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现代战争需要海陆空的协调配合，晕动病发生率的上升会严重降低军事人员作战效能，直接导致非战斗减员。为减少海员出海晕动症状、配合部队海训、进一步提高战斗力，积极防治晕动病意义重大[1]。研究和开发抗晕动和促醒药物，减少晕动症状和维持大脑觉醒，维持战士作战能力已成为重要的军事保障任务。盐酸苯海拉明为组胺H1受体阻滞药，竞争性地抑制H1受体介导反应，具有显著镇静及止吐、抗胆碱和局麻等作用。咖啡因为中枢兴奋药，能提高细胞内环磷腺苷含量，其作用包括：兴奋大脑皮质，提高其注意力及工作效率，增强警觉性和减少疲乏感，提高警惕性和维持持久的工作能力等 [2] 。盐酸苯海拉明和咖啡因的复方制剂可同时实现抗晕动和促醒效果。
口腔崩解片是一种速释新剂型，可在无水条件下(或仅有少量水)在口腔中快速崩解，不需要咀嚼，将片剂置于舌面，药物可随吞咽动作进入消化道，特别适用于空运、海训和乘驾人员使用[3]。本课题利用其上述特点研制了盐酸苯海拉明咖啡因口腔崩解片。
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盐酸苯海拉明（启东东岳药业有限公司，批号DH-201812104）；咖啡因（山东新华制药股份有限公司，批号16112122）；硬脂酸（湖州展望药业有限公司，批号20190909）；微晶纤维素（Asahi KASET Inc. Lot.No. 7981）；甘露醇（ROQUETTE Inc. Lot.No. E699G）；阿司帕坦（湖南九典宏阳制药有限公司，批号TF23190601）；蓝莓香精（汕头市龙湖区金富高生物技术有限公司，批号20191226）；十二烷基硫酸钠（湖南尔康制药股份有限公司，批号101420190801）；硬脂酸镁（安徽山河药用辅料有限公司，批号1803046）；交联羧甲基纤维素钠（Asahi KASET Inc.Lot.No. X81373）。
20B粉碎机（衡阳城北药械设备厂）；DHG-9626A电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；HX202Z电子天平（慈溪市天东衡器厂）；PTQ-A30000电子天平（华志科学仪器有限公司）；ZPW17旋转式压片机（上海天驹制药机械有限公司）；YPJ-200B片剂硬度计（上海黄海药检仪器有限公司）；DPB-140E平板式自动泡罩包装机（浙江华联制药机械股份有限公司）；RCZ-6C3药物溶出度仪（上海黄海药检仪器有限公司）；SY-2D片剂四用测定仪（上海黄海药检仪器有限公司）；高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。
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处方中含主药盐酸苯海拉明25 mg、咖啡因60 mg，平均片重450 mg。盐酸苯海拉明有明显的麻味和苦味，咖啡因略有苦味，将盐酸苯海拉明与硬脂酸熔融制粒，并在处方中加入甘露醇、阿司帕坦、蓝莓香精以达到矫味要求。主药及处方中辅料分别过80目筛，60℃烘干，称取处方量盐酸苯海拉明颗粒和咖啡因、甘露醇、阿司帕坦、蓝莓香精等，采用等量递加法充分混合均匀，过60目筛，直接压片，制备口腔崩解片。
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盐酸苯海拉明的麻味和苦味明显，单用甜味剂和芳香剂不足以掩盖其不良口感[4]。通过硬脂酸与药物熔融制粒可达到掩味的效果，且工艺简单[5]。按表1比例称取硬脂酸和盐酸苯海拉明，研磨混合均匀，65～70 ℃水浴加热，搅拌至硬脂酸全部熔融后，持续搅拌10 min，将熔融混合物迅速冷却固化，粉碎，过60目筛，40℃干燥4 h。
表 1 不同盐酸苯海拉明与硬脂酸比例对口崩片口感的影响
比例 口感 2∶1 较苦、较麻 3∶2 较苦、较麻 1∶1 微苦、微麻 2∶3 不苦、微麻 硬脂酸比例过高会引起片剂崩解迟缓、硬度过大甚至黏冲等工艺问题，比例为1∶1时，其口感相对较好，对片剂崩解和压片工艺影响不明显。盐酸苯海拉明与硬脂酸比例用量最终定为1∶1。
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加入甜味剂和芳香剂进一步改善口崩片口感。将阿司帕坦、甜菊素、甜菊总苷和甜菊糖苷四种矫味剂分别按4%（w/w）加入。阿司帕坦组口感较甜、略苦。其余矫味剂均不能很好改善口感。将蓝莓香精、草莓香精、水蜜桃香精、苹果香精、菠萝、柠檬、香橙香精分别按1%（w/w）加入。蓝莓香精组效果最佳。
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甘露醇是常用的口崩片矫味型填充剂，流动性好，可用于粉末直接压片，口感清凉。微晶纤维素（MCC）是目前应用最广的一种填充剂，可压性好，有一定崩解性。采用甘露醇和MCC作为填充剂，以保证其良好的口感和可压性。
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甘露醇低于30 mg时，口感改善不明显；用量在45～65 mg时，有一定的清凉感；用量过多影响片剂成形性。选择其用量为45 mg。
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处方中MCC用量低于170 mg时，片剂崩解性和流动性较差，大于210 mg时，片重较大。最佳区间为170～210 mg。
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将口崩片崩解篮固定于支架上，浸入1000 ml杯中，杯内盛有温度为（37±1）℃的水约900 ml，调节水位高度使不锈钢管最低位时，筛网在水面下(15±1) mm。启动振荡器。取本品1片，置上述不锈钢管中进行检查，应在60秒内全部崩解并通过筛网，如有少量轻质上漂或黏附于不锈钢管内壁或筛网，但无硬心者，可作完全崩解[6]。
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考察交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠（CCMC-Na）以及羧甲基淀粉钠、低取代羟丙纤维素4种崩解剂的崩解效果。相同剂量下，CCMC-Na崩解性最好，片剂崩解最快。筛选处方中CCMC-Na用量，结果见表2。CCMC-Na为5.5%时崩解速度最快。
表 2 CCMC-Na用量对口崩片崩解时限的影响
用量（%） 崩解时间（t/s） 1.5 76 2.5 60 3.5 63 4.5 64 5.5 57 6.5 61 7.5 74 -
十二烷基硫酸钠（SDS）可降低表面张力，加速口崩片的崩解和溶出。通常其作为片剂辅料时，用量控制在2%之内。将SDS用量在3～8 mg之间进行处方优化。以硬脂酸镁为润滑剂流动性较好，片面较光滑。将硬脂酸镁用量在0.5%～1.5%之间进行处方优化。
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控制片剂中矫味剂和甘露醇的用量不变，设计正交实验优化处方中MCC、CCMC-Na、SDS和硬脂酸镁的用量，以硬度、体外崩解时间、外观形态为评价指标，设计4因素3水平的正交试验，根据因素水平表进行L9（34）的正交试验，见表3-5。
表 3 正交因素水平表
水平 A(MCC/mg) B(CCMC-Na/mg) C(SDS/mg) D(硬脂酸镁/mg) 1 170 20 2 2 2 190 25 5 5 3 210 30 8 8 表 4 正交试验表及结果
编号 A B C D 硬度 崩解时间（t/s） 外观评分 1 170 20 2 2 25、27、26 58、55、57 1 2 170 25 5 5 27、28、29 58、57、57 4 3 170 30 8 8 29、28、30 63、58、55 3 4 190 20 5 8 31、33、32 64、58、57 3 5 190 25 8 2 31、30、28 52、54、56 2 6 190 30 2 5 28、31、29 63、60、58 4 7 210 20 8 5 34、35、33 46、45、47 4 8 210 25 2 8 34、31、33 48、47、46 4 9 210 30 5 2 32、33、35 54、50、55 3 硬度k1 27.0 30.7 29 28.3 硬度k2 29.7 29.7 30 29.7 硬度k3 33.3 29.7 31.3 32.0 R 6.3 1 2.3 3.7 优水平 210 20 8 8 崩解k1 59.7 56 56.3 54.7 崩解k2 59.7 52.7 58.7 55.7 崩解k3 49.3 60 53.7 58.3 R 10.3 7.3 5 3.7 优水平 210 25 8 2 表 5 崩解时间方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 均方 F P A 498.963 2 249.481 42.633 0.000 B 98.741 2 49.370 8.437 0.003 C 64.296 2 32.148 5.494 0.014 D 1.852 2 0.926 0.158 0.855 误差 105.333 18 5.852 总计 81676.000 27 修正后总计 769.185 26 综上，最终确定盐酸苯海拉明口崩片最佳处方为盐酸苯海拉明25 mg、咖啡因60 mg、硬脂酸25 mg、阿司帕坦40 mg、蓝莓香精7 mg、甘露醇45 mg、MCC 210 mg、CCMC-Na 25 mg、SDS 8 mg、硬脂酸镁5 mg，总片重450 mg。
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（1）标准曲线的建立
精密称取盐酸苯海拉明对照品和咖啡因对照品，分别配制成19.72、29.59、49.31、98.62、197.24 μg/ml的盐酸苯海拉明及55.80、83.70、139.50、279.00、558.00 μg/ml的咖啡因标准液。液相进样20 μl，以对照品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归处理，计算回归方程及相关系数。得盐酸苯海拉明回归方程A=1.6573C+4.1464（r=0.999 9）n=5，咖啡因回归方程A=31.688C+68.972（r=0.999 9）n=5。盐酸苯海拉明在55.80～558 μg/ml，咖啡因在19.72～197.24 μg/ml范围内线性关系良好。
（2）回收率试验
配制每1 ml中约含1.0 mg盐酸苯海拉明、2.4 mg咖啡因的对照品储备液。取空白片20片，研细，精密称取100 mg，分别配制成供试品溶液浓度为80%、100%、120%的溶液，平行操作3份。摇匀，过滤，每份连续进样3针，计算回收率，盐酸苯海拉明的回收率为92%～105%，咖啡因的回收率为95%～102%，即为符合要求。
结果显示，盐酸苯海拉明回收率为92.01%～96.25%，咖啡因的回收率为96.93%～99.53%，符合要求，见表6。
表 6 盐酸苯海拉明含量测定回收率测定结果
成分 加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）盐酸苯海拉明 3.94 3.63 92.01 94.02 1.46 3.94 3.77 95.46 3.94 3.67 92.96 4.93 4.62 93.73 4.93 4.63 93.98 4.93 4.60 93.30 5.92 5.70 96.25 5.92 5.64 95.29 5.92 5.51 93.20 咖啡因 11.16 10.92 97.81 97.93 0.94 11.16 10.84 97.11 11.16 10.83 97.09 13.95 13.73 98.41 13.95 13.56 97.23 13.95 13.73 98.44 16.74 16.55 98.85 16.74 16.23 96.93 16.74 16.66 99.53 -
按照《中国药典》2020年版片剂溶出度测定方法[6]，取本品，按照溶出度与释放度测定法（篮法），以1% SDS 500 ml为溶出介质，转速100 r/min，依法操作。45 min时，取溶出介质5 ml，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取盐酸苯海拉明对照品，精密称定，加流动相溶解并定量稀释制成每l ml中约含50 μg的溶液，作为对照品溶液。按照盐酸苯海拉明含量测定项下的色谱条件，进样体积20 μl，记录色谱图。按外标法以峰面积计算每片的溶出量。结果符合规定，详见表7。
表 7 盐酸苯海拉明咖啡因口崩片溶出度测定结果
样品编号 盐酸苯海拉明（%） 咖啡因（%） 1 89.83 104.31 2 87.39 100.20 3 91.70 104.59 4 87.07 98.34 5 95.01 101.62 6 95.81 102.62 平均值 91.13 101.95 -
参照相关文献，取本品，照溶出度与释放度测定法（浆法），以900 ml水为溶出介质，转速100 r/min，依法操作。30 min时，取溶出介质5 ml，滤过，取续滤液作为供试品溶液；另取咖啡因对照品，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每l ml中约含60 μg的溶液，作为对照品溶液。进样体积20 μl，记录色谱图。按外标法以峰面积计算每片的溶出量。结果符合规定，详见表7。
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由于口崩片的特殊性，在研发过程中应特别关注其口感及崩解特性[7]。本研究的重点是盐酸苯海拉明苦麻口感的掩味和片剂口腔崩解性能。本文采用盐酸苯海拉明与硬脂酸熔融制粒法，通过调整硬脂酸比例，掩盖苦麻味。并通过甜味剂和芳香剂的加入，进一步优化口感。本实验考察了多种崩解剂，确定交联羧甲基纤维素钠（CCMC-Na）崩解效果最好。通过正交设计法，以硬度、体外崩解时间、外观形态为评价指标，考察了填充剂、崩解剂、润滑剂的用量，筛选出最佳处方。并建立了盐酸苯海拉明和咖啡因HPLC含量分析方法，能准确地测定盐酸苯海拉明和咖啡因的含量。
Studies on orally disintegrating tablet of diphenhydramine hydrochloride and caffeine
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摘要:
目的 以盐酸苯海拉明和咖啡因为模型药物，研制盐酸苯海拉明咖啡因口腔崩解片。 方法 采用盐酸苯海拉明与硬脂酸熔融制粒掩味，交联羧甲基纤维素钠（CCMC-Na）为崩解剂，用干粉直接压片法制备盐酸苯海拉明咖啡因口腔崩解片。采用正交实验优化处方，达到最短崩解时间和最佳矫味效果。 结果 最优处方中含主药盐酸苯海拉明25 mg、咖啡因60 mg、硬脂酸25 mg、阿司帕坦40 mg、蓝莓香精7 mg、甘露醇45 mg、MCC 210 mg、CCMC-Na 25 mg、SDS 8 mg、硬脂酸镁5 mg。 结论 盐酸苯海拉明咖啡因口腔崩解片制剂可行，质量可控。 Abstract:Objective To optimize the formulation and preparation of diphenhydramine hydrochloride and caffeine orally disintegrating tablet. Methods Melt granulation technology of steric acid and API was used to mask the unpleasant tasting of diphenhydramine hydrochloride. The tablets were prepared by direct pressing the dry powder with CCMC-Na as disintegrating agent. The formulation was optimized by orthogonal experiments to achieve the shortest disintegration time and the best taste correction. Results The optimized formula of orally disintegrating tablet was as follows: diphenhydramine hydrochloride 25 mg, caffeine 60 mg, stearic acid 25 mg, aspatan 40 mg, blueberry essence 7 mg, mannitol 45 mg, MCC 210 mg, CCMC-NA 25 mg, SDS 8 mg and magnesium stearate 5 mg. Conclusion This preparation method for orally disintegrating tablet of diphenhydramine hydrochloride and caffeine is practical and easy for quality control. -
Key words:
- orally disintegrating tablet /
- diphenhydramine hydrochloride /
- caffeine
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胆汁淤积是以胆汁生成障碍和胆汁排泄受阻为特征的病理性疾病，是一种临床常见的综合征[1]。胆汁淤积由胆管阻塞、肝细胞分泌缺陷等多种原因引起，肝脏和体循环中胆汁酸、胆固醇及胆红素等成分过多堆积，从而造成机体及肝细胞的损伤[2]。由于胆汁淤积的病因和损伤机制复杂，严重影响了其相关新药的开发，因此研究胆汁淤积性肝损伤的病因，寻找有效的治疗药至关重要。目前，经FDA批准用于临床治疗胆汁淤积的药物只有熊去氧胆酸（UDCA）和奥贝胆酸（OCA）[3-4]。我国中草药资源丰富，为中医药的开发和研究提供了物质基础。此中药组合物是一种用于治疗肝损伤的中药民间验方，主要由醋鳖甲、佛手、芍药等13味组成。本课题组在四氯化碳诱导的肝纤维化动物模型中证实了此中药组合物具有保肝和治疗肝纤维化等慢性肝损伤的作用[5-7]，其作用温和、无毒、无副作用，可以明显降低慢性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）的水平[6-8]，并且该作用效果可能与基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和CD147的表达增加、基质金属蛋白酶抑制因子-2（TIMP-2）的表达降低有关[8-9]，在肝病防治领域应用前景广泛。但到目前为止，尚未见此中药组合物从改善胆汁淤积角度进行肝病防治的研究，更未见其在α-萘异硫氰酸酯（ANIT）诱导的小鼠胆汁淤积型肝损伤模型中的相关报道。为此，本课题组采用ANIT构建小鼠胆汁淤积性肝损伤模型，研究此中药组合物在防治胆汁淤积肝病方面的研究，探索此中药组合物在防治肝病领域的理论与实践，进而为研究其在防治慢性肝病的分子机制及其临床应用方面提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
8周龄SPF级昆明小鼠[动物伦理号：DWLL202003225，许可证号：SCXK（豫）2021-0015，伦理负责单位：河南中医药大学]60只，雌雄各半，体质量18~22 g，由郑州大学动物实验中心提供，饲养于河南中医药大学实验动物中心；中药组合物（各组分均为颗粒剂，河南中医药大学第一附属医院中成药房）；熊去氧胆酸（UDCA）胶囊（商品名：优思弗，批号：G62222，规格：250 mg/粒，河南中医药大学第一附属医院）；水合氯醛（北京化工厂）；α-ANIT（批号：K2325417，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、总胆汁酸（TBA）、总胆红素（TBIL）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；全自动酶标仪[美国伯乐（BIO-RAD)]；4℃冷藏冰箱（GENERAL公司）；−80℃冰箱[赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；正置显微镜[奥林巴斯集团公司（BX53）]。
1.2 方法
1.2.1 动物分组、模型建立及给药
取8周龄SPF级昆明小鼠，饲养于通风、安静的环境中，定时喂食，饮水不限，进行一周的适应性饲养后随机分成6组，每组10只，分别为空白对照组（灌胃生理盐水），模型对照组（灌胃生理盐水)，中药组合物低（灌胃剂量5.25 g/kg）、中（灌胃剂量11.25 g/kg）、高（灌胃剂量20.25 g/kg）剂量组，阳性对照组（熊去氧胆酸，UDCA，0.1 g/kg）。将中药组合物颗粒与实验动物中心提供的50 ml温热纯水溶解（水温37℃），UDCA与25 ml温热纯水溶解（水温37℃），再使用超声多普勒仪器，使其充分溶解，根据体表面积法换算人与小鼠的给药剂量[10]，每日1次，灌胃7 d，第5天，除对照组外其他各组灌胃ANIT（65 mg/kg）造模，对照组灌胃给予等量橄榄油。造模48 h后，各组小鼠末次给药后30 min，收集小鼠血液和肝组织样本，进行各项指标的检测。每日定时观察小鼠进食、体质量、饮水、活动、精神、皮毛、大小便等情况。
1.2.2 指标检测
收集小鼠血液和肝组织样本用于各项指标分析。经腹腔注射10%水合氯醛（0.03 ml/10 g）麻醉后，摘眼球取血，放EP管中，于4℃冰箱内静置2 h左右，
3500 r/min离心20 min，取上清液，按照试剂盒说明书检测ALT、AST、ALP、TBA、γ-GT、TBIL、MDA、SOD、GSH-PX含量。打开腹腔取出肝脏，先用磷酸盐缓冲液（PBS）平衡盐溶液将上面的血液等杂质小心洗干净，用滤纸吸干，然后用刀片切下一部分左叶放入10%中性福尔马林溶液中固定，做常规病理切片，进行苏木精-伊红（HE）染色，观察小鼠肝脏病理变化。剩余肝组织置于冻存管中，然后速放入液氮中，再转−80℃冰箱冻存。1.2.3 苏木精-伊红染色
①石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各20 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、75%酒精各5 min，然后用自来水冲洗。②苏木素染色：切片入苏木素染液3～5 min，然后用自来水冲洗，再用分化液分化，然后用自来水冲洗，再用返蓝液返蓝，再进行流水冲洗。③伊红染色：切片依次入85%、95%的酒精脱水5 min，放入伊红中染色5 min。 ④脱水封片：切片依次放入无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ 、无水乙醇Ⅲ、二甲苯Ⅰ各5 min，然后再放二甲苯Ⅱ5 min进行透明，最后用中性树胶封片。
1.3 统计学方法
采用SPSS 22.0软件，计量资料用均数±标准差（
$ \bar x \pm s $ ）表示，组内比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05，P<0.01为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血生化指标的影响
2.1.1 对ALT、AST、ALP含量的影响
与对照组相比，给予ANIT后，模型组小鼠血清中肝功酶学指标（ALT、AST、ALP）水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，中药组合物中、高剂量组和UDCA组小鼠外周血清中ALT、AST、ALP含量明显降低（P<0.01），低剂量组ALT的表达降低（P<0.05），表明中药组合物能够改善肝损伤血清生化指标（表1）。
表 1 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中ALT、AST、ALP含量影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 ALT（U/L） AST（U/L） ALP（金氏单位） 对照组 35.31±3.24 123.58±7.86 3.15±1.14 模型组 69.76±5.33## 186.65±8.25## 12.25±3.46## 中药组合物低剂量组 42.59±2.13* 142.12±10.34** 5.17±2.52** 中药组合物中剂量组 36.22±3.24** 125.73±9.63** 3.25±1.16** 中药组合物高剂量组 40.15±4.33** 136.68±8.45** 4.43±2.45** UDCA组 35.46±3.65** 124.24±7.41** 3.76±1.36** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 2.1.2 对TBA、TBIL、γ-GT含量的影响
与对照组相比，给予ANIT后，模型组黄疸特异性指标（TBA、TBIL和γ-GT）的表达水平明显升高（P<0.01）。与模型组相比，中药组合物中、高剂量组和UDCA组能够显著降低小鼠外周血清中TBA、TBIL和γ-GT含量（P<0.01）；中药组合物低剂量组TBA和TBIL表达降低（P<0.05），γ-GT表达降低（P<0.01），表明中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠具有降低黄疸的作用（表2）。
表 2 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中TBA、TBIL、γ-GT含量影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 TBA（μmol/L） TBIL(μmol/L) γ-GT(U/L) 对照组 2.34±1.64 12.06±4.54 2.27±1.18 模型组 10.87±2.32## 35.17±2.64## 11.37±3.54## 中药组合物低剂量组 4.36±2.25* 18.02±4.62* 3.87±2.02** 中药组合物中剂量组 3.13±1.45** 14.67±2.56** 3.27±2.21** 中药组合物高剂量组 4.36±2.16** 15.37±3.45** 3.23±1.25** UDCA组 4.21±2.58** 13.15±3.26** 3.02±1.45** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 2.1.3 对SOD、MDA、GSH-PX含量的影响
与对照组相比，给予ANIT后，模型组肝脏抗氧化因子（SOD、GSH-Px）活性降低明显（P<0.01），而MDA的表达水平上升明显（P<0.01），与模型组相比，中药组合物中剂量组、高剂量组和UDCA组SOD、GSH-Px的表达水平显著升高（P<0.01），同时中药组合物低、中、高剂量组MDA的表达水平显著降低（P<0.01），中药组合物低剂量组SOD、GSH-PX的表达升高（P<0.05），UDCA组MDA的表达降低（P<0.05）。结果提示，中药组合物能够通过清除氧化自由基减少炎症反应进而保护肝脏（表3）。
表 3 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠外周血中SOD、MDA、GSH-PX含量影响（$ \bar x \pm s $ ，n=10）组别 SOD（U/ml） MDA（nmol/ml） GSH-PX[nmol·
（min·g）−1]对照组 305.65±8.21 7.75±3.24 139.58±8.02 模型组 210.46±8.96## 20.65±2.86## 86.05±9.78## 中药组合物低剂量组 257.32±5.42* 13.31±4.21** 118.87±6.52* 中药组合物中剂量组 297.35±5.64** 8.76±3.46** 130.35±4.15** 中药组合物高剂量组 275.34±6.54** 11.75±5.12** 126.48±6.06** UDCA组 300.02±7.38** 8.52±3.35* 132.34±5.47** *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与对照组比较。 2.2 中药组合物对胆汁淤积肝损伤小鼠病理形态学的影响
对照组小鼠肝脏病理切片显示肝细胞胞浆丰富，肝细胞圆润饱满，小叶结构完整清晰，无纤维组织，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无炎症细胞浸润；与对照组相比，模型组小鼠肝脏病理切片显示肝脏细胞呈现脂肪变性，中央静脉周围汇管区炎症细胞浸润，部分肝细胞排列紊乱，出现点状坏死；与模型组相比，中药组合物低剂量组、高剂量组肝脏细胞炎症浸润稍微减轻，较模型组好转。中药组合物中剂量组肝脏细胞脂肪变性显著减少，肝脏细胞排列紊乱恢复，炎症细胞浸润现象较模型组改善明显，肝小叶结构完整；UDCA组部分肝细胞水肿，中央静脉周围有少量散在炎症细胞浸润，逐渐恢复细胞序列。具体见图1。
3. 讨论
目前认为胆汁淤积与各种肝脏疾病密切相关[11]，如黄疸、胆结石、急性肝炎、原发性硬化性胆管炎（PSC）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）等，其中引起成年胆汁淤积的两种最主要的疾病就是PSC和PBC，这些疾病不仅使人们的生活质量下降，也大大增加了家庭和社会负担[12]，因此，开发治疗胆汁淤积肝疾病更有效的药物是临床面临的迫切任务，深入阐述胆汁淤积肝损伤的病理机制则有助于寻找更加精准的治疗靶点。
ANIT是急性胆汁淤积肝损伤动物模型常用造模试剂，在肝脏中经细胞色素P450超家族（CYP）与谷胱甘肽（GSH）结合之后被转运至胆管并集中在胆汁内，造成胆管上皮细胞损伤，以致肝小叶间胆管炎症及肝内胆管增生，导致胆管阻塞，使胆汁酸等物质在肝脏中过度堆积，从而产生肝毒性[13-14]。同时胆汁反流及扩散，使周围的肝细胞损伤，引发系统出现炎症，进而导致高胆红素血症。
本研究通过灌胃ANIT构建小鼠胆汁淤积肝病模型，小鼠血清中ALT、AST、ALP、TBIL、TBA、MDA及γ-GT水平显著升高，GSH-PX、SOD表达显著下降，经苏木精-伊红染色肝脏出现病理损伤。
ALT、AST作为肝脏中不可或缺的酶，主要分布在肝细胞胞浆和线粒体内，是临床最常用的检测肝功能的指标，能在一定程度上反映肝损伤程度，随着肝细胞结构和功能的破坏，可被大量释放到外周血，其血清浓度与肝脏损伤程度呈正相关关系[6]。本研究结果显示，此中药组合物能显著降低胆汁淤积模型小鼠清中ALT、AST的表达水平，提示其具有保护肝脏免受ANIT所致损伤的作用。
临床上将血清ALP 升高作为各种原因所致胆汁淤积早期诊断的特征性指标之一[15]，当肝脏出现损伤或胆汁排泄不畅时，血清中ALP的浓度就会升高[15]。本研究结果显示，此中药组合物各剂量组能不同程度降低小鼠胆汁淤积模型血清中ALP的浓度。
肝脏是TBIL和TBA主要的代谢场所，当肝细胞发生病变或肝内外出现阻塞时，肝脏正常的代谢和排泄功能发生障碍，TBA和TBIL在血液中积聚，出现黄疸现象[16-17]。γ-GT在肝内主要分布于肝细胞胞浆和肝内胆管上皮。临床上此酶主要用于诊断肝胆疾病，是胆道梗阻和肝炎活动的指标之一。本研究结果显示，此中药组合物能显著降低胆汁淤积模型小鼠血清TBA、TBIL和γ-GT水平，改善黄疸症状。
脏损伤通常伴有氧化应激反应的发生[18-19]，因此本研究还检测了抗氧化因子SOD和GSH-PX表达。结果显示，中药组合物能够明显增加胆汁淤积小鼠血清中SOD和GSH-PX的含量，表明中药组合物能通过其抗氧化活性发挥保护肝损伤的作用。UDCA作为临床治疗胆汁淤积的常用药物，在本实验研究中，其改善胆汁淤积肝损伤血清学指标、降低黄疸以及清除氧化自由基效果明显。MDA作为机体自由基与生物膜发生脂质过氧化反应的重要产物[20-21]，其表达水平与细胞发生自由基氧化的程度密切相关，本研究结果显示此中药组合物能够显著降低胆汁淤积小鼠MDA的表达水平，提示其能够改善ANIT所致的氧化损伤。
综合肝脏病理学变化和血清生化结果，中药组合物中剂量组（11.25 g/kg）效果较为明显，其发挥改善胆汁淤积型肝病的效果较好，其整体改善作用与阳性药相当。
综上所述，此中药组合物对ANIT诱导的小鼠胆汁淤积性肝病具有明显的保护作用，其改善胆汁淤积的作用可能与改善肝损伤血清学指标、降低黄疸以及清除氧化自由基、减轻炎症反应等有关。本研究进一步丰富了此中药组合物防治肝病的研究资料，为此中药组合物防治肝病提供了参考依据和理论基础。
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表 4 正交试验表及结果
编号 A B C D 硬度 崩解时间（t/s） 外观评分 1 170 20 2 2 25、27、26 58、55、57 1 2 170 25 5 5 27、28、29 58、57、57 4 3 170 30 8 8 29、28、30 63、58、55 3 4 190 20 5 8 31、33、32 64、58、57 3 5 190 25 8 2 31、30、28 52、54、56 2 6 190 30 2 5 28、31、29 63、60、58 4 7 210 20 8 5 34、35、33 46、45、47 4 8 210 25 2 8 34、31、33 48、47、46 4 9 210 30 5 2 32、33、35 54、50、55 3 硬度k1 27.0 30.7 29 28.3 硬度k2 29.7 29.7 30 29.7 硬度k3 33.3 29.7 31.3 32.0 R 6.3 1 2.3 3.7 优水平 210 20 8 8 崩解k1 59.7 56 56.3 54.7 崩解k2 59.7 52.7 58.7 55.7 崩解k3 49.3 60 53.7 58.3 R 10.3 7.3 5 3.7 优水平 210 25 8 2 
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表 5 崩解时间方差分析结果
因素 偏差平方和 自由度 均方 F P A 498.963 2 249.481 42.633 0.000 B 98.741 2 49.370 8.437 0.003 C 64.296 2 32.148 5.494 0.014 D 1.852 2 0.926 0.158 0.855 误差 105.333 18 5.852 总计 81676.000 27 修正后总计 769.185 26
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表 6 盐酸苯海拉明含量测定回收率测定结果
成分 加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）盐酸苯海拉明 3.94 3.63 92.01 94.02 1.46 3.94 3.77 95.46 3.94 3.67 92.96 4.93 4.62 93.73 4.93 4.63 93.98 4.93 4.60 93.30 5.92 5.70 96.25 5.92 5.64 95.29 5.92 5.51 93.20 咖啡因 11.16 10.92 97.81 97.93 0.94 11.16 10.84 97.11 11.16 10.83 97.09 13.95 13.73 98.41 13.95 13.56 97.23 13.95 13.73 98.44 16.74 16.55 98.85 16.74 16.23 96.93 16.74 16.66 99.53
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表 7 盐酸苯海拉明咖啡因口崩片溶出度测定结果
样品编号 盐酸苯海拉明（%） 咖啡因（%） 1 89.83 104.31 2 87.39 100.20 3 91.70 104.59 4 87.07 98.34 5 95.01 101.62 6 95.81 102.62 平均值 91.13 101.95
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[1] 钟桂香, 严佳, 贺全山. 抗晕动病药物的研究进展[J]. 医药导报, 2010, 29(6):747-749. doi: 10.3870/yydb.2010.06.022 [2] 高宇, 凌琳, 邢信昊. 盐酸苯海拉明咖啡因复方在大鼠体内的药动学研究[J]. 药学实践杂志, 2021, 39(5):415-421. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202106091 [3] 刘职瑞, 叶显撑, 王芳, 等. 咖啡因口崩片的研究[J]. 药学实践杂志, 2009, 27(3):179-182,217. doi: 10.3969/j.issn.1006-0111.2009.03.007 [4] 王红霞, 李雪, 丁平田, 等. 苯海拉明口腔溶解膜的制备及溶出测定[J]. 中国药剂学杂志, 2020, 18(3):135-146. [5] 颜洁, 谌志远, 关志宇, 等. 制粒技术在药物掩味方面的研究进展[J]. 中国实验方剂学杂志, 2019, 25(18):221-226. [6] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2020年版四部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020: 129, 132. [7] 孙冠男, 任麒, 李杰, 等. 提高口崩片崩解性能的措施[J]. 中国医药工业杂志, 2008, 39(11):866-869. doi: 10.3969/j.issn.1001-8255.2008.11.019 -
