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白血病是一类由造血干细胞恶性增殖引起的以出血、贫血、感染、不同程度的肝、脾、淋巴结肿大等为症状的造血系统恶性肿瘤[1]。目前，化疗是白血病治疗的重要手段，但复发率高、预后差、易产生耐药性等情况使得其对白血病的治疗效果大大折扣[2-3]。因此，寻找低毒、高效的治疗药物来提高疗效并降低复发率是治疗白血病的关键[4-5]。中医古籍中无白血病病名，但据其临床特点，应归属于“急劳”“热劳”“髓劳”“血证”“髓枯”“虚劳”等范畴[6]，由正虚邪实导致形成本虚标实之证。中药有可改善症状、减低化疗后毒副反应等特点，在白血病的治疗方面具有独特优势[7]。
定清片是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院（本院）血液科黄振翘教授、周永明教授在“扶正祛邪”理论指导下，经多年潜心研究，逐步改良而成的一种治疗白血病的有效制剂，由雄黄、黄芩、人工牛黄、栀子、陈皮、冰片等12味药组成[8]。方中诸药配伍，共奏益气养阴、清解邪毒之功，使标本得治、虚实共调。定清片在临床使用中取得了很好的疗效，在临床上定清片联合化疗治疗急性髓系白血病患者的西医疗效总有效率为80.0%，中医证候疗效总有效率为93.34%，缓解率66.7%，高于化疗治疗，还可显著改善患者临床症状，减轻化疗引起的常见毒副反应[9-10]。实验表明，定清片在体外能抑制人白血病HL-60细胞增殖，其作用机制可能与影响细胞周期和诱导细胞凋亡相关[11]，但其具体作用机制尚不明晰，需要进一步研究。
本研究利用网络药理学及分子对接技术，探讨定清片治疗白血病的活性成分和作用靶点，以期阐明其可能的作用机制，为定清片用于白血病的临床治疗提供理论依据。
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本研究通过检索TCMSP数据库（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以OB≥30%，DL≥0.18[12] 作为筛选条件选出定清片的有效成分及对应的靶点信息。对于TCMSP数据库没有的中药，通过HERB数据库（http://herb.ac.cn/）筛选成分，在Pubchem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载有效成分的2 D结构，并在SwissTargetPrediction数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）中输入有效成分的2 D结构进行检索，以“Probability>0.1”为条件对靶点进行筛选。最后利用UniProt数据库（https://www.uniprot.org/）将筛选到的靶点转换为对应的标准基因名。
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在OMIM（https://www.omim.org/）、DisGeNET （https://www.disgenet.org/）和GeneCards（http://www.genecards.org/）数据库，以关键词“Leukemia”进行检索，获取白血病相关疾病靶点，在Venny2.1在线平台导入药物与疾病靶点，绘制药物-疾病共有靶点韦恩图，获得定清片治疗白血病的潜在靶点。
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将药物、活性成分、疾病靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-成分-疾病靶点” 网络图。
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将共有靶点导入 String 数据库（https://cn.string-db.org），种属选择“homo sapiens”，设置置信度为0.4，隐藏游离节点，其他参数保持默认设置，输出后将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络，应用MCODE插件，识别密集连接的网络特征，进一步筛选核心靶点群落。
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将物种设置为“homo sapiens”，利用DAVID数据库（https://david-d.ncifcrf.gov/）， 进行基因本体论（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。富集结果以P<0.05为标准进行筛选，通过微生信在线软件（http://www.Bioinformatics.com.cn/）进行数据可视化处理。
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用RCSB PDB数据库（https://www.rcsb.org/）下载核心靶点的蛋白结构，借助Pymol软件去除蛋白的水分子和小分子配体。通过Pubchem数据库获取成分的3 D结构，运用OpenBabel-3.1.1软件将小分子结构转换为mol 2格式。再通过AutoDock vina软件对小分子配体和蛋白受体进行预处理并进行分子对接，得到靶点蛋白和化合物对接的最低结合能，运用Pymol软件将对接结果进行可视化。
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定清片由12味药组成，通过数据库搜集共获得82个活性成分及439个作用靶点。通过疾病数据库得到白血病相关靶点1 878个，将疾病靶点与活性成分靶点进行交集，绘制韦恩图（图1），得到169个共有靶点。将这169个共有靶点导入Cytoscape中，删除与靶点无交集的孤立成分后绘制“药物-成分-靶点-疾病”网络图（图2），共获得249个节点、712条边。根据网络的拓扑分析，筛选出度值较大的活性成分有槲皮素（97）、桑黄素（78）、山柰酚（75）、木犀草素（61）、川陈皮素（33）、汉黄芩素（20）和柚皮素（17）等，这些度值较大的化合物可能是定清片治疗白血病的潜在活性成分。
图 1 药物-疾病靶点韦恩图
图 2 定清片治疗白血病的药物-成分-靶点网络
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将169个共有靶点导入STRING数据库，将得到的文件导入Cytoscape软件进行可视化处理（图3A），获得PPI网络图。通过分析可知网路中共有162个节点（靶点蛋白）、1 817条边（蛋白相互作用），颜色由深变浅代表度值由大变小。按照度值大小排名靠前的靶点有TP53、AKT1、CASP3、STAT3、TNF、MYC、EGFR、JUN、BCL2等，选取度值最高的靶点绘制核心靶点PPI网络图（图3B），这些可能是定清片治疗白血病的关键靶点。
图 3 定清片治疗白血病共有靶点的PPI网络与核心靶点网络
为进一步探究靶点间的集落关系，对PPI网络开展MCODE子簇分析，得到评分最高的4个基因簇（图4）。其中基因簇1包含31个靶点，2含27个，3含7个，4含8个。评分最高的基因簇1中包含了31个关键靶点，有FOS、IL-2、EGFR、TP53、ICAM1、MAPK3、MAPK14、IFNG、TGFB1、MYC、NFKBIA、HIF1A、CREB1、ESR1、BCL2、TNF、IL-10、AKT1、IL-6、IL-1B、MMP9、CCL2、JUN、CXCL10、PTGS2、IL-4、VCAM1、STAT3、IL-1A、CASP3、CXCL8。
图 4 富集分子复合物检测（MCODE）分析中排名前4位的基因簇
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为聚焦核心靶点的相互作用，对基因簇1中的31个关键靶点进行GO和KEGG通路富集分析，最终得到GO富集条目431条。其中，生物过程（BP）368条，细胞组成（CC）19条，分子功能（MF）44条。通过GO富集分析发现，BP主要包括RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、基因表达的正调控、炎症反应、细胞凋亡过程的负调控等；CC主要包括细胞外间隙、转录因子复合物、大分子复合物等；MF主要包括酶的结合、细胞因子活性、相同蛋白质结合等（图5）。KEGG信号通路有138个条目，相关通路主要有TNF信号通路、IL-17信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、脂质和动脉粥样硬化和癌症信号通路等（图6）。
图 5 定清片作用靶点的GO富集分析
图 6 定清片作用靶点的KEGG通路富集分析
为进一步探究其作用机制，以KEGG分析获得的TNF、IL-17信号通路为重点研究对象，探讨药物、活性成分、核心靶点的关系。通过分析发现，信号通路中包含的核心靶点有7个，分别为AKT1、CASP3、MMP9、TNF、JUN、IL-6、MAPK3。这7个核心靶点与定清片中相关活性成分对应，构建活性成分-关键靶点-通路网络（图7），包括36个节点和75条边。核心靶点对应得到的13个活性成分为:槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素、刺槐素、β-谷甾醇、汉黄芩素、吴茱萸次碱、川陈皮素、桑黄素、睾酮、黄芩素、芒柄花素等。这些成分存在于黄连、太子参、黄芩、黄柏等8味药材中，通过调控核心靶点参与了TNF与IL-17信号通路的调节，可能在定清片治疗白血病的过程中发挥重要作用。
图 7 子网络A的药物-成分-靶点-通路图
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采用分子对接技术，选择药物-疾病共有靶点和基因簇1的“药物-成分-靶点-通路”网络图中节点度值最高的核心靶点蛋白，包括TP53、AKT1以及MMP9、CASP3和TNF，与排名靠前的活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、刺槐素和柚皮素（图8）进行分子对接分析。化合物与靶点的结合能越低，表明其可能有更好的相互作用。从表1的结合能结果可知，定清片中的活性成分与核心靶点蛋白有一定的相互作用，例如槲皮素，与多个靶点的结合能均小于−20.93 kJ/mol，被认为可能有较好的结合性，其中与AKT1的结合能最低（−41.03 kJ/mol），表明其与AKT1的结合能力最强，槲皮素可能与蛋白上的TYR-272、ASN54、GLN79、THR211残基通过氢键等相互作用（图9），其他活性成分均与对应的大分子蛋白上的关键残基存在相互作用，对接可视化结果见图9。这些结果提示，定清片中的多种化合物成分与白血病的相关核心靶点有良好的亲和性。
图 8 定清片主要活性成分的化学结构式
表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
图 9 分子对接示意图
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定清片是本院黄振翘教授和周永明教授通过多年临床实践拟定的经验方，对白血病的疗效得到了普遍认可。其由12味中药组成，每味药物中又有许多不同的化合物。且其对白血病治疗的作用机制尚未阐明。
白血病的发病机制涉及多种因素，不同的药物治疗针对不同的通路和机制发挥作用[13]。本研究通过网络药理学分析，筛选出可能在定清片防治白血病的作用机制中具有重要作用的5个核心靶点。其中，肿瘤抑制基因TP53是人类癌症中最常见的突变基因之一，也是包括血液系统恶性肿瘤在内的许多恶性肿瘤研究的重要预后指标。其编码产生的p53蛋白与细胞周期的调控、细胞凋亡和衰老等重要的生物学功能息息相关，通过抑制细胞的生长，预防癌症的发展[14-15]。在分子对接实验中，刺槐素与p53蛋白有较好的亲和性。已有研究表明，刺槐素能通过结合RARγ，靶向调控AKT-p53信号通路，诱导癌细胞凋亡[16]；但其是否能直接作用于p53从而调控下游生物学功能尚需实验证实。丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）在细胞存活、细胞周期、侵袭和代谢的调节中发挥作用。研究表明，包括白血病在内的多种癌症都伴有AKT信号的失调，在急性白血病中经常发现AKT的持续激活和磷酸化水平的显著升高。AKT1与PI3K、PTEN和mTOR等构成的重要信号通路对维持细胞存活和凋亡之间的平衡具有重要作用[17]，且AKT1会影响来自胸腺的调节性T细胞的增殖能力[18]。研究发现，定清片中的槲皮素与多个核心靶点均有较好的亲和力，其与AKT的相互作用可能最强。已有多项研究表明，槲皮素可用于白血病的治疗，是一种有应用前景的抗肿瘤药物。槲皮素可通过调节CaMKKβ/AMPK/mTOR信号通路诱导HL-60细胞凋亡和自噬[19]，还能克服癌细胞的耐药性[20]。但槲皮素治疗白血病是否与AKT通路有关，有待进一步研究。在药物-靶点网络中显示与白血病靶点密切相关的化合物，如木犀草素、山柰酚和柚皮素等，都可能是定清片治疗白血病的关键化合物。
聚类分析结果显示，定清片治疗白血病的作用机制可能与TNF信号通路和IL-17信号通路有关。TNF参与白血病发生发展的所有过程，包括细胞转化、增殖、血管生成和髓外浸润等，并且在急性髓性白血病患者外周血中，调节性T细胞的增殖依赖于TNF受体通路[21]。而对慢性淋巴细胞白血病（CLL）、免疫功能紊乱和肿瘤细胞生存期延长是病情进展的重要诱因之一。在CLL早期，存在机体Th细胞免疫系统失衡，其中Th2细胞活化、嗜酸性粒细胞聚集，促进慢性炎症的发生，致使IL-17水平升高，最终导致CLL进展，预后欠佳[22]。IL-17诱导炎性细胞因子（如TNF-α和IL-6）和趋化因子（CXCL1、CXCL2）的持续产生，从而促进急性髓性白血病（AML）的发生发展[23]。在B细胞急性淋巴细胞白血病中，Th17细胞分泌的IL-17A水平明显升高，其通过激活Akt 信号通路显著促进细胞的增殖，提高柔红霉素的耐药性[24]。这些研究均表明，TNF信号通路和IL-17信号通路在白血病的发生发展中有重要作用，药物对这些通路发挥调控作用可能是其治疗白血病和改善耐药性的作用机制。
综上所述，本研究基于网络药理学方法，对定清片中的12味药材进行有效成分和作用靶点的筛选，构建了药物成分-疾病-靶点网络图，并通过对关键子网络核心靶点的富集分析，探索其治疗白血病的主要通路。定清片中的主要有效成分如山柰酚、槲皮素、木犀草素、柚皮素、刺槐素等，可能通过与核心靶点TP53、AKT1、MMP9、CASP3和TNF等的相互作用，调控TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。本研究围绕中药复方多种药物成分、多靶点的基本分析策略，验证了“定清片”的有效性和科学性，为其在临床的推广应用提供了一定的理论依据。
Mechanism of effective ingredients of Dingqing tablets in the treatment of leukemia based on network pharmacology and molecular docking technology
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摘要:
目的 探讨定清片治疗白血病的药理作用机制。 方法 检索中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、本草组鉴平台（HERB），收集定清片的活性成分；利用SwissTargetPrediction数据库预测其作用靶点。利用GeneCards、OMIM和DisGeNET数据库获取疾病靶点，将药物与疾病的共有靶点导入String网站，构建共有靶点蛋白相互作用（PPI）网络，并利用MCODE插件筛选核心子网络。利用DAVID数据库中对评分最高的基因簇1基因进行GO和KEGG富集分析，构建“成分-靶点-通路”网络；利用AutoDock对定清片的活性成分和核心靶点进行分子对接，并对其结果进行可视化分析。 结果 数据库检索共获得定清片活性成分82个及其作用靶点439个，白血病相关靶点1 878个，活性成分和疾病的共有靶点169个。由度值推测定清片中发挥作用的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、山柰酚等，而PPI核心网络表明其治疗白血病的关键靶点主要包括TP53、MMP9、TNF、AKT1、CASP3等；子网络的基因富集分析及“成分-靶点-通路”网络图显示定清片可能通过调节TNF、IL-17等信号通路来发挥对白血病的治疗作用。分子对接结果显示活性成分与靶点间有较强的结合活性。 结论 定清片的活性成分可能通过调控TP53、AKT1和CASP3等基因参与TNF、IL-17等信号通路，从而发挥对白血病的治疗作用。 Abstract:Objective To explore the material basis and mechanism of the Chinese medicine Dingqing tablets in the treatment of leukemia. Methods The potential active ingredients of Dingqing tablets were retrieved through TCMSP and HERB Database and the targets of herbs were screened by Swiss TargetPrediction databases. The treatment targets of leukemia were searched from the GeneCards, OMIM and Disgenet databases. The protein-protein interaction network was used to construct the interactive target regulation function of Dingqing tablets and leukemia by STRING software, and the core subnetworks were filtered by the MCODE plug-in. A component-target pathway network was constructed by GO and KEGG enrichment analysis of the highest scoring Gene cluster 1 gene in the DAVID database. Molecular docking of the active components and core targets of Dingqing tablets was performed by AutoDock and the results were visualized. Results A total of 82 active ingredients and 439 targets of action of Dingqing tablets, and 1 878 leukemia-related targets were obtained through database retrieval, in which 169 common targets of active ingredients and diseases were mapped. Based on the degree values, the main active ingredients were determined as quercetin, luteolin, kaempferol, etc. The PPI core network indicated that the key targets for treating leukemia included TP53, MMP9, TNF, AKT1, CASP3, etc. The gene enrichment analysis of sub-networks and the component-target pathway network diagram showed that Dingqing tablets might exert therapeutic effects on leukemia by regulating signaling pathways such as TNF and IL-17. The molecular docking results showed fairly strong binding activity between the active ingredients and the targets. Conclusion The active ingredients of Dingqing tablets may participate in TNF, IL-17, and other signaling pathways by regulating genes such as TP53, AKT1, and CASP3, thereby exerting therapeutic effects on leukemia. -
Key words:
- Dingqing tablets /
- leukemia /
- network pharmacology /
- molecular docking /
- mechanism
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扶正化瘀胶囊（旧名扶正化瘀方）是针对肝纤维化“正虚血瘀”的基本病机研制而成的[1],该复方由丹参、桃仁、五味子、冬虫夏草、绞股蓝、松花粉六味药材组成[2-7]，丹参在方中活血祛瘀作为君药,冬虫夏草补虚损、益精气，桃仁助丹参活血祛瘀，共为臣药，松花粉益气润燥，绞股蓝清热解毒，两者共为佐药；五味子味酸，为引经使药。从中医角度出发，丹参、冬虫夏草、桃仁、松花粉、绞股蓝、五味子这六味药材的药效物质基础主要包含脂溶性的丹参酮类和水溶性的丹酚酸类、多糖、甾醇、多种氨基酸、多种维生素、挥发油、木脂素等物质。以上六味药合用共奏活血化瘀、益精养肝之功效，适用于肝纤维化证属“瘀血阻络，肝肾不足”者[8]。其临床疗效显著，已受国家发明专利保护，获得国家中药Ⅲ类新药证书。而且2006年扶正化瘀片通过美国食品药品监督管理局审批，免于进行Ⅰ期临床，直接进入Ⅱ期临床试验，并在2013年圆满完成Ⅱ期临床实验，成为肝病领域中首个通过美国Ⅲ期临床试验的中成药[9]，将来也有望成为第一个获准进入美国主流医药市场的复方中药。(标红的5处字体均用罗马字)
该复方在我国已使用多年，但由于其组分复杂，一直缺乏系统性研究，尽管目前关于该复方作用机制报道较多[10-15]，然而对于整个复方的入血成分还未见报道。而且复方组成复杂，比分析单位药材的入血成分更困难，因此，明确扶正化瘀胶囊各部分的入血成分对于该复方治疗效果、作用机制的深入研究具有重要意义。
UHPLC和Q-TOF/MS的串联技术在中药复方等复杂体系研究中占有一定优势，该技术集色谱的高效分离能力和质谱的高灵敏、高分辨、强定性能力于一体，已经成为中药复方化学成分分析和鉴定的有效手段之一[16-18]。本实验采用UHPLC-QTOF/MS技术首次对扶正化瘀胶囊中的入血成分进行快速分析，并对其成分进行药材归属鉴定，进一步阐明了扶正化瘀胶囊的药效物质基础，具有重要的临床意义。
1. 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent 1290 Infinity 液相系统，包括G4220A四元泵、G4226自动进样器G1316C柱温箱（安捷伦科技有限公司，美国）；Agilent 6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF/MS质谱仪，配有标准电喷雾离子源（ESI）及MassHunter Qualitative Analysis Software 分析工作站（安捷伦科技有限公司，江苏）；JY10001十万分之一电子天平（精密科学仪器有限公司，上海）；Heal Force SMART-N 超纯水机（力康生物医疗科技控股有限公司，香港）；Micro 17高速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国）；甲醇、乙腈均为色谱纯试剂（Merck，德国），甲酸为色谱级试剂（ROE scientific INC，美国），水为实验室制备的超纯水，其他试剂均为分析级。
1.2 药品与试剂
丹参素、丹酚酸B、二氢丹参酮I、丹酚酸A、五味子乙素、苦杏仁苷、腺苷、五味子醇甲、绞股蓝皂苷XLIX、山奈酚对照品（一飞生物科技有限公司，纯度≥98%），批号分别为：76822-21-4、121521-90-2、87205-9-0、96574-01-5、61281-37-6。扶正化瘀胶囊（黄海制药有限责任公司，上海）购于益丰大药房，批号分别为：161220、170640、171116。
1.3 混合对照品溶液的制备
取丹参素、丹酚酸B、二氢丹参酮I、丹酚酸A、五味子乙素对照品适量，精密称定后，用甲醇溶解并定容成10 mg/ml的对照品储备液。吸取各对照品溶液适量，用甲醇稀释成各对照品浓度约2 mg/ml的对照品混合溶液。
1.4 血清样品的采集
称取扶正化瘀胶囊适量，配制成浓度为0.3 g/ml的混悬水溶液，供大鼠灌胃使用。取雄性SD大鼠6只，随机分为两组（空白组和给药组），给药前12 h禁食、不禁水，按照给药体积4 ml/kg（0.3 g/ml，临床4倍剂量）灌胃给药样品，空白组灌胃蒸馏水。给药23 min后采用眼眶取血约1.5 ml置离心管中，静置1 h后，离心（3 500 r/min，10 min）后取上清液约0.5 ml，−80 ℃冷冻保存。
1.5 血清样品制备
精确吸取50 μl血清，溶于150 μl 含有内标的100%甲醇中，涡旋30 s，静置5 min，于4 ℃、1 000 r/min离心10 min，取上清液，即得血清样品。
1.6 色谱条件
色谱柱：ACQUITY UPLCHSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters Corporation，Ireland）。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）组成。梯度洗脱条件：0~3 min，2%B；3~18 min，2%~50%B；18~22 min，50%~95% B；22~25 min，95%B。平衡时间为10 min，流速为0.40 ml/min，分析所用时间为25 min。进样体积设置为3 μl，柱温箱温度为40 ℃，自动进样器的温度为4 ℃。
1.7 质谱条件
电喷雾离子源采用正、负离子模式。正离子模式条件：毛细管电压4 V；干燥气体流速11 L/min；干燥气体温度350 ℃；雾化器压力45 psig；碎片电压120 V；skimmer电压60 V。质谱采集范围从100~1 100 m/z ，参比离子为121.051和922.010 m/z。负离子模式下，除了毛细管电压为 3.5 kV，其余条件与正离子模式相同。负离子模式下的参比离子分别为 119.036 3 和 966.000 7 m/z。
1.8 扶正化瘀胶囊化学成分数据库的建立
根据国内外已有的专业数据库TCM@taiwan、TCMID（traditional Chinese medicine integrative database）和上海中科院化学专业数据库及相关研究文献，共收集了扶正化瘀胶囊六味药材中801个化学成分。利用Agilent公司研发的“Formula-Database-Generator”软件，通过各化学成分包含碳、氢、氧的个数，计算化合物精确的相对分子质量，建立化学成分的分子式和相对分子质量的数据库。
2. 结果与讨论
2.1 血清样品总离子流图
精密吸取扶正化瘀胶囊血清样品溶液和对照品混合溶液200 μl于进样小瓶，按照上述质谱和色谱测试条件进行样品分析。同时检测空白血清、混合对照品溶液和含药血清在正离子检测模式下的总离子流图，如图1所示。
图 1 空白血清（A）、混合对照品溶液（B）、含药血清（C）在正离子模式下的总离子流图1. 丹参素；2. 丹酚酸B；3. 二氢丹参酮I；4. 丹酚酸A；5. 五味子乙素；6. 苦杏仁苷；7. 腺苷；8. 五味子醇甲；9. 绞股蓝皂苷XLIX；10. 山柰酚2.2 利用对照品鉴别化合物
利用实验中已有的对照品，无差别鉴别出血清中二氢丹参酮I（峰3）、五味子乙素（峰5），如图1B、1C。
2.3 化合物鉴别
以正离子模式下3号峰二氢丹参酮I为例，说明扶正化瘀胶囊中的色谱峰鉴别过程。TIC图中的保留时间为10.453 min（图1B），色谱峰显示的准分子离子峰为279.101，利用Qualiative Analysis软件分析工具（calculator）精确计算质量数可能的元素组成（<5 ppm），结合数据库内已知的化合物质核比，可以初步确定分子式为C18H14O3。通过计算准分子离子的核素分布情况，得出同位素分布的理论值与实际值吻合良好，确定此峰为二氢丹参酮I（图2）。
2.4 扶正化瘀胶囊中入血成分的鉴别结果
根据飞行时间质谱测得的精确相对分子质量，比对所建的扶正化瘀胶囊化学成分数据库，应用 Qualiative Analysis质谱分析软件计算分子组成，将理论值与实测值进行比对，结合上述对照品鉴别结果及相关文献报道[19-20]，对扶正化瘀胶囊血清供试品在正、负离子模式下所得的色谱图中色谱峰进一步分析，其中，血清供试品在正离子模式下初步鉴别出43个化学成分，结果见表1。在负离子模式下初步鉴别出10个化学成分，结果见表2。其中，正、负离子模式下均有响应的有4个（表中标①）。对于化学成分的药材归属，见表1。
表 1 入血化学成分的正离子模式鉴别结果编号 保留时间 (t/min) 化合物名称 分子式 M+X 理论分子量(m/z) 实际分子量(m/z) 误差(ppm) 归属药材 1 10.157 dihydrokaranone C15 H22 O (M+H)+ 219.174 1 219.174 3 2.01 Salvia miltiorrhiza Bge. 2 10.453 dihydrotanshinone I C18 H14 O3 (M+H)+ 279.101 0 279.101 4 0.29 Salvia miltiorrhiza Bge. 3 12.031 salvianonol C18 H20 O4 (M+H)+ 301.141 7 301.141 3 5.72 Salvia miltiorrhiza Bge. 4 10.009 isocryptotanshinone II C19 H20 O3 (M+H)+ 297.148 1 297.148 1 1.49 Salvia miltiorrhiza Bge. 5 11.078 sugiol C20 H28 O2 (M+H)+ 301.216 0 301.216 0 0.78 Salvia miltiorrhiza Bge. 6 11.636 salviol C20 H30 O2 (M+H)+ 303.231 9 303.232 2 −0.13 Salvia miltiorrhiza Bge. 7 12.762 dihydrovalepotriate C22 H32 O8 (M+H)+ 425.216 3 425.215 1 2.87 Salvia miltiorrhiza Bge. 8 7.232 4-methyl salicylaldehyde C8 H8 O2 (M+H)+ 137.059 9 137.059 8 0.05 Salvia miltiorrhiza Bge. 9 1.168 nicotinamide C6 H6 N2 O (M+H)+ 123.055 1 123.054 1 2.14 Cordyceps sinensis 10 0.642 histidine① C6 H9 N3 O2 (M+H)+ 156.075 8 156.076 8 1.52 Cordyceps sinensis 11 1.061 valine C5 H11 N O2 (M+H)+ 118.086 2 118.086 2 0.61 Cordyceps sinensis 12 1.357 adenosine C10 H13 N5 O4 (M+H)+ 268.104 2 268.104 4 −0.54 Cordyceps sinensis 13 0.765 arginine C6 H14 N4 O2 (M+H)+ 175.118 7 175.118 8 2.03 Cordyceps sinensis 14 0.634 lysine C6 H14 N2 O2 (M+H)+ 147.112 9 147.112 8 −0.45 Cordyceps sinensis 15 9.590 cis-9-octadecenoic acid C18 H34 O2 (M+NH4)+ 300.289 2 300.289 4 1.78 Cordyceps sinensis 16 9.360 octadecanoic acid C18 H36 O2 (M+NH4)+ 302.305 4 302.305 1 −0.76 Cordyceps sinensis 17 1.751 leucine C6 H13 N O2 (M+H)+ 132.102 1 132.101 3 −1.57 Cordyceps sinensis 18 1.361 pedatisectine B C5 H5 N5 (M+H)+ 136.062 2 136.061 8 1.02 Cordyceps sinensis 19 8.259 linoleic acid C18 H32 O2 (M+NH4)+ 298.274 0 298.274 1 0.9 Cordyceps sinensis 20 1.102 methionine C5 H11 N O2 S (M+H)+ 150.058 5 150.058 4 −0.61 Cordyceps sinensis 21 10.979 linoleic acid C18 H32 O2 (M+NH4)+ 298.273 9 298.274 1 2.57 Semen Persicae 22 4.726 glucose C6 H12 O6 (M+H)+ 181.070 5 181.070 8 0.95 Semen Persicae 23 9.648 GA17① C20 H26 O7 (M+Na)+ 401.158 3 401.159 2 −2.24 Semen Persicae 24 5.194 prunasin① C14 H17 N O6 (M+Na)+ 318.095 6 318.096 0 −1.94 Semen Persicae 25 9.623 gomisin R C22 H24 O7 (M+H)+ 401.158 5 401.159 1 2.71 Schisandra chinensis Fructus 26 11.168 2-(2-phenyl cyclohexyloxy) ethanol C14 H20 O2 (M+Na)+ 243.135 3 243.135 8 1.78 Schisandra chinensis Fructus 27 9.911 deangeloylgomisin F C23 H28 O8 (M+Na)+ 455.168 9 455.168 2 −0.19 Schisandra chinensis Fructus 28 12.524 schisandrin B C23 H28 O6 (M+Na)+ 423.177 5 423.177 6 1.88 Schisandra chinensis Fructus 29 8.333 gomisin Q C24 H32 O8 (M+Na)+ 471.198 1 471.198 2 1.56 Schisandra chinensis Fructus 30 9.130 (±)-gomisin m1 C22 H26 O6 (M+Na)+ 409.161 8 409.161 8 0.64 Schisandra chinensis Fructus 31 11.973 1,1alpha,4,5,6,7,7alpha,7beta-octahydro-1,1,7,7alpha-tetramethyl-2h-cyclopropa (alpha)-naphthalen-2-one C14 H22 O (M+H)+ 207.174 9 207.174 2 −2.61 Schisandra chinensis Fructus 32 6.870 1-phenyl-1,3-butanedion C10 H10 O2 (M+H)+ 163.075 5 163.075 8 −1.40 Schisandra chinensis Fructus 33 10.839 geranyl acetate C12 H20 O2 (M+H)+ 197.153 8 197.153 5 1.07 Schisandra chinensis Fructus 34 11.110 tigloylgomisin P C28 H34 O9 (M+NH4)+ 532.254 3 532.253 8 0.22 Schisandra chinensis Fructus 35 7.322 citronellyl acetate C12 H22 O2 (M+NH4)+ 216.195 3 216.195 4 2.48 Schisandra chinensis Fructus 36 0.814 gama-octalactone C8 H14 O2 (M+NH4)+ 160.133 0 160.132 9 0.27 Schisandra chinensis Fructus 37 9.607 gomisin D C28 H34 O10 (M+Na)+ 553.204 2 553.203 9 0.61 Schisandra chinensis Fructus 38 10.248 1,1α,2,4,6,7,7α,7β-octahydro-1,1,7,7α-tetra-methyl-5h-cyclopropa (α)-naphthalen-5-one C15 H22 O (M+H)+ 219.173 7 219.174 3 2.92 Schisandra chinensis Fructus 39 9.935 phenyl-2-propanone C9 H10 O (M+H)+ 135.080 2 135.080 2 1.81 Schisandra chinensis Fructus 40 11.834 prehispanolone① C20 H30 O3 (M+H)+ 319.226 3 319.225 7 2.56 Schisandra chinensis Fructus 41 9.919 psilostachyin C15 H20 O5 (M+H)+ 281.137 9 281.138 4 1.67 Schisandra chinensis Fructus 42 11.324 santlic acid C15 H22 O2 (M+H)+ 235.168 3 235.170 5 0.58 Schisandra chinensis Fructus 43 7.355 gomisin A C23 H28 O7 (M+H)+ 417.190 6 417.190 3 0.23 Schisandra chinensis Fructus 注：“①”表示正、负离子模式下都已鉴别出。 表 2 入血化学成分的负离子模式鉴别结果编号 保留时间 (t/min) 化合物名称 分子式 M-X 理论分子量(m/z) 实际分子量(m/z) 误差(ppm) 归属药材 1 6.795 tanshindiol C C18 H16 O5 (M+COOH)− 357.098 9 357.099 7 −1.34 Salvia miltiorrhiza Bge. 2 13.681 paramiltioic acid C19 H24 O5 (M+COOH)− 377.161 6 377.161 9 −1.84 Salvia miltiorrhiza Bge. 3 0.812 histidine① C6 H9 N3 O2 (M-H)− 154.062 6 154.061 2 −2.28 Cordyceps sinensis 4 0.764 glutamic acid C5 H9 N O4 (M-H)− 146.045 7 146.044 9 1.02 Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 5 13.632 GA17① C20 H26 O7 (M-H)− 377.161 6 377.161 9 −2.18 Semen Persicae 6 3.714 GA19 C20 H26 O6 (M+COOH)− 407.171 9 407.171 7 0.02 Semen Persicae 7 13.632 GA119 C19 H24 O5 (M+COOH)− 377.161 6 377.161 9 −2.48 Semen Persicae 8 5.209 prunasin① C14 H17 N O6 (M+COOH)− 340.102 9 340.102 3 0.40 Semen Persicae 9 11.060 prehispanolone① C20 H30 O3 (M-H)− 317.211 5 317.210 9 2.19 Schisandra chinensis Fructus 10 14.158 schisandrone C21 H24 O5 (M-H)− 355.156 4 355.156 6 −2.79 Schisandra chinensis Fructus 注：“①”表示正、负离子模式下都已鉴别出。 3. 结论
本研究首次运用UHPLC-Q-TOF/MS对扶正化瘀胶囊入血成分进行分析，该方法效率高、稳定性好、灵敏度高，能快速检测出含量较低的化学成分，优于其他方法。利用该技术快速初步鉴别出扶正化瘀胶囊血清供试品共49个化学成分，推测其可能为扶正化瘀胶囊发挥药效的物质基础。已鉴别出的化学成分主要集中在丹参、冬虫夏草，符合中药复方“君臣佐使”的配伍原则。为进一步探究其作用机制，拟进一步从 49 种入血成分筛选出抗肝纤维化的体内、外活性测试，期望筛选出具有抗肝纤维化的活性单体。该研究进一步将相应物质的色谱峰明确化，为扶正化瘀胶囊的深入研究奠定了良好基础。
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表 1 分子对接结果
活性成分 结合能（kJ / mol） MMP9 TNF TP53 AKT1 CASP3 槲皮素 −24.28 −24.70 −31.40 −41.03 −31.40 刺槐素 −25.96 −27.21 −33.08 −25.96 −29.73 木犀草素 −25.54 −23.86 −30.14 −26.38 −28.47 山柰酚 −25.12 −26.38 −33.91 −27.63 −31.82 柚皮素 −27.63 −26.80 −30.98 −25.96 −30.14 
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