼻咽喉感染、肠炎及痢疾等,也常用于预防外科术后感染[7]。本研究使用微透析技术与液质(LC-MS/MS)这一灵敏度高、检测速度快、前处理方便的分析方法相结合,测定头孢拉定微透析体外回收率,并考察回收率的影响因素,为进一步研究头孢拉定在前列腺组织、血液双位点的药动学提供可靠依据。
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G-6410型高效液相色谱质谱联用仪(美国安捷伦科技有限公司);DL-180A型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司);AG285型电子分析天平(Mettler Toledo仪器上海有限公司);微透析系统包括四通道微量注射泵,双通道微量收集器(瑞典CMA公司);微透析同心圆探针(瑞典CMA公司,CMA 20Elite,膜长10 mm)。
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乙腈为色谱纯(美国Tedia公司);头孢拉定对照品(中国食品药品检定研究院,纯度88.4%);林格溶液(辰欣药业股份有限公司);水为三蒸水(海军军医大学附属长海医院制剂室);其他试剂均为分析纯。
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色谱柱:Agilent ZORBAX Extend-C18柱(2.1 mm × 100 mm,3.5 μm);流动相:乙腈-0.1%甲酸水溶液(20:80);流速:0.2 ml/min;进样量:1 μl;柱温:30 ℃。
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ESI+离子源,阳离子MRM扫描模式,干燥气体温度:350 ℃,干燥气流速:8 L/min,雾化压力:15 psi,裂解电压120 V,碰撞能量6 eV,定量离子对为m/z=350.1→176.1。
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在Product Ion 模式下对碎片离子进行定量分析,如图3所示,其中m/z=176.1的碎片离子响应值最高且稳定。因此,选择的监测离子为m/z=176.1的碎片离子。
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精密称取头孢拉定对照品适量溶于50 ml的棕色容量瓶中,加林格溶液超声溶解使成浓度为50 μg/ml的对照品储备液。将此溶液放于4 ℃冰箱中避光保存。
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吸取适量“2.1.5”项下对照品储备液,用林格溶液稀释成系列浓度为20 000、10 000、2 000、500、100、25、10 ng/ml的头孢拉定标准品溶液,按上述液质条件进样。以质量浓度为横坐标(X,ng/ml),峰面积为纵坐标(Y)进行线性回归,绘制标准曲线,以加权平均数得回归方程为:Y = 34.096 2X + 150.818 5,r = 0.999,表明头孢拉定在10~20 000 ng/ml范围内线性关系良好,定量下限为10 ng/ml。
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在本实验条件下,分别取林格溶液空白样品、微透析溶液对照品进样,记录峰面积。结果表明林格溶液对头孢拉定的测定无干扰,如图4。
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同法配置浓度为25、500、10 000 ng/ml的低、中、高头孢拉定对照品溶液,同一日平行操作6次,连续测定3 d,按《中国药典》(2015年版)生物样品定量分析方法计算日内精密度、准确度和日间精密度、准确度。结果显示,头孢拉定对照品连续进样6次,连续测定3 d,计算结果见表1,说明方法的精密度、准确度良好。
表 1 头孢拉定的日内和日间精密度、准确度考察结果(n=6)
标准浓度(ng/ml) 日内 日间 检测浓度(ng/ml) 精密度(%) 准确度(%) 检测浓度(ng/ml) 精密度(%) 准确度(%) 25 24.60±0.84 3.40 98.39 25.49±1.63 6.39 101.94 500 494.87±3.67 0.80 98.97 493.23±4.49 0.91 98.65 10 000 10 269.52±82.90 0.74 102.69 10 325.06±190.40 1.84 103.25 -
用林格溶液配制浓度为10 000、100 ng/ml的头孢拉定对照品溶液,分别在0、1、2、4、6、8、12 h进样测定,将结果与0 h进行比较。按《中国药典》(2015年版)生物样品定量分析方法计算所得的低、高浓度在室温25 ℃和4 ℃的稳定性,结果见表2,表明头孢拉定对照品溶液在12 h内稳定。
表 2 头孢拉定不同温度稳定性考察结果(
$\bar{ x} \pm { s}$ )标准浓度(ng/ml) 检测浓度(%) 室温(25 ℃) 低温(4 ℃) 低浓度(100) 101.64±4.24 103.73±6.30 高浓度(10 000) 104.29±2.51 103.79±1.73 -
减量法:将同心圆探针(膜截留相对分子质量2 000)浸入装有空白林格溶液的200 ml微透析体外回收率校正实验反应瓶中,磁力搅拌器转速200 r/min,水浴温度设置为(37.0±0.5)℃,用含有一定头孢拉定浓度(C灌流液)的林格溶液以一定流速进行灌注。平衡0.5 h后收集一个空白样品,每种灌流速度下收集 5 份样品,每份30 μl,且每个流速之间平衡20 min。在所建立的液质条件下测定透析液中药物含量(C透析液)。减量法公式:
RL(%) = (C灌流液 – C透析液)/C灌流液 × 100%
增量法:将同心圆探针(膜截留相对分子质量2 000)浸入含有一定头孢拉定浓度(C灌流液)的200 ml微透析体外回收率校正实验反应瓶中,磁力搅拌器转速200 r/min,水浴温度设置为(37.0±0.5)℃。微透析灌流液为一定灌流速度的空白林格溶液,平衡0.5 h后收集样品,每更换一次灌流速度后平衡20 min,每种灌流速度下收集5份样品,每份30 μl,共收集15份。在所建立的液质条件下测定透析液中药物含量(C透析液)。增量法公式:
RG(%) = C透析液/C灌流液 × 100%
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分别采用增量法、减量法研究流速对探针回收率的影响。以500 ng/ml的头孢拉定药物溶液,灌流速度依次为1.0、2.0、3.0 μl/min测定,并按公式计算探针回收率,结果见图5。结果显示,灌流速度从1 μl/min增至3 μl/min时,随着流速增加,回收率降低。而且,头孢拉定浓度为25、10 000 ng/ml 的回收率试验结果与此相似。
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分别用增、减量法研究流速为2 μl/min,头孢拉定溶液浓度分别为25、500、10 000 ng/ml时的回收率,结果见图6。结果显示,当以2 μl/min的流速进行灌流时,同一探针不同浓度采用单因素方差分析测得的回收率均无显著性差异(P>0.05)。表明探针回收率与药物浓度高低无关。
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MD最初可追溯到20世纪60年代,当时不同类型的在体取样技术首次用于测定药物、介质、神经递质和代谢组织浓度[10-11],其原理是利用物质的扩散性和半透膜的选择透过性,探针头部半透膜位于组织内,且导管内液体与细胞内液体保持平衡,类似一个封闭的无孔毛细血管。这是一项为处在具有明显界限隔室里的游离型药物提供连续信息的微创技术。例如,成为测量细胞内和细胞外靶区浓度的标准工具。许多综述文章[12-17]已经证实MD是临床前和临床药学研发的有效工具。MD用于本研究的原理是基于血液-组织屏障的存在,屏障存在对血液浓度的依赖可能误导靶区浓度及药效学。在多年不断的研究中,人们发现血-前列腺屏障(BPB)的存在是影响前列腺炎药物治疗不可忽视的重要因素[18-20]。受采样和测定技术的限制,截止目前尚未明确BPB的具体部位和物质基础,故而很难研究其药物分布的特点和屏障作用的机制[21-23]。而MD有望解决前列腺组织特殊的部位和大小对技术上的高要求。有利于后期动物前列腺实验的开展。
微透析探针的回收率分为体内和体外,校正方法也有体内和体外之分。而体内校正应用反透析法即减量法的前提是探针的回收率与传递率近似相等,所以需要进行体外增、减量法的回收率试验。本实验结果可看出,体外回收率与流速成反比,与探针周围液体浓度无关,结果与多数报道相符[9, 24],由于待测部位的药物浓度是动态变化的,说明微透析技术可以用于体内药物浓度的测定。MD样品体积也与灌流速度成正比,在相同时间内流速越高体积越大,但是探针回收率也有所降低,这就要求分析方法检测限更低;而流速越低,透析液浓度越接近组织浓度,但为了收集足量样品体积用于检测,同时考虑时间分辨率问题须选择合适流速。此外,增、减量法所得到头孢拉定体外回收率结果相近,说明减量法即反透析法可以用于头孢拉定的体内回收率实验,并以此为体内药动学实验提供参考。
Microdialysis recovery of cefradine in vitro
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摘要:
目的 测定头孢拉定微透析体外回收率及影响因素。 方法 采用微透析浓度差法(减量法、增量法)和液质联用技术(LC-MS/MS)测定头孢拉定的体外回收率,并考察流速、浓度对回收率的影响,以探讨微透析技术用于头孢拉定体内药动学研究的可行性。 结果 所建立的方法在要求范围内线性关系良好,方法灵敏可靠。增、减量法测得的回收率无显著性差异。相同条件下,探针体外回收率随流速增大而减小,不受探针周围药物浓度的影响。 结论 微透析技术可用于头孢拉定药动学研究,减量法可用于头孢拉定微透析体内回收率和药动学参数的测定。 Abstract:Objective To determine the in vitro recovery rate and influencing factors of cefradine microdialysis. Methods Two different methods (loss method, gain method) of microdialysis concentration and LC-MS/MS were used to determine the in vitro recovery rate of cefradine. The effect of flow rate and concentration of the perfusate on the recovery rate were investigated. To explore the feasibility of microdialysis technology for pharmacokinetic studies in cefradine. Results The LC-MS/MS analysis method was linear in the required range and the method was sensitive and reliable. There was no significant difference in the recovery rate measured by gain or loss method. Under the same conditions, the in vitro recovery of the probe decreased with increasing flow rate, independent of the drug concentration around the probe. Conclusion Microdialysis technique could be used to study the pharmacokinetics of cefradine, and loss method could be used to determine the in vivo recovery rate and pharmacokinetics of cefradine on microdialysis. -
Key words:
- microdialysis /
- cefradine /
- in vitro recovery
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自1843年11月17日开埠以来,上海以其“开放包容、经济发达、生活精致、文化繁荣”等独特的地域特征,渐渐形成了独特的海派文化特质,即“海纳百川、兼容并蓄、开放创新、追求卓越”,而海派中医则是海派文化的重要组成之一[1]。海派著名老中医善用膏方,逐渐形成了独具特色的“海派膏方”。海派膏方因人、因时、因地制宜,越来越迎合现代人治病、食补或保健的需求,“海派膏方热”迅速蔓延。海派膏方的应用虽得到广泛推广,且效果良好,但其历史渊源未见详细报道,故笔者查阅相关文献,结合实际,浅析海派膏方的历史渊源,梳理其各个阶段的发展情况,并进行总结归纳[2],以期更全面地了解与掌握海派膏方,为人们提供更优质的服务。
1. 海派膏方相关概念
1.1 海派文化
上海,地处吴越中心地带,地理位置优越,处于长江的入海口,是典型的冲积平原,经济发达,物产丰富,交通也比较便捷,各种物质、信息、人员在此汇聚,逐渐形成了特有的“海派文化”。海派文化的独特之处在于,它不像中国其他地区一样只有一种文化,它既有江南地区传统的吴越文化,又包含了自从开埠以后汇入的西方各国文化;它不注重功名和官衔,而看重实际利益和个人的奋斗。正是这种“海纳百川、开放包容”的“海派文化”,给了许多优秀、有才华、勇于拼搏的知识分子包括中医师汇聚上海的动力,为他们提供了发展的舞台[3]。同时,四季分明的气候特点让上海人十分注意遵循时令的变化而采取不同的养生保健措施,与中医的“天人合一”理论相合。俗话说“冬令进补,夏天打虎”,这样的传统在上海更是根深蒂固,除一般食补以外,人们提出了更高的医疗保健需求。
1.2 海派中医
“海派文化”对近现代的中国社会产生了一定的影响,而“海派中医”则是组成海派文化的一个无可替代的部分[1]。“海派中医”是以“海派文化”为滋生土壤,以中西医学兼容并蓄的名医群体为代表,尤其是许多享誉海内外的名医群体,在一种独特的地域环境下形成的医学文化现象[4]。“海派中医”中包含了不同的行医风格、不同的医学门派以及不同的学术见解的各科医家流派,共同组成了“海纳百川、有容乃大”的海派中医流派[5]。
1.3 海派膏方
海派著名老中医一直重视膏方,逐渐形成了“海派膏方”。彼时北方膏方仍以巩固宿疾、治疗为主,并无对时令的要求。至清代后期,南北差异日益显著。在上海这种独特的经济、文化和地理气候影响下,形成了自身独特的“海派膏方”特点,即“补中寓治,治中寓补,补治结合”。海派中医在开具海派膏方时,较少使用攻伐作用强的猛药,例如芒硝、大黄等,而是用药比较温和,阿胶、龟板、熟地、人参等补阳、补阴、补血、补气等性情温和的补虚之品较为常见。海派中医在组方时会辨证分型治疗,使得海派膏方并不局限于补益这一种形式。此外,海派膏方还首次提出了“开路方”的思想,意思就是若患者本来其体内就有湿、痰、瘀等淫邪或者有一定程度上的脾胃消化不良,则在服用海派膏方前,先使用化湿健脾的药物,使得脾胃健运,防止“闭门留寇”。“开路方”同时也是对患者的身体进行一次试探性的调补,以此来观察其用药后的反应,为膏方正式调补提供“开路”基础[6]。最终逐渐形成了先用“开路方”祛邪扶正、健脾开胃,再给予膏方滋肾固精、益寿延年的治法[7]。
2. 海派膏方的起源与发展
据文献报道,“海派中医”始于清末民初[4],所以本文从清代开始浅析海派膏方的发展轨迹。
2.1 清代时期
江南地区是膏方文化的发源地,而上海则为江南地区膏方的中心[8]。上海地区原属江苏,还未开埠时,中医师就已经有了开膏方的习惯。清代早期,沪上名医沈鲁珍(1658—1738年)开具的膏方是典型的素膏,其用法也与现在的膏方无差[9]。在其《沈氏医案》一书中,记载了多个与膏方有关的医案,例如崇明范锡凡案,范氏患痰火之哮喘,除豁痰降气清火之煎剂外,沈氏处以膏方,即以煎方去桑皮、甘草、莱菔子,加梨汁、莱菔汁、地栗汁、竹沥、姜汁,用饴糖四两,烊入收贮,燉热不时挑化[9]。又如孙采邻提出:“煎膏加蜜成规:凡药一两,煎膏三钱。每膏一两,加白蜜二钱,此成规也。”这基本上成为了清代膏方的统一制作标准。这个时期的冬令膏方无论是在遣方布药上,还是在胶类和收膏的方法使用上几乎与现在的膏方没有差别[7]。
在清中后期时,冬令膏方已见端倪,但却是在诸案中星星点点的散落出现,在流传的一些名医的膏方手稿中可见。这一时期的海派名医张氏内科第八代传人张玉书(1822−1867年)善于给患者开膏方,上海历史博物馆收藏了其留存的上百份膏方处方原件,其后人张骧云留存的膏方手稿收藏于上海中医药博物馆[6]。
在清代晚期,膏方走向民间,冬令膏方开始在江浙一带兴盛起来,这个时期的膏方很大一部分都是在冬季服用,其中夹杂的一些传统膏方的应用已较少,而且胶类、糖类等的使用方法也与现代相似[10]。
此时期的“孟河四大家”之一,海派名医丁甘仁(1865−1926年)在其撰写的《丁甘仁医案·膏方》中出现了“膏方”专章[10]。
2.2 民国时期
民国时期(1912−1949年左右),膏方发展已经比较成熟,而且在人民群众中拥有了良好的根基,成为了人们治病养生的首选[10],尤其是冬令膏方,成为一种冬令进补膏方的潮流。这个时期的北京同仁堂、上海雷允上等很多老字号的中药堂店推出了自制的成品膏方,例如葆春膏、八仙民寿膏等,发展前景十分广阔[2]。
民国时期,沪上名医大家秦伯未(1901−1969年)撰写了《膏方大全》和《谦斋膏方案》,这两本书被看作是最早的膏方方面的专著,为膏方的未来发展奠定了理论基础以及临床应用规范[9]。其中,《膏方大全》对膏方的发展的贡献尤为巨大,总结为以下三点:第一,对膏方的名称下了定义。“膏方者,盖煎熬药汁成脂液而所以营养五脏六腑之枯燥虚弱者也,故俗亦称膏滋药”。第二,明确了膏方的性质和用途。“润泽、滋补”是膏方的主要性质,“膏方并非单纯之补剂,乃包含救偏却病之义”。第三,创立了膏方施治的法则。“须视各个之体质而施以平补、温补、清补、涩补;亦须视各个之病根,而施以生津、益气、固精、养血”[11]。即:膏方在选药时要辩不同的体质、不同的病因而不同施治。膏方是以治疗疾病为主,不能把膏方看作是唯一进补之品而盲目进补[12]。这本书已经成为了中医师开膏方的准绳,更是一些年轻的中医师们学习、借鉴膏方的书籍首选[10],甚至现代膏方的药材选配、制作方法等也以该书中的内容为规范[2]。而《谦斋膏方案》则是记载了其本人运用膏方的临证验案[2]。
此外,民国时期还有很多其他海派中医,如李平书、张骧云、夏应堂、余伯陶、张山雷等[13]亦为海派膏方的发展起到了推动作用。
2.3 近现代时期
近现代时期海派膏方进入了迅猛发展阶段。在大量使用海派膏方的同时,冬令膏方的理论体系也初步建立。上海名医既继承了以前的膏方传统,又结合理论和实践做了进一步的探索和研究,使得膏方上了一个新台阶。
1984年,上海中医药大学附属龙华医院首次开设膏方门诊,并且形成了一套规范、全面的炮制流程和标准[2]。随后,江苏、浙江等地模仿上海地区也陆续开设了膏方门诊。一些中药名店也开始推广膏方的应用,例如上海雷允上、杭州胡庆余堂、北京同仁堂等。伴随着膏方门诊数量的增加以及膏方专著的面世,膏方的发展越来越受到医学界的关注和重视,也越来越体现了膏方的临床应用价值[14]。
这个时期对膏方的发展起了重要作用的海派中医有:祝味菊、黄文东、蔡香荪、陈道隆、程门雪、严苍山等名家,并且有膏方医案流传[9]。
2.4 现代时期
进入新世纪,海派膏方的发展也进入了新的阶段。上海掀起了一股“海派膏方热”,老百姓们趋之若鹜,尤其是冬令时节,各个中医医院的膏方门诊都排起了长队。数量上的大幅增长催生出了膏方的工业化大生产,逐渐取代了作坊式的膏方生产[9],这一点从海派膏方的包装上可以看出:所用瓷罐越来越漂亮、精美,而且出现了由包装机器生产的真空袋装膏方,既定量,又密封,服用、携带也方便。伴随着一系列生产管理、经营规范的出台,膏方的发展一直保持在健康向上的轨道上,同时,膏方的生产制作方面也上升了新台阶,例如在卫生条件、质量控制等方面[9]。高效液相色谱法、气相色谱法及薄层色谱法等是在膏方质量控制中运用最多的检测手段,而高效液相色谱法是其中的重要检测方法[15]。
最早采用海派膏方制备传统工艺制作的医疗机构——上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院,独立制作加工古法炮制海派膏方,是目前上海地区唯一一家具备自制膏方能力的医院。其在传统中医膏方熬制技艺的基础上,形成了独一无二的“海派中医膏方熬制技艺”——主要包括审方、配方、煎熬前期准备、中药饮片的煎煮、中药药汁的浓缩、收膏、装膏、凉膏、成膏,每个步骤均有特定的规程。最终制备而成的“岳阳膏方”可以达到“其黑如漆,其亮如镜,入口即化”的最优质量。海派中医膏方熬制技艺的主要传承人是郭庆标、鲍忠华、徐玲玲、年华等。其中,徐玲玲作为海派中医膏方熬制技艺的领军人物,在膏方的制备中继承了海派中医膏方熬制技艺学说,并在制膏中广泛应用“海派中医膏方熬制技艺”得到了较好的继承与发展,推动了海派膏方的传播与发扬。
师从张氏第十二代传人张伯讷及七代中医世家刘树农教授的朱抗美,是上海中医药大学附属曙光医院教授,她对海派膏方的贡献可谓是开创性的,从海派膏方的最初发掘、整理,到后续的推广、应用等方面都有她忙碌的身影。
此外,上海目前有15项海派中医流派传承研究基地建设项目,包括丁氏内科、顾氏外科、石氏伤科、陆氏针灸、徐氏儿科、张氏内科、颜氏内科、朱氏妇科、蔡氏妇科、魏氏伤科、丁氏推拿、夏氏外科、董氏儿科、杨氏针灸和恽氏中西医汇通[16]。这些项目将会持续推动海派中医流派的传承,大力促进海派中医流派特色的发扬,同时也为海派膏方的传承与发展做了基础铺垫。
海派膏方文化的影响力越来越大,其衍生的相关文化产物也越来越普及,例如膏方节、开炉仪式等活动[6],而“海派膏方”也越来越被推崇为“膏方之首”。
3. 小结
综上所述,海派膏方从清代到民国再到当代,逐渐走向兴盛[10]。时至今日,服用膏方不仅仅是治病,人们对其提出了更高的医疗保健需求,而海派膏方正好满足了这一需求。2009年,上海全市开出了大约15万料膏方,此后,该数字保持每年10%以上的增长速度,膏方热成为了一种流行趋势。自上世纪80年代中期起,上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院恢复开展由中医专家主持的膏方门诊,并设立专用场地,以传统工艺自制加工膏方。每年都有许多专程上门请中医专家把脉、定制服用“岳阳膏方”者,在上海、浙江、江苏、北京和港澳台地区都能看到“岳阳膏方”的“身影”,岳阳医院已成为中医膏方研究和应用的主要基地之一。岳阳医院的“海派中医膏方熬制技艺”已经获得了上海市虹口区非物质文化遗产的批准,同时“岳阳膏方”的研究基地也成为了长三角膏方联盟的副会长单位。目前,全国各地的膏方都有海派膏方的痕迹。在当前广阔的市场和发展前景下,海派膏方的未来发展既有“大显身手”的机遇,也有“披荆斩棘”的挑战,我们要在保持传统中医传承与根本的基础上,推陈出新,使海派膏方的海派中医特色更“传统”,借助现代科技手段的发展更“新颖”,向着更加有利于现代膏方的可持续方向发展,像熠熠生辉的太阳源源不断绽放新光芒。
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表 1 头孢拉定的日内和日间精密度、准确度考察结果(n=6)
标准浓度(ng/ml) 日内 日间 检测浓度(ng/ml) 精密度(%) 准确度(%) 检测浓度(ng/ml) 精密度(%) 准确度(%) 25 24.60±0.84 3.40 98.39 25.49±1.63 6.39 101.94 500 494.87±3.67 0.80 98.97 493.23±4.49 0.91 98.65 10 000 10 269.52±82.90 0.74 102.69 10 325.06±190.40 1.84 103.25 表 2 头孢拉定不同温度稳定性考察结果(
$\bar{ x} \pm { s}$ )标准浓度(ng/ml) 检测浓度(%) 室温(25 ℃) 低温(4 ℃) 低浓度(100) 101.64±4.24 103.73±6.30 高浓度(10 000) 104.29±2.51 103.79±1.73 -
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