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生物色谱法( bio-chromatography)于20世纪80年代中后期出现[1]，是由生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极具发展潜力的新兴色谱技术。随着色谱柱制备技术和在线联用技术的深入发展，各种具有生物活性的材料，如蛋白质、细胞膜、仿生物膜、活细胞、细胞壁等纷纷被作为固定相成功投入研究。对于生物色谱技术来说，搭载生物材料的色谱固定相是技术的核心所在。对于适宜生物材料的选取、构建以及对于生物材料固定方法学的开发，使得固定相在最大程度上模拟体内的生理过程，是生物色谱技术最重要的研究方向[2-5]。
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针对膜受体的活性分子筛选所提出的细胞膜色谱技术发展成为近年来的代表性生物色谱技术，西安交通大学贺浪冲、王嗣岑团队[6-8]开拓了该领域并进行了大量的理论和应用研究工作。该技术原理是直接提取细胞膜并固定于硅胶载体制备液相色谱固定相，通过结合受体动力学与液相色谱分析，在色谱柱内动态模拟药物在体内与受体相互作用的过程，并通过色谱参数来评价化合物的亲和活性。细胞膜色谱固定相[9-10]很好地保住了膜受体的结构和活性，且适用于与各类色谱质谱系统的联用。Ding等[11-12]在细胞膜色谱固定相方法学方面开展了大量工作，对细胞用量、破碎条件、固定相合成及填装流程进行了全面的方法学优化，对色谱柱质量标准具有较为精准的把控。此外，通过采用外源转染携带特定蛋白基因的质粒构建高表达细胞系，可实现针对特定靶受体的活性化合物筛选。但这种直接提取细胞膜并固定于载体所制备的生物色谱固定相不可避免地带来专属性和灵敏度两方面的局限性[13]，主要源于细胞膜上其他膜受体的干扰和膜蛋白自身的低丰度、含量不可控等特性，不适用于靶向目标膜受体活性成分的高通量精准分析。
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利用蛋白脂质体重构技术（proteoliposome re-constitution）[14-15]制备人工仿生膜镶嵌膜受体，包裹于硅胶基质表面，作为色谱固定相，是一种新近发展的体外模拟膜受体生物构象和微环境的新方法。其原理是将二油酰基磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰甘油、棕榈油酰磷脂酰胆碱、胆固醇等细胞膜含有的磷脂类成分与纯化或重组的膜受体按一定比例混合，采用不同的水化超声条件，制备成单层脂质囊泡、双层膜微胞、碟状胶束、平面磷脂膜等形式，实现膜受体-脂质体镶嵌模型重构[16-17]。膜受体脂质体是体外膜受体的理想存在形式，Mathiasen等[14]发展了两种膜受体-脂质体镶嵌模型，实现蛋白数量和融合度稳定可控，并将其用于纳米尺度的高含量分析，其研究结果发表在2014 年的《Nature Methods》上。相比较于细胞膜色谱固定相，膜受体脂质体具有蛋白种类和含量可控，磷脂和蛋白易于标记修饰等优势[18-19]。然而，此项技术仍然存在着蛋白在重构过程中发生结构改变而失活的风险。
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分子生物色谱(MBC)是基于生物大分子特异性识别原理，属于扩展的亲和色谱[20]。广泛用于研究药物与血浆蛋白、糖蛋白、受体、DNA等大分子的相互作用关系，揭示了药物的血浆结合率等重要药理特性，而受体生物色谱[21-22]不仅能判定药物在体内的作用靶点，还可以研究药物与受体的作用强度以及与其他药物的竞争作用。对于生物色谱固定相，无论是应用于药物筛选，还是对蛋白-蛋白或蛋白-药物相互作用的研究，如何能够将大量功能完整的蛋白固定到载体表面都是技术关键。目前，色谱固定相上的蛋白固定化策略主要可分为物理吸附、化学键合、亲和标签偶联[23]。
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物理吸附即通过蛋白质与表面之间的弱相互作用(即氢键、静电相互作用、疏水相互作用和范德华力)来实现蛋白质固定化。利用吸附原理进行偶联主要有两点好处，一是不需要对蛋白进行修饰，二是不需要额外的偶联剂[23-24]。在细胞膜色谱固定相及仿生膜生物色谱固定相发展初期，生物材料与硅胶基质的融合依赖于磷脂膜上氨基与硅胶表面硅羟基的氢键和静电吸附作用力。这种固定方式在实际应用中存在着很明显的缺陷[25]，主要在于吸附作用力较弱，吸附过程可逆，且取向随机。随着时间推移，蛋白易从硅胶上脱落失活，导致色谱柱寿命短，稳定性不够[26]。
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鉴于物理吸附的不足，化学修饰策略成为探索热潮。化学修饰策略主要可分为两种途径：①对生物分子进行化学修饰；②对固定相载体进行化学修饰。根据蛋白结构特征，可以对其天然存在的官能团进行共价修饰从而与固定相形成共价结合，以获得更加稳定的附着[24-25]。考虑到蛋白活性位点和固定相的空间相互作用，主要对蛋白质暴露的氨基酸的N端和C端进行修饰，用于修饰的基团包括氨基、羧基以及巯基等[24,27]。蛋白质与固定相载体的共价键结合又可分为非特异性结合与定点结合。绝大部分使用传统非特异性结合方法的生物大分子都存在结合取向随机的问题[28]，此外，当随机固定化蛋白与表面之间的相互作用太强时，也存在变性的可能性。为了使蛋白质能够在固定相表现均匀的定向排列，开发定点结合的方法显得具有重要意义。
对固定相载体进行化学修饰，很好地避免因蛋白修饰可能影响蛋白生物活性的问题。本课题组利用固定相载体化学修饰技术，先后发展了3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）、 3-巯丙基三甲氧基硅烷（MPTS）修饰的硅胶（图1），使硅胶表面游离醛基、酯基等活性基团，与磷脂膜或蛋白上的氨基共价键合[12]。通过考察发现这种修饰方式有效提升了生物色谱柱的使用寿命和稳定性，并由此使得生物色谱在原代细胞、干细胞、纯蛋白等生物材料上的适用性更强。在固定相共价修饰的基础上，纯蛋白色谱固定相也易实现，此技术可广泛应用于各类胞膜及胞质蛋白的亲和活性成分的筛选与相互作用分析。
图 1 硅胶固定相的APTES（A）和MPTS（B）共价活性基团修饰合成路线
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亲和标签偶联法则可以在更温和的条件下，使蛋白质定向均匀地连接到固定相上。不仅降低了蛋白质降解的风险，而且可以解离蛋白质，重复使用固定相[24,27]。生物素-亲和素系统稳定性很高，两者结合亲和常数可为抗原-抗体反应的百万倍，形成复合物的解离常数很小，呈不可逆反应性；而且酸、碱、变性剂等其他苛刻条件均不影响其结合[24,29-30]。Kim等[31]构建了一种基于氢醌笼状生物素表面的蛋白质模式形成方法，此方法还允许通过使用预先定型的电极阵列来选择性地产生生物素以固定目标蛋白（图2）。His是最受欢迎的标签，它是6个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端，其主要优势在于分子量小，一般不影响蛋白的功能；免疫原性相对较低；纯化条件温和等[32]。
图 2 在氢醌笼状生物素修饰金表面生成生物素的电化学氧化反应原理图
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当药物随流动相流经生物色谱，由于不同成分与固定相上的生物活性物质的作用方式及作用程度的差别而在色谱柱上表现出不同的保留特性, 以此为基础，生物色谱已广泛应用于中药等复杂体系的活性化合物筛选分析[33]。细胞膜色谱技术自提出以来，已经用于160多种植物或中药的活性成分筛选，极大地推动了中药药效物质基础的发现[34-35]。在细胞膜色谱技术的基础上，一种全二维-CMC-液相色谱-高分辨质谱联用分析系统发展起来，通过对固定相不断进行优化，结合特定膜受体的高表达细胞构建技术，固定相共价修饰技术，使得细胞膜色谱技术在自动化、高通量、稳定性与专属性各方面性能提升的同时，也拓展应用于更多珍稀生物材料的筛选分析。Chen等利用双通道全二维HepG2/CMC/TOFMS分析系统（图3），成功筛选出黄柏和苦参中的潜在活性成分[36]。Ding等采用APTES修饰硅胶策略将HepG2干细胞膜键合于固定相上，从中药丹参中筛选出了作用于肝癌干细胞膜的活性组分[12]。除此之外，固定相共价修饰技术推进了纯蛋白生物色谱分析系统的发展，使筛选系统实现针对特定受体的高特异性筛选。Gu等采用MPTS修饰硅胶固定相固定ACE2受体，从连花清瘟胶囊给药的健康人血浆中筛选出8种靶向ACE2的活性化合物，并证实其中5种化合物具有对ACE2酶活性具有较高的抑制作用，为连花清瘟胶囊临床上防治新冠肺炎提供了直接的体内药效物质基础和潜在分子机制依据[37]。
图 3 全二维细胞膜色谱分析系统示意图
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色谱过程的本质是基于溶质、固定相与流动相之间的相互作用。当生物色谱兴起后，很快被用于生物分子之间的相互作用分析，应用范围涉及药物分子构效关系、靶点结合验证、结合解离动力学分析、蛋白关键作用位点研究等。James和Philips提出的前沿色谱法( frontal affinity chromatography)被广泛用于研究蛋白-配体间的相互作用，可同时了解药物蛋白结合情况和测定药物-蛋白平衡解离常数和生物利用度等药动学参数[38]。当色谱走向微型化后，相互作用分析从小分子药物-大分子拓展至大分子之间的作用分析，联合蛋白质组学技术，对蛋白关键作用位点的探测和构效关系研究，通过相互作用能力分析进行多肽及抗体类药物开发等前沿应用正处于快速发展阶段[39-40]。
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生物色谱作为一种体外分析手段，在发展进程中将始终围绕着两个核心：①开发更好地模拟生物环境、适用性更佳、特异性更高的新型生物色谱固定相；②建立低生物用量、高灵敏度、功能化更全面的生物色谱分析系统。两者相互推进发展，最终建立起令人满意的分析策略。以下列举两点生物色谱分析方法学的新思路：
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填充生物色谱柱的最大困难依然在于固定相制备困难，色谱柱性能不够稳定[41]。整体柱是一种利用有机或无机聚合方法在色谱柱内进行原位合成，形成连续床固定相的色谱柱。与填充柱相比，其优越的多孔性能、良好的重现性和机械强度使其具有更稳定的色谱行为和更高效的分离性能，因有望克服传统色谱分离介质的局限性而备受关注[42-44]。Svec教授认为[45]，新型功能化整体柱的开发是当下整体柱发展的主流。随着多肽、蛋白质、DNA等各种生物大分子成功发展成为整体柱固定相材料，基于整体柱的生物色谱系统已广泛应用于复杂样品的分离纯化、小分子及抗体药物的筛选、蛋白与配体间的相互作用以及糖蛋白/磷酸化蛋白组学分析等多个生物领域[46]。近年来，暨南大学江正瑾课题组发展了仿生磷脂膜整体柱以及类磷脂膜整体柱[47]，即通过在柱内键合脂质膜或柱后衍生化使得固定相表面暴露磷脂链来模拟细胞膜微环境，用于药物研发以及药物与细胞膜之间的相互作用研究[47]。总之，整体柱固定相制备过程简单，且因其优越的固定相性能，整体柱的通量与分析速度相比传统填充色谱有了很大提高，有望克服传统生物色谱固定相制备和应用中的不足，成为近年来新药研发和色谱研究领域的热点之一[43,48]。
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新药研发、蛋白质组学分析、中药复杂成分分析等前沿领域的快速发展，对分析检测方法的灵敏度、样品通量等都提出了更高的要求。而且，对于生物色谱而言，生物材料往往获取不易，十分珍贵，常规色谱系统在生物领域的适用性上面临着很大挑战。Nano液相色谱分析系统是现阶段实现低生物用量、高灵敏度分析的重要手段[49-50]，为新型生物色谱固定相的开发提供了有利条件。本课题组曾在nano色谱柱中装填细胞膜及仿生膜色谱固定相，实现了nano液相色谱串联三重飞行时间质谱用于中药活性成分的筛选分析。此外，nano液相能够更方便地与各种质谱联用，降低了对样品量的限制，将为多肽药物的筛选、生物大分子之间相互作用分析、蛋白组学分析等提供广阔的应用前景。
Advances in methodologies for preparation and analysis of new biochromatic stationary phase
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摘要: 生物色谱法是一种极具发展潜力的新兴色谱技术，已广泛用于药物筛选及生物分子间相互作用分析。其技术核心是生物分子的色谱固定相，现今主要发展了细胞膜色谱，人工仿生膜色谱以及通过开发多种固定化策略将蛋白等直接固定于固定相载体。本文对新型生物色谱固定相方法学研究进展及基于新型固定相的生物色谱分析应用研究现状进行综述，并展望了基于整体柱的生物色谱固定相及微型生物色谱分析系统的应用前景。Abstract: Biochromatography is a new chromatographic technology with great development potential. It has been widely used in drug screening and biomolecular interaction analysis. The core of this technology is the chromatographic stationary phase of biomolecules. Nowadays, it mainly develops cell membrane chromatography, artificial biomimetic membrane chromatography and the various immobilization strategies to directly immobilizes proteins on the stationary phase carrier. This paper reviews the research progress of new biochromatographic stationary phase and the application of biochromatographic analysis based on new stationary phase. And, the applications of biochromatographic stationary phase and micro biochromatographic analysis system based on monolithic column are prospected.
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Key words:
- biochromatography /
- immobilization method /
- drug screening /
- monolithic column
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益母草（Leonurus japonicus Houtt.）作为传统中药，以往主要用于治疗妇产科疾病。近年来的研究发现，益母草中的主要化学成分为生物碱、类黄酮和二萜等[1]，其中，益母草碱（4-胍基-正丁基-丁香酸酯，又名SCM-198）是一种具有抗血小板聚集[2]、改善微循环、保护心肌[3-4]等多种生物活性的重要生物碱，有广泛的临床应用前景[5-7]。本研究采用SD大鼠胚胎-胎仔发育毒性试验方法对益母草碱的致畸性进行评价；同时采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验这3个标准试验组合的方法，分别从体外到体内，从微生物、离体真核细胞到整体动物水平系统检测其致突变性[8-9]，旨在为临床安全用药提供参考。
1. 材料
1.1 受试物
益母草碱（含量99.09%，复旦大学药学院，批号：20110329）。使用前以0.5% CMC-Na溶液配制成混悬液，供试；羧甲基纤维素钠（CMC-Na，批号：F20100420，国药集团化学试剂有限公司）；DMSO（批号：T20101110，国药集团化学试剂有限公司）；丝裂霉素C（批号：101202，浙江海正药业股份有限公司）；环磷酰胺（ 批号：10110621，江苏恒瑞药业股份有限公司）；敌克松（批号：PS-262）、甲基磺酸甲酯（批号：129925）、4-硝基喹啉-N-氧化物（批号：N8141）、2-氨基芴（批号：A5550-0）、1,8-二羟基蒽醌（批号：S52075-139）均购自Sigma公司；大鼠肝微粒体酶S9（批号：2715，美国Moltox公司）；组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门菌共5支，分别为TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535菌株，由国家上海新药安全性评价中心赠予，储存于液氮中。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞由复旦大学公共卫生学院毒理教研室赠予,储存于液氮中。
1.2 试验动物
SD大鼠（SPF级），雌性100只，雄性80只。雌鼠5~6周龄，体重110~140 g；雄鼠6~7周龄，体重150~180 g（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001629237。ICR小鼠（SPF级），共46只，雌雄各半。雌鼠7~8周龄，体重21~23 g；雄鼠7~8周龄，体重23~25 g（上海西普尔－必凯实验动物有限公司）；实验动物质量合格证号：2008001610906。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2008-0016，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2007-0003。
2. 方法
2.1 胚胎-胎鼠发育毒性试验
按《药物生殖毒性研究技术指导原则》[10-11]的要求，将雌鼠与雄鼠1:1合笼，交配第2天起对雌鼠进行阴道涂片检查，若显微镜下查见精子则视为交配成功，成功当天即为妊娠GD0。然后将这部分雌鼠按体重随机分为4组，每组20只。急性毒性试验结果提示SD大鼠经口灌胃给予益母草碱，最大耐受量（MTD）>5 000 mg/kg，因此，本试验设高、中、低剂量组（2 000、1 000和500 mg/kg体重），另设溶媒对照组，分别对不同组别的雌鼠连续灌胃给药10 d（给药起止时间为GD6~GD15）。于GD0、GD5、GD6~GD15和GD20 时称取孕鼠的体重。在GD20时处死孕鼠，观察外观是否异常，同时记录其活胎数（区分雌雄）、黄体数、着床数、死胎数等。所有的胎鼠，取其中约一半数量固定于Bouin液中作内脏检查，另一半固定于75%乙醇中制作骨骼标本，用于骨骼畸形检查。
2.2 遗传毒性试验
按《药物遗传毒性研究技术指导原则》[12-13]的要求，分别应用反映基因突变的Ames试验[14]、反映染色体畸变的染色体畸变试验（体外培养CHO细胞）[15]和小鼠微核试验（体内）[16]方法。
2.2.1 Ames试验
应用TA97、TA98、TA100、TA102和TA1535这5支菌株，设5个剂量组（5 000、500、50、5、0.5 μg/皿），此外还设空白对照、溶媒对照和阳性对照组，每个剂量组及对照组均设3个平行皿（具体剂量见表1）。采用标准平板掺入法，使细菌在有或无代谢活化系统S9的条件下接触受试物，并用最低极限的琼脂培养基培养48~72 h后，先用显微镜观察平皿上的菌苔生长情况，确定受试物无明显的抑菌或杀菌作用，再人工计数每皿回复突变的菌落数，记录原始数据，并计算每组的均值和标准差，与溶媒对照组进行比较[8, 17-18]。重复试验一次。
表 1 阳性对照品的名称及剂量菌株 无代谢活化系统（−S9） 有代谢活化系统（+S9） 阳性对照品名称 加入量
(μl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)阳性对照品名称 加入量
(µl/皿)配制浓度
(µg/ml)终浓度
(µg/皿)TA97 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA98 敌克松 100 500.0 50.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA100 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 2-氨基芴 100 100.0 10.0 TA102 甲基磺酸甲酯 100 10.0 1.0 1,8-二羟基蒽醌 100 500.0 50.0 TA1535 4-硝基喹啉-N-氧化物 100 5.0 0.5 环磷酰胺 100 500.0 50.0 2.2.2 染色体畸变试验
在有或无代谢活化系统S9的条件下，在体外培养的CHO细胞中加入对应的不同浓度的受试物或对照品，反应体系总体积为10 ml。高、中、低剂量组受试物终浓度依次为1000、500和250 μg/ml，阳性对照组丝裂霉素C和环磷酰胺的终浓度分别为0.5、60 μg/ml，另设溶媒对照组分别作用于细胞4 h后换液，继续培养至24 h，最后收集细胞。用秋水仙碱处理所有细胞，将细胞终止在有丝分裂中期，经0.75%氯化钾低渗、1∶3醋酸甲醇固定、滴片和Giemsa染色后，在显微镜下计数和观察染色体的数量或结构是否改变[8, 17-18]。
观察对象的选择为染色体分散良好、数目完整的中期分裂相细胞，采用盲法读片，受试物及溶媒对照组每组观察200个细胞，阳性对照组观察100个细胞，计数染色体或染色单体的断裂、缺失及其他类型结构异常的数目[8, 17-18]（裂隙和核内复制一般不作为畸变类型），计算畸变率。
2.2.3 骨髓微核试验
受试物采用经口灌胃的方式（与临床给药途径一致）给药，急性毒性试验结果提示ICR小鼠经口灌胃给予益母草碱，MTD>5 000 mg/kg，故高、中、低剂量分别设为2 000、1 000和500 mg/kg体重，同时设溶媒对照及阳性对照组。给药容积为10 ml/kg体重。以40 mg/kg体重的剂量腹腔注射给予环磷酰胺（阳性对照），给药容量为10 ml/kg体重。溶媒对照组以10 ml/kg体重的容积经口灌胃给予0.5% CMC-Na溶液。小鼠在给药24 h后处死，每只动物取其两侧股骨骨髓，制2张涂片，用甲醇固定，然后用pH6.8的Giemsa染液进行染色。
每只小鼠镜检1 000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），计数含微核的PCE数（MNPCE），计算微核发生率，同时记录200个PCE计数过程中观察到的正染红细胞（NCE）的数目，并计算PCE/NCE值，以评价受试物是否有骨髓毒性[8, 17-18]。
3. 统计分析[8, 17-18]
3.1 胚胎-胎鼠发育毒性试验
使用分析软件SPSS11.0，计量指标采用（
$ \bar x \pm {\rm{s}}$ ）表示，各组之间的比较采用方差分析，率的比较采用χ2检验。3.2 Ames试验
比较受试物各剂量组与溶剂对照组的回复突变菌落数，若某剂量组回复突变菌落数为溶剂对照组的2倍以上，呈现可重复性，并在一定的剂量范围内存在剂量-反应关系，则判断为阳性。
3.3 染色体畸变试验
染色体畸变细胞的发生率须与溶媒对照组进行比较分析后方可判定，>10%者判为阳性。
3.4 骨髓微核试验
采用χ2检验比较给药组与对照组之间的差异是否具有统计学意义。
4. 结果
4.1 胚胎-胎鼠发育毒性结果
益母草碱各受试剂量作用下在给药期间（GD6~GD15）、停药后（GD15~GD20）以及整个孕期（GD0~GD20）孕鼠的增重与对照组相比，差异均无统计学意义；各受试剂量组子宫连胎重量、子宫重量、黄体数、着床率、每窝平均活胎数、死胎数和吸收胎数、活胎率、死胎发生率、吸收胎发生率与对照组相比，差异均无统计学意义；此外，各组胎鼠均未观察到内脏和外观畸形的发生。以上研究结果提示，益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的母体毒性、胚胎毒性和致畸作用。
由表2可见，受试物各剂量组胎鼠的体重、身长、胎盘重量及性别比例与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下未观察到明显的胎儿毒性。
表 2 益母草碱对胎鼠生长发育的影响观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 184 174 160 168 性别比例（雄:雌） 93∶91 81∶93 80∶80 88∶80 活胎体重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g) 3.28±0.40 3.25±0.40 3.30±0.40 3.31±0.46 胎盘重($ \bar x \pm {\rm{s}}$, g) 0.56±0.08 0.55±0.09 0.56±0.08 0.55±0.09 活胎身长($ \bar x \pm {\rm{s}}$, cm) 3.60±0.18 3.57±0.20 3.57±0.21 3.61±0.22 由表3~5可见，受试物各剂量组胎鼠观察指标的数目及发育程度与溶媒对照组相比无明显差异，提示益母草碱在各受试剂量下对胎鼠骨骼的发育未见明显影响。
表 3 益母草碱对胎鼠骨骼发育的影响观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 颈椎数 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 7.0±0.0 胸椎数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 腰椎数 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 6.0±0.0 尾椎 2.3±0.6 2.3±0.7 2.4±0.6 2.4±0.6 骶椎数 5.5±0.6 5.5±0.6 5.6±0.6 5.5±0.5 肋骨数 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 13.0±0.0 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 掌骨数 7.3±1.0 7.3±1.0 7.5±0.9 7.0±1.0 近端指骨数 0.1±0.4 0.3±1.1 0.2±0.9 0.3±1.0 远端指骨数 9.9±0.4 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.2 跖骨数 8.0±0.2 8.0±0.2 7.9±0.4 8.0±0.0 近端跖骨数 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0 远端跖骨数 10.0±0.3 10.0±0.2 9.9±0.4 10.0±0.0 表 4 益母草碱对胎鼠枕骨发育的影响枕骨分级 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 Ⅰ级枕骨数[n (%)] 27（30.7） 25（29.4） 31（40.3） 29（37.2） Ⅱ级枕骨数[n (%)] 60（68.2） 59（69.4） 45（58.4） 49（62.8） Ⅲ级枕骨数[n (%)] 1（1.1） 1（1.2） 1（1.3） 0（0） Ⅳ级枕骨数[n (%)] 0（0） 0（0） 0（0） 0（0） 表 5 益母草碱对胎鼠胸骨节骨骼发育的影响观察指标 溶媒对照组 益母草碱组（mg/kg体重） 500 1 000 2 000 受检胎鼠数(只) 88 85 77 78 胸骨节数 4.7±1.1 4.6±1.1 5.0±1.2 4.7±1.0 骨化不全数 0.7±0.8 0.5±0.6 0.7±0.7 0.8±0.7 未骨化数 1.4±1.1 1.4±1.1 1.0±1.2 1.3±1.0 4.2 Ames试验结果
受试物各剂量组和对照组的平皿通过肉眼观察均未见污染，并且在显微镜下可见背景菌苔生长。试验结果见表6、表7，5个菌株的自发回复突变菌落数以及阳性对照品诱发的回复突变菌落数均在历史对照范围内，并且各菌株阳性对照组的回复突变菌落数与空白对照组相比显著增加，提示本试验系统符合试验要求。在最高剂量已达到5 000 μg/皿的受试条件下，未观察到受试物的抑菌现象[8, 17-19]。各剂量组受试物在有或无代谢活化系统S9的条件下，对5支菌株所诱发的回复突变菌落数均与溶媒对照组的突变菌落数相近，并且未观察到明显的剂量-反应关系（表8）。
表 6 益母草碱对5支菌株的回变菌落数试验结果(个/皿,$ \bar x \pm {\rm{s}}$ )（第1次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 84±5 70±3 50±3 53±7 86±8 74±3 203±42 193±62 11±4 12±5 500 85±10 79±8 32±9 44±5 91±18 77±13 213±80 174±11 9±3 8±2 50 76±8 71±6 37±5 40±10 72±3 82±15 196±24 184±13 9±1 9±3 5 92±12 81±1 33±4 34±7 87±18 69±13 218±50 176±8 9±2 9±2 0.5 86±25 71±8 37±6 38±9 82±8 80±9 176±48 159±16 10±4 8±2 空白对照组 77±5 75±6 35±12 42±11 90±14 77±13 207±50 194±25 12±7 10±3 溶媒对照组 75±13 77±6 40±14 52±4 90±9 88±11 178±62 172±40 13±3 13±1 阳性对照组 745±49 1 067±176 467±115 711±87 578±61 486±34 636±41 634±32 467±82 433±15 表 7 益母草碱对5支菌株的回变菌落数(个/皿，$ \bar x \pm {\rm{s}}$ )（第2次）组别(μg/皿) TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 +S9 −S9 5 000 83±7 80±9 32±4 33±8 94±16 93±7 211±13 196±18 9±2 9±6 500 79±11 79±10 26±4 30±6 78±5 79±7 208±6 195±7 9±1 10±3 50 74±13 74±11 32±4 31±3 95±27 86±8 187±9 195±42 8±2 11±2 5 86±6 79±16 31±4 35±5 83±10 85±14 179±4 177±62 9±1 7±2 0.5 84±9 85±7 26±6 27±2 110±20 91±11 190±1 186±18 8±2 12±5 空白对照组 76±5 80±14 32±6 30±11 88±2 102±10 212±6 176±46 10±2 8±1 溶媒对照组 83±3 79±12 29±3 37±11 84±2 89±9 192±15 184±33 8±2 10±2 阳性对照组 807±5 806±90 934±64 851±163 446±40 496±21 623±23 621±37 480±35 476±53 表 8 益母草碱对24 h体外培养CHO细胞的染色体畸变试验结果（加或不加S9系统）组别（μg/ml） 观察细胞数
(个)各类染色体畸变数 畸变细胞数
(个)畸变率
(%)断裂 断片 双着
丝粒三辐体 四辐体 碎片或微小体 环状 多倍体 250 +S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 500 +S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 −S9 200 8 0 0 0 0 0 0 0 3 1.5 1 000 +S9 200 5 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 −S9 200 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0.5 溶媒对照组 +S9 200 2 0 1 0 0 0 0 0 3 1.5 溶媒对照组 −S9 200 2 0 0 0 0 0 0 0 2 1.0 阳性对照组 +S9 100 20 0 0 2 0 0 0 0 17 17* 阳性对照组 −S9 100 18 3 0 0 1 0 0 0 18 18* *P<0.05，与溶媒对照组比较。 4.3 染色体畸变试验结果
阳性对照组能够诱发受试细胞染色体的畸变率明显增高，24 h在有或无代谢活化系统S9的情况下，染色体畸变率分别为17%和18%，均>10%，为阳性结果；溶媒对照品以及250、500和1 000 μg/ml受试物在24 h、有S9组的染色体畸变率分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%；24 h、无S9组的染色体畸变率分别为1.0%、1.0%、1.5%和0.5%，综上，溶媒对照组及受试物各剂量组细胞染色体畸变率均小于5%，为阴性结果[8, 17-18]。
4.4 小鼠骨髓微核试验的结果
各剂量组小鼠在给药后均未见异常。微核试验阅片结果见表9。益母草碱在各受试剂量下未观察到对小鼠骨髓的抑制作用，溶媒对照组雌性和雄性小鼠骨髓的PCE微核发生率分别为4.09‰和2.94‰，阳性对照组雌性和雄性小鼠骨髓PCE微核发生率分别为15.93‰和16.28‰，与溶媒对照组相比，差异均有统计学意义，受试物在500、1 000、2 000 mg/kg剂量下对雌性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为2.53‰、2.16‰和2.17‰，对雄性ICR小鼠骨髓PCE微核诱发率分别为0.78‰、0.79‰和2.96‰，由上述结果可见，受试物各剂量组均未诱发ICR小鼠骨髓PCE微核率的明显增高[8, 17-18, 20]。
表 9 益母草碱对小鼠骨髓嗜多染红细胞的微核效应试验结果组别（mg/kg体重） 性别 动物数（只） 观察PCE数（个） PCE/NCE（$\bar x $±s） 微核率（$\bar x $±s,‰） 500 雌 5 5 126 1.17±0.17 2.53±1.48 雄 5 5 109 1.14±0.24 0.78±0.81* 1 000 雌 5 5 076 1.19±0.21 2.16±1.28 雄 5 5 093 1.42±0.14 0.79±1.30* 2 000 雌 5 5 117 1.15±0.11 2.17±1.47 雄 5 5 088 1.15±0.20 2.96±2.43 溶媒对照组 雌 5 5 131 1.07±0.03 4.09±1.88 雄 5 5 109 1.15±0.11 2.94±0.98 阳性对照组 雌 5 5 019 1.25±0.09 15.93±7.50* 雄 5 5 039 1.27±0.16 16.28±3.80* *P<0.05，与溶媒对照组比较。 5. 讨论
益母草作为传统中药，其应用广泛且历史悠久，主要用于治疗月经不调、痛经、恶露等妇科疾病，同时还用于消肿化瘀、排水利尿。而现代医学已证明益母草中的生物碱——益母草碱在其中发挥了主要功效，益母草碱具有溶栓、抗凝、降低血脂和血液黏度、抑制红细胞和血小板聚集[2]等多种功能，对改善微循环、抗自由基活性和减少细胞内钙超载[3-4]也有显著作用。上述功能有助于预防心血管疾病和脑血管疾病，抑制心肌纤维化[7]、改善认知、促进神经元修复[21]、抗炎[22]、防治糖尿病[23]等，因此，益母草碱在心脑血管、代谢病、肾病、生殖[24]等临床研究领域有相当广泛的应用前景[5-7]。进行安全性评价是药物研发和安全使用的重要环节，但目前对益母草碱的基础毒性和特殊毒性的研究尚未见相关文献报道。研究其遗传毒性和生殖毒性对于临床安全用药具有重要的指导意义。
本研究采用国际通用的研究方法，对益母草碱的生殖毒性和遗传毒性进行了系统的评价。在胚胎-胎仔发育毒性研究中，自大鼠胚胎着床至硬腭闭合这个阶段孕鼠口服益母草碱，通过观察受试物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响检测其致畸性。药物遗传毒性的研究根据国家相关标准，必须遵循原核生物与真核生物、体内系统与体外系统相结合的原则进行，本研究采用Ames试验、体外CHO细胞染色体畸变试验和小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验三者标准组合方案，其检测范围涵盖了基因突变、染色体结构和数目畸变等多个遗传学终点。Ames试验用于检测DNA损伤引起的基因突变，组氨酸营养缺陷型（his-）鼠伤寒沙门菌在受到诱变剂作用后会发生大量回复突变，可自行合成组氨酸，形成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化后才具有致突变作用，因此，在测试系统中又设置了平行组加入哺乳动物微粒体酶，以弥补体外试验缺乏代谢活化系统的不足。染色体畸变试验常用于检测化合物是否引起细胞染色体结构和数目的改变。诱变因素在损伤染色体的同时也可能损伤纺锤体，从而导致染色体的丢失并形成微核，应用微核试验检测染色体或有丝分裂器的损伤，具有直观、简便等优势[9]。
研究结果显示，在本试验剂量条件下，益母草碱未观察到明显的胚胎-胎仔发育毒性以及遗传毒性，该结论可为益母草碱在临床上的安全使用提供参考和指导，有助于降低用药风险。
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[1] CLONIS Y D. Affinity chromatography matures as bioinformatic and combinatorial tools develop[J]. J Chromatogr A,2006,1101(1-2):1-24. doi: 10.1016/j.chroma.2005.09.073 [2] LI Z, RODRIGUEZ E, AZARIA S, et al. Affinity monolith chromatography: a review of general principles and applications[J]. Electrophoresis,2017,38(22-23):2837-2850. doi: 10.1002/elps.201700101 [3] BATISTA-VIERA F, JANSON J C, CARLSSON J. Affinity chromatography[J]. Methods Biochem Anal,2011,54:221-258. [4] MUHAMMAD S, HAN S L, XIE X Y, et al. Overview of online two-dimensional liquid chromatography based on cell membrane chromatography for screening target components from traditional Chinese medicines[J]. J Sep Sci,2017,40(1):299-313. doi: 10.1002/jssc.201600773 [5] ZHANG H, WU Z Y, YANG Y Y, et al. Recent applications of immobilized biomaterials in herbal analysis[J]. J Chromatogr A,2019,1603:216-230. doi: 10.1016/j.chroma.2019.06.059 [6] 贺浪冲, 耿信笃. 细胞膜受体色谱法一研究药物与受体作用的新方法[J]. 生物医药色谱新进展. 1996, 3: 8-9. [7] HE L C, WANG S C, YANG G D, et al. Progress in cell membrane chromatography[J]. Drug Discov Ther,2007,1(2):104-107. [8] 贺浪冲, 杨广德, 耿信笃. 固定在硅胶表面细胞膜的酶活性及其色谱特性[J]. 科学通报, 1999, 44(6):632-637. doi: 10.3321/j.issn:0023-074X.1999.06.013 [9] HOU X F, WANG S C, ZHANG T, et al. Recent advances in cell membrane chromatography for traditional Chinese medicines analysis[J]. J Pharm Biomed Anal,2014,101:141-150. doi: 10.1016/j.jpba.2014.05.021 [10] LI M, HOU X F, ZHANG J, et al. Applications of HPLC/MS in the analysis of traditional Chinese medicines[J]. J Pharm Anal,2011,1(2):81-91. doi: 10.1016/S2095-1779(11)70015-6 [11] DING X, CHEN X F, CAO Y, et al. Quality improvements of cell membrane chromatographic column[J]. J Chromatogr A,2014,1359:330-335. doi: 10.1016/j.chroma.2014.07.071 [12] DING X, CAO Y, YUAN Y F, et al. Development of APTES-decorated HepG2 cancer stem cell membrane chromatography for screening active components from Salvia miltiorrhiza[J]. Anal Chem,2016,88(24):12081-12089. doi: 10.1021/acs.analchem.6b02709 [13] 张月华, 蒋才武. 抗肿瘤中药药效物质筛选与辨识的研究方法进展[J]. 中南药学, 2020, 18(9):1517-1522. [14] MATHIASEN S, CHRISTENSEN S M, FUNG J J, et al. Nanoscale high-content analysis using compositional heterogeneities of single proteoliposomes[J]. Nat Methods,2014,11(9):931-934. doi: 10.1038/nmeth.3062 [15] SEREBRYANY E, ZHU G A, YAN E C Y. Artificial membrane-like environments for in vitro studies of purified G-protein coupled receptors[J]. Biochim Biophys Acta,2012,1818(2):225-233. doi: 10.1016/j.bbamem.2011.07.047 [16] GARNI M, THAMBOO S, SCHOENENBERGER C A, et al. Biopores/membrane proteins in synthetic polymer membranes[J]. Biochim Biophys Acta Biomembr,2017,1859(4):619-638. doi: 10.1016/j.bbamem.2016.10.015 [17] JØRGENSEN I L, KEMMER G C, POMORSKI T G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques[J]. Eur Biophys J,2017,46(2):103-119. doi: 10.1007/s00249-016-1155-9 [18] LIU G Y, HOU S L, TONG P H, et al. Liposomes: preparation, characteristics, and application strategies in analytical chemistry[J]. Crit Rev Anal Chem,2020:1-21. [19] SFORZI J, PALAGI L, AIME S. Liposome-based bioassays[J]. Biology (Basel),2020,9(8):E202. [20] 郭明, 由业诚, 孔亮, 等. 分子生物色谱及其在药物筛选中的应用[J]. 大连大学学报, 2003, 24(2):38-41. doi: 10.3969/j.issn.1008-2395.2003.02.012 [21] CHEN X F, WU Y L, CHEN C, et al. Identifying potential anti-COVID-19 pharmacological components of traditional Chinese medicine Lianhuaqingwen capsule based on human exposure and ACE2 biochromatography screening[J]. Acta Pharm Sin B,2021,11(1):222-236. doi: 10.1016/j.apsb.2020.10.002 [22] QV X Y, JIANG J G, PIAO J H. Pharmacodynamic studies of Chinese medicine at levels of whole animal, cell and molecular models[J]. Curr Med Chem,2010,17(36):4521-4537. doi: 10.2174/092986710794182926 [23] STEEN REDEKER E, TA D T, CORTENS D, et al. Protein engineering for directed immobilization[J]. Bioconjug Chem,2013,24(11):1761-1777. doi: 10.1021/bc4002823 [24] RUSMINI F, ZHONG Z Y, FEIJEN J. Protein immobilization strategies for protein biochips[J]. Biomacromolecules,2007,8(6):1775-1789. doi: 10.1021/bm061197b [25] WONG L S, KHAN F, MICKLEFIELD J. Selective covalent protein immobilization: strategies and applications[J]. Chem Rev,2009,109(9):4025-4053. doi: 10.1021/cr8004668 [26] 王晓宇, 陈啸飞, 顾妍秋, 等. 细胞膜色谱研究进展及其在中药活性成分筛选中的应用[J]. 分析化学, 2018, 46(11):1695-1702. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.171287 [27] SANGHVI M, MOADDEL R, WAINER I W. The development and characterization of protein-based stationary phases for studying drug-protein and protein-protein interactions[J]. J Chromatogr A,2011,1218(49):8791-8798. doi: 10.1016/j.chroma.2011.05.067 [28] CHA T, GUO A, ZHU X Y. Enzymatic activity on a chip: the critical role of protein orientation[J]. PROTEOMICS,2005,5(2):416-419. doi: 10.1002/pmic.200400948 [29] 刘石锋, 陈倩, 洪广成, 等. 生物素-亲和素系统的应用研究进展[J]. 生物技术, 2018, 28(5):503-507. [30] WILCHEK M, BAYER E A. The avidin-biotin complex in immunology[J]. Immunol Today,1984,5(2):39-43. doi: 10.1016/0167-5699(84)90027-6 [31] KIM K, YANG H, JON S, et al. Protein patterning based on electrochemical activation of bioinactive surfaces with hydroquinone-caged biotin[J]. J Am Chem Soc,2004,126(47):15368-15369. doi: 10.1021/ja0459330 [32] PINA A S, BATALHA Í L, DIAS A M G C, et al. Affinity tags in protein purification and peptide enrichment: an overview[J]. Methods Mol Biol,2021,2178:107-132. [33] 周思维, 邱瑞琪, 高彩芳, 等. 生物色谱用于中药活性成分筛选[J]. 中国医药工业杂志, 2017, 48(12):1692-1697. [34] HOU X F, ZHOU M Z, JIANG Q, et al. A vascular smooth muscle/cell membrane chromatography-offline-gas chromatography/mass spectrometry method for recognition, separation and identification of active components from traditional Chinese medicines[J]. J Chromatogr A,2009,1216(42):7081-7087. doi: 10.1016/j.chroma.2009.08.062 [35] FU J, LV Y N, JIA Q Q, et al. Dual-mixed/CMC model for screening target components from traditional Chinese medicines simultaneously acting on EGFR & FGFR4 receptors[J]. Talanta,2019,192:248-254. doi: 10.1016/j.talanta.2018.09.053 [36] CHEN X F, CAO Y, LV D Y, et al. Comprehensive two-dimensional HepG2/cell membrane chromatography/monolithic column/time-of-flight mass spectrometry system for screening anti-tumor components from herbal medicines[J]. J Chromatogr A,2012,1242:67-74. doi: 10.1016/j.chroma.2012.04.034 [37] CHEN C, YANG F Q, ZUO H L, et al. Applications of biochromatography in the screening of bioactive natural products[J]. J Chromatogr Sci,2013,51(8):780-790. doi: 10.1093/chromsci/bmt002 [38] KASAI K. Frontal affinity chromatography: an excellent method of analyzing weak biomolecular interactions based on a unique principle[J]. Biochim Biophys Acta Gen Subj,2021,1865(1):129761. doi: 10.1016/j.bbagen.2020.129761 [39] LINGG N, ÖHLKNECHT C, FISCHER A, et al. Proteomics analysis of host cell proteins after immobilized metal affinity chromatography: influence of ligand and metal ions[J]. J Chromatogr A,2020,1633:461649. doi: 10.1016/j.chroma.2020.461649 [40] ZHANG Y Y, FONSLOW B R, SHAN B, et al. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics[J]. Chem Rev,2013,113(4):2343-2394. doi: 10.1021/cr3003533 [41] UNGER K K, SKUDAS R, SCHULTE M M. Particle packed columns and monolithic columns in high-performance liquid chromatography-comparison and critical appraisal[J]. J Chromatogr A,2008,1184(1-2):393-415. doi: 10.1016/j.chroma.2007.11.118 [42] BUNCH D R, WANG S H. Applications of monolithic columns in liquid chromatography-based clinical chemistry assays[J]. J Sep Sci,2011,34(16-17):2003-2012. doi: 10.1002/jssc.201100189 [43] STANIAK M, WÓJCIAK M, SOWA I, et al. Silica-based monolithic columns as a tool in HPLC-an overview of application in analysis of active compounds in biological samples[J]. Molecules,2020,25(14):E3149. doi: 10.3390/molecules25143149 [44] GUO J L, LIN H, WANG J C, et al. Recent advances in bio-affinity chromatography for screening bioactive compounds from natural products[J]. J Pharm Biomed Anal,2019,165:182-197. doi: 10.1016/j.jpba.2018.12.009 [45] SVEC F, LV Y Q. Advances and recent trends in the field of monolithic columns for chromatography[J]. Anal Chem,2015,87(1):250-273. doi: 10.1021/ac504059c [46] CHEN M L, LI L M, YUAN B F, et al. Preparation and characterization of methacrylate-based monolith for capillary hydrophilic interaction chromatography[J]. J Chromatogr A,2012,1230:54-60. doi: 10.1016/j.chroma.2012.01.065 [47] ZHAO X L, CHEN W J, ZHOU Z Y, et al. Preparation of a biomimetic polyphosphorylcholine monolithic column for immobilized artificial membrane chromatography[J]. J Chromatogr A,2015,1407:176-183. doi: 10.1016/j.chroma.2015.06.056 [48] 彭坤, 吴慧慧, 李林, 等. 功能化聚合物基质整体色谱柱的研究进展[J]. 分析测试学报, 2018, 37(10):1158-1165. doi: 10.3969/j.issn.1004-4957.2018.10.006 [49] MEJÍA-CARMONA K, MACIEL E V S, LANÇAS F M. Miniaturized liquid chromatography applied to the analysis of residues and contaminants in food: a review[J]. Electrophoresis,2020,41(20):1680-1693. doi: 10.1002/elps.202000019 [50] HARA T, IZUMI Y, HATA K, et al. Performance of small-domain monolithic silica columns in nano-liquid chromatography and comparison with commercial packed bed columns with 2 µm particles[J]. J Chromatogr A,2020,1616:460804. doi: 10.1016/j.chroma.2019.460804 -
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