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海洋生物毒素是一类由海洋生物产生的天然活性物质，具有化学结构新颖，生物活性高，作用于钠、钾、钙等离子通道等特点，有望开发为先导化合物，为新型海洋药物的研发提供新策略，但其强烈毒性和高致死率也对人类健康产生巨大威胁[1]。目前，药物毒性评价多采用细胞模型和动物模型，由于细胞模型不能重现体内真实环境，动物模型存在伦理和物种差异等问题，近年来，在微流控技术基础上发展起来的器官芯片模型，可以模拟体内组织器官的结构和功能，再现体内微环境，在药物毒性评价与检测领域展现出极大潜力。本文构建了一种可模拟心血管结构与功能的心血管芯片模型，用于四种典型的深海毒素，即大田软海绵酸(OA)、芋螺毒素(CTX)、河豚毒素(TTX)和环亚胺毒素(GYM)的致伤评价，并初步探索了雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用，旨在为深海毒素的防护提供参考。
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SC-1B匀胶机、BP-2B型烘胶台（北京创世威纳科技有限公司）；JKG-2A光刻机（上海学泽光学机械有限公司）；PDC-32G-2型等离子清洗机（美国Harrick公司）；CKX41型高倍显微镜（日本OLYMPUS公司）；Harris Uni-Corel 15072型打孔器（美国Harris公司）；超净工作台、CO2细胞培养箱、离心机、超低温冰箱（美国Thermo Fisher公司）；Synergy 4多功能酶标仪（美国Bio-TEK公司）；Harvard蠕动泵p-70（美国Harvard仪器公司）；十万分之一电子分析天平（日本A&D公司）。
聚二甲基硅氧烷（PDMS）预聚剂和固化剂（美国Dow Corning公司）；硅单面抛光片、显影液（苏州汶颢芯片科技有限公司）；SU-82 075光刻胶（美国Microchem公司）、磷酸盐缓冲盐（PBS）、96培养孔板（美国Corning公司）；无菌注射器（江苏恒康公司）；PE/20软管（美国Scientific Commodities公司）；多聚赖氨酸溶液（北京索莱宝科技有限公司）；DMEM/F-12培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（加拿大MULTICELL公司）；青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶（美国Gibco公司）；CCK-8检测试剂盒（大连美仑生物有限公司）；山羊血清、Tween-20溶液（碧云天生物科技公司）；荧光素异硫氰酸酯标记的小麦胚芽凝集素(WGA-FITC)、二甲基亚砜（DMSO）、大田软海绵酸、河豚毒素、环亚胺毒素（北京普华仕科技发展有限公司）；芋螺毒素（上海楚肽生物科技有限公司）；雷公藤甲素（上海陶素生物科技有限公司）。所有化学试剂除特殊说明外均为分析纯。
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精密称取OA溶解于DMSO，配置浓度为31 μmol/L的储备液；CTX溶解于超纯水中，配置浓度为200 μmol/L的储备液；TTX溶解于0.1%甲酸溶液，配置浓度为313 μmol/L的储备液；5 μmol/L的GYM标准溶液，氮气吹干后培养基复溶，于−20 ℃保存。用培养基稀释至低、中、高三个浓度的溶液：OA（10、50、100 nmol/L）、CTX（0.5、5、20 μmol/L）、TTX（0.04、0.4、4 μmol/L）、GYM（4、10、40 μmol/L）。雷公藤甲素溶解于DMSO，配置浓度为10 mmol/L的储备液，培养基稀释至实验浓度0.5、1、3、10、20、50 μmol/L。
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人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购买自美国ATCC细胞库，培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM/F-12培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。
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使用AutoCAD软件设计、软光刻技术制备三通道并列的微流控芯片，如图1所示。将凝血酶（4 U/ml）、PBS和纤维蛋白原（100 mg/ml）按25∶22∶3比例混匀加入芯片胶原通道；血管通道加入PBS稀释的基质胶（1∶50，V/V）后加入对数生长期的HUVEC细胞（3×106 cells/ml）；在外部设备上，使用蠕动泵灌注培养基，人体血流剪切应力为5~20 dyn/cm2，参照剪切应力公式τ=6 μQ/h2w计算流体流速（其中τ为流体剪切应力，μ为流体粘滞度，Q为流体流速，h和w分别为芯片内细胞培养腔的高度和宽度），模拟细胞在体内所受的血流剪切应力，于体外重构心血管微环境[2]。
图 1 心血管芯片模拟图
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取对数生长期的HUVEC细胞，按5 000 cells/孔的细胞密度接种于96孔板，空白组不加细胞。24 h后吸除原培养基，空白组与正常对照组各孔中只加入细胞培养液，实验组中加入含有不同浓度的毒素试液，每孔100 μl，每组6个平行。24 h后观察细胞形态，向各组每孔中加入10%的CCK-8溶液，避光孵育1 h。酶标仪检测450 nm处各样品的吸光度值（OD）计算相对细胞活力。
相对细胞活力（%）=[(OD药物−OD空白)/(OD对照−OD空白)]×100
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于心血管芯片模型血管通道加入20 μl不同浓度的毒素，24 h后用PBS缓慢润洗通道内细胞。将4%多聚甲醛缓慢注入到芯片微通道内，固定20 min，PBS润洗去除通道内残留的多聚甲醛。加入10%山羊血清的PBST（PBS+0.1% Tween-20），封闭30 min。在通道内加入适量的WGA-FITC（WGA-FITC∶PBS=1∶200，V/V
），避光孵育1 h。芯片通道PBS润洗3次，每次5 min，荧光倒置显微镜下观察并采集数据。根据毒素损伤前后WGA-FITC染色荧光强度（MFI）变化情况计算糖萼损伤率。 糖萼损伤率(%)=[1−(MFI损伤/MFI正常)]×l00
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考察不同浓度的雷公藤甲素对HUVEC细胞活性的影响，筛选出雷公藤甲素的最佳预保护浓度用于后续实验。取对数生长期的HUVEC细胞接种于96孔板，向实验组、对照组各孔中分别加入雷公藤甲素预保护1 h。实验组加入不同浓度的毒素溶液，CCK-8法评价雷公藤甲素对毒素损伤后HUVEC细胞的保护作用，实验步骤详见“1.5”项。
采用上述构建的心血管芯片模型，于血管通道内加入雷公藤甲素预保护1 h后，实验组加入不同浓度的毒素，考察雷公藤甲素对毒素损伤血管糖萼组织保护作用，实验步骤详见“1.6”项。
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采用Image J软件计算免疫荧光强度表达，GraphPad Prism 7统计学软件进行数据分析，组间比较采用单因素方差分析，*P<0.05，**P<0.01表示差异有统计学意义。
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以1 μl/min的流速动态培养细胞，HUVEC细胞在所构建的心血管器官芯片模型中生长状态良好，存活率高。经WGA-FITC免疫荧光染色，可清楚观察到结构完整的血管内皮糖萼，符合体外心血管模型的要求，如图2所示。
图 2 糖萼免疫荧光染色图
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采用CCK-8法考察不同浓度的雷公藤甲素对HUVEC细胞活力的影响，结果如图3所示，在测试浓度范围内，雷公藤甲素对HUVEC细胞不存在明显的活力抑制，选择浓度为1 μmol/L的雷公藤甲素进行后续实验。
图 3 雷公藤甲素对HUVEC细胞活力评价结果
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采用CCK-8法测定雷公藤甲素预保护前后，低、中、高三个浓度的毒素对HUVEC细胞活力的影响。与对照组相比，OA在中、高浓度下对细胞活力具有较强的抑制作用（P<0.01），其IC50为54.12 nmol/L。GYM在高浓度对细胞活力有较大影响（P<0.05），但是在加入1 μmol/L雷公藤甲素预保护后，OA与GYM对细胞的毒性显著降低，细胞活力与对照组相比无显著性差异，说明雷公藤甲素对OA和GYM损伤HUVEC细胞具有一定的保护作用。而CTX、TTX在雷公藤甲素预保护前后，对HUVEC细胞活力均无显著抑制作用，结果如图4、5所示。
图 4 四种毒素对HUVEC细胞活力评价结果
图 5 四种毒素在雷公藤甲素预保护后对HUVEC细胞活力评价结果
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在所建立的心血管芯片平台上研究雷公藤甲素对四种毒素产生细胞内皮糖萼损伤的保护作用，免疫荧光染色结果如图6和图7所示。OA作用后，HUVEC细胞出现皱缩、变圆、体积变小等形态变化，且随着实验浓度的增大，所呈现的上述细胞形态变化加剧，培养液中可见大量细胞碎片和悬浮的死细胞，说明OA对HUVEC细胞毒性较强，不仅对细胞糖萼有较严重的损伤，还影响了细胞与芯片PDMS基底的贴附水平，心血管芯片结构和功能受损。CTX、TTX和GYM作用后，HUVEC细胞受到不同程度的损伤，内皮细胞糖萼的WGA-FITC染色荧光强度信号与对照组相比均明显降低，具有统计学意义（P<0.01）。经雷公藤甲素预保护后，低浓度OA所产生的细胞损伤得以减轻，糖萼损伤率为28.20%，但是中浓度和高浓度作用下的细胞依旧损伤严重。除OA外，其余三种毒素作用后的糖萼WGA-FITC染色荧光强度均有明显升高，糖萼损伤率见表1。
图 6 毒素对心血管芯片上糖萼的损伤情况
图 7 雷公藤甲素预保护后毒素对心血管芯片上糖萼的损伤情况
表 1 心血管芯片上的糖萼损伤率
毒素 给药浓度(μmol/L) 糖萼损伤率（%） 预保护前 预保护后 CTX 0.5 36.30 14.90 5 48.04 13.47 20 52.28 26.52 TTX 0.04 29.55 6.52 0.4 40.30 6.69 4 41.97 14.60 GYM 4 23.53 0.22 10 25.89 3.65 40 40.41 6.01 -
海洋生物中的活性物质有很多，对海洋生物毒素研究却是冰山一角。海洋生物毒素根据化学结构的不同常分为三类：聚醚类、多肽类和生物碱类毒素[3]。OA是一种聚醚类化合物，是近年来研究最突出的一种海洋生物毒素，研究发现暴露于OA会导致细胞凋亡以及促进肿瘤和癌症的发生，对人体造成很大危害[4]。多肽类毒素以CTX最具代表性，CTX能特异性地作用于神经递质受体以及多种离子通道，不仅可直接作为药物，还可作为分子工具发展新药先导化合物，对神经生物学的研究具有重要意义[5]。TTX是一种生物碱类毒素，可选择性地与钠离子通道受体结合，研究发现，TTX的麻醉效果强，持续时间长，在镇痛、镇静方面应用前景广泛[6]。随着对海洋生物研究的深入，一些新的毒素也陆续被发现。GYM是一种具有环亚胺结构的毒素，相对于其他三种毒素发现较晚、毒性较弱，但其降解速度缓慢，存在长期毒性效应，在生态系统中的潜在风险不容忽视[7]。尽管海洋生物毒素的研究越来越受到人们的重视，但是现有的评价模型限制了毒素研究工作的进一步开展。
微流控器官芯片模型利用微流控技术对流体进行精确调控，模拟生物体内环境，在体外进行器官生理及病理状态的复制，到目前为止，已经实现肝、肾、肠道等多种器官芯片的构建，在药物筛选、药效和毒性评价方面显示出良好的应用前景[8]。大量研究表明，血液循环流动产生的剪切应力对内皮细胞分化、生长状态和功能表达有着重要作用[9]。本研究基于微流控技术构建心血管芯片模型，将HUVEC细胞接种于三通道的微流控芯片中，通过蠕动泵控制培养基流动速度为1 μl/min，有利于营养物质的输送和废物排出，与静态培养相比，细胞所处的动态环境更接近体内生理条件，心血管芯片模型中的细胞生长状态良好，形态呈铺路石样。
糖萼是存在于内皮细胞表面的多糖-蛋白复合物，参与调节炎症反应、血管通透性、凝血平衡在内的多种生理过程，是血管内皮细胞发挥生物功能的重要结构[10]。本研究采用免疫荧光染色法，通过FITC-WGA与HUVEC细胞中糖萼的葡萄糖胺基团选择性结合，测量其荧光强度以反映细胞糖萼损伤情况。结果显示，在实验浓度范围内，OA对细胞具有较大毒性，对糖萼组织损害严重；40 μmol/L的GYM对细胞活力有较强的抑制作用，糖萼损伤率高达40.41%；而TTX和CTX两种毒素对HUVEC细胞无明显活力抑制，但是其糖萼组织受损严重，可见这两种毒素虽然本身对细胞不存在明显的毒性作用，但是通过其他途径与细胞上的结构组织相互作用，从而影响细胞的功能表达。
雷公藤甲素是卫矛科植物雷公藤的主要活性成分，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理作用，但是对心血管的作用尚未完全明确。张诗雨等[11]发现雷公藤甲素可作用于血管内皮细胞核转录因子NF-κB，改善脂多糖(LPS)刺激HUVEC细胞所产生的炎症反应。宗佳琪等[12]在LPS诱导的内毒血症大鼠的心血管功能损伤研究中，同样也发现雷公藤甲素对血管内皮相似的保护作用。本研究初步探索了雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用，结果显示，经1 μmol/L雷公藤甲素预保护后，四种毒素作用下的细胞活力与对照组相当，对实验浓度范围内CTX、TTX、GYM以及低浓度OA所产生的糖萼损伤具有一定保护作用。
综上，本文构建了一种心血管芯片模拟心血管结构与功能，包括血管表面的糖萼组织。应用该芯片考察了OA、TTX、CTX和GYM四种深海毒素的毒性效应，发现四种毒素对HUVEC细胞活力以及表面的糖萼组织具有损伤，且呈一定的剂量关系，而雷公藤甲素对上述毒素致伤具有保护作用。
Evaluation of toxin-induced injury and protective effect of triptolide based on a cardiovascular chip model
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摘要:
目的 构建一种心血管芯片模型，评估四种海洋毒素即大田软海绵酸(OA)、芋螺毒素(CTX)、河豚毒素(TTX)和环亚胺毒素(GYM)对血管糖萼组织的损伤，初步探索雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用。 方法 将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种于三通道结构的微流控芯片，并对所构建的心血管芯片模型进行表征。采用CCK-8法和免疫荧光染色法分析低、中、高三个浓度的海洋毒素对细胞活力和糖萼组织损伤情况，以及雷公藤甲素对毒素致伤的保护作用。 结果 所构建心血管器官芯片中的细胞生长状态良好，具有结构完整的糖萼组织，与对照组相比，OA中、高浓度以及GYM高浓度均对细胞活力具有一定抑制（P<0.05)，CTX和TTX在所测浓度下对细胞没有明显活力抑制，但是四种毒素均引起细胞表面糖萼组织的严重损伤（P<0.01)，且随着浓度增加，糖萼损伤率升高。经雷公藤甲素预保护后，四种毒素对HUVEC的毒性显著降低，糖萼组织损伤率下降。 结论 四种毒素对HUVEC细胞活力以及表面的糖萼组织具有损伤，且呈一定的剂量关系，而雷公藤甲素对毒素损伤后的HUVEC细胞具有保护作用。 Abstract:Objective To construct a cardiovascular chip model for evaluating the damage of vascular glycocalyx induced by four marine toxins: okadaic acid (OA), conotoxin (CTX), tetrodotoxin (TTX) and gymnodimine (GYM), and explore the protective effect of triptolide on toxin-induced injury. Methods Human umbilical vein endothelial cells（HUVEC) were inoculated into a three-channel microfluidic chip. CCK-8 method and immunofluorescence staining were used to analyze the damage of cell viability and glycocalyx tissue induced by low, middle and high concentrations of marine toxin, as well as the protective effect of triptolide on toxin-induced injury. Results The cells in the cardiovascular chip grew well and had structurally intact glycocalyx. Compared with the control group, the activity of HUVEC cells were inhibited in group of the medium and high concentration of OA and high concentration of GYM (P<0.05). The activity of cells had not been inhibited by CTX and TTX significantly , but all the four toxins caused serious damage to the glycocalyx tissue (P<0.01). After pre-protection with triptolide, the toxicity of the four toxins to HUVEC cells and the damage rate of glycocalyx decreased significantly. Conclusion The four marine biotoxins could damage the activity and glycocalyx of HUVEC cells in a dose-dependent manner, while triptolide has a protective effect on HUVEC cells injured by toxin. -
Key words:
- cardiovascular chip /
- marine biotoxins /
- glycocalyx damage /
- triptolide
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炎症泛指机体受到创伤或病原体感染等刺激后所产生的生理反应，主要表现为疼痛、红肿、发热等[1]。通常情况下，机体受到创伤等刺激后，所产生的炎症反应是一种生理性保护反应，有益于机体损伤的修复[2-3]，但当机体内的抗炎系统过于活跃时，会引起自身免疫系统紊乱，对机体正常的细胞及组织进行攻击，如系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等免疫疾病[4]。目前，临床上常用的抗炎药物主要分为甾体类抗炎药（SAIDs）、非甾体类抗炎药（NSAIDs）及免疫调节药，但这几类药物多具有副作用[5-7]，因此，新型抗炎药物的研发具有极高的科研前景和社会价值。豆豉姜是樟科植物山鸡椒Litsea cubeba（Lour.）Pers的根及根茎，被傣医学及中医作为广泛的民间方剂，多用于祛风散寒、息肝风、消肿、治风湿痹痛的治疗。前期课题组提取分离得到新型的二苄基丁烷型木脂素9,9’-O-二-(E)-阿魏酰基-内消旋-5,5’-二甲氧基开环异落叶松树脂酚（LCA）化学结构如图1所示，并发现其具有改善类弗氏完全佐剂大鼠关节炎模型中炎性症状的疗效[8]，因此，课题组推测LCA是豆豉姜中具有抗炎活性的天然化合物，故采用小鼠耳肿胀和棉球肉芽肿模型及RAW264.7细胞实验，对其抗炎作用进行研究。
1. 材料
1.1 实验动物
二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验模型：5周龄SPF级雄性昆明小鼠，体重：（20±2）g；大鼠棉球肉芽肿实验：4周龄SPF级雄性SD大鼠，体重：（120±10）g。动物由海军军医大学实验动物中心提供，并饲养于海军军医大学药学院动物房，室温控制为24 ℃，12 h光照+12 h黑暗，水及食物充足供应。RAW264.7（海军军医大学药学院生药学教研室）。
1.2 试剂与器材
LCA（海军军医大学药学系有机化学教研室合成及鉴定）；吲哚美辛（海军军医大学附属长海医院）；二甲苯、水合氯醛、羧甲基纤维素钠CMC-Na、对氨基苯磺酸、磷酸、N-α-萘乙二胺（中国医药集团）；棉球（中国朝阳公司）；ELISA试剂盒（中国联科公司）；iNOS、COX-2、GAPDH抗体及二抗（CST，USA）。分析天平（MettlerToledo，USA）；CO2恒温细胞培养箱（Sanyo，Japan）；ELx 800酶标仪（Fisher，US）；凝胶成像仪（Tanon-5200 multi，中国上海）。
2. 方法
2.1 动物实验
2.1.1 动物模型建立及处理
小鼠耳廓肿胀模型建立：将60只5周龄健康雄性昆明鼠安置于动物实验中心适应1周，按体重随机分为4组，各10只，组别标记为：模型组；LCA组（20、40 mg/kg）；吲哚美辛组（8 mg/kg）。给药以灌胃的形式每日一次，模型组则予相同体积的0.5% CMC-Na连续3 d灌胃，在末次给药1 h后，将二甲苯以0.05 ml/只剂量均匀涂布于小鼠右耳廓的双面，左耳不做处理，连续刺激45 min后处死小鼠，用打孔器分别于左右耳廓同一位置打下圆形耳片[9]，称重，用于计算比较耳肿胀程度及耳肿胀抑制率（%）。
大鼠棉球肉芽肿模型建立：将20只4周龄健康雄性SD大鼠安置于动物实验中心适应1周，按体重随机分为4组：模型组；LCA组（20、40 mg/kg）；吲哚美辛组（5 mg/kg）。用水合氯醛对大鼠进行麻醉，于左右两边腋窝下切开一小口，将2个灭菌棉球（20 mg）分别植入小鼠左右腋窝，缝合后第2天给药。且以灌胃的形式每日一次，模型组则予相同体积的0.5% CMC-Na连续7 d[10-11]。第8天处死大鼠，将腋下棉球及附着的肉芽组织剥离，称重，用于计算比较干湿重及抑制率。
2.1.2 动物指标测定
耳肿胀度=右耳片重量－左耳片重量
耳肿胀抑制率（%）=（模型组平均耳肿胀度－给药组平均耳肿胀度）/模型组平均耳肿胀度×100%
平均棉球肉芽肿重量=（右侧棉球肉芽肿重量+左侧棉球肉芽肿重量）/2
棉球肉芽肿抑制率（%）=（模型组平均棉球肉芽肿重量－给药组平均棉球肉芽肿重量）/模型组平均棉球肉芽肿重量×100%
2.2 RAW264.7细胞实验
2.2.1 细胞培养
RAW264.7（小鼠单核巨噬细胞）用DMEM高糖完全培养基（10% DMEM+90% FBS+1%双抗）培养于37 ℃恒温细胞培养箱中。
2.2.2 细胞增殖检测
将RAW264.7细胞以1×103个/孔接种于96孔板，完全培养基培养24 h，弃上清液，给予不同浓度的LCA培养液（3、1.5、0.75和0.375 μmol/L），并设置空白对照组，每组5个复孔，培养24 h，采用MTT法测定LCA对小鼠单核巨噬细胞的增殖作用。
2.2.3 炎症因子水平测定
将RAW264.7细胞以1×106个/孔接种于24孔板，24 h后弃上清液，脂多糖（LPS）组和LCA组中加入1 ml含2 μg/ml LPS的完全培养基，刺激2 h，于空白组和LPS组中加入1 ml完全培养基，给药组加入各浓度LCA（1.5、0.75和0.375 μmol/L）的完全培养基，作用24 h后，测NO含量：取100 μl上清液与100 μl Griess试剂（A液：对氨基苯磺酸0.1 g，加5%磷酸10ml；B液：N-α-萘乙二胺0.01 g，加10ml蒸馏水，等体积混合）混合避光显色30 min，用酶标仪于540 nm处测各孔吸光度（A）值；测TNF-α：取上清液，根据ELISA试剂盒说明书步骤测量上清液中炎症因子TNF-α的含量。
2.2.4 炎症相关蛋白表达检测
将RAW264.7细胞以1×106个/孔接种于6孔板，细胞贴壁后，处理组（LPS组、LCA组）中加入1ml含2 μg/ml LPS的完全培养基，刺激2 h，于空白组和LPS组中加入1 ml完全培养基，给药组加入各浓度LCA（1.5、0.75和0.375 μmol/L）的完全培养基，作用24 h后，细胞裂解提取蛋白并定量，蛋白变性后SDS-PAGE凝胶电泳分离后，转膜，封闭，依次用iNOS，COX-2及GAPDH于4 ℃孵育过夜，用洗膜液（TBST）清洗3次后，二抗室温孵育1 h，TBST洗涤后，用化学发光试剂盒于凝胶成像仪中显影拍片。
2.3 统计分析
本实验指标均为定量数据，数据以（
$\bar{x}\pm s$ ）形式表示。多组定量数据的比较，采用单因素方差分析，方差分析检验后两两比较采用Dunnett's t-test法。采用GraphPad Prism 5统计软件进行统计学分析。结果以P<0.05、P<0.01表示差异具有统计学意义。3. 结果
3.1 LCA对小鼠耳肿胀的影响
如表1所示，与模型组对比，吲哚美辛（8 mg/kg）可抑制由二甲苯造成的小鼠耳廓肿胀（P<0.05），抑制率为29.80%；LCA（40 mg/kg）组显著抑制小鼠耳廓肿胀度（P<0.01），抑制率为37.41%，而LCA（20 mg/kg）组对小鼠耳廓肿胀度的抑制无统计学意义（P>0.05）。
表 1 LCA对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响(n=10，$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 肿胀度（m/mg） 抑制率（%） 模型组 3.02±0.63 — LCA组（20 mg/kg） 2.52±0.29 16.56 LCA组（40 mg/kg） 1.89±0.54** 37.41 吲哚美辛组（8 mg/kg） 2.12±0.61* 29.80 *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较。 3.2 LCA对大鼠棉球肉芽肿的影响
如图2，模型组大鼠棉球肉芽肿体积较大且颜色鲜红，吲哚美辛组的棉球肉芽肿体积小且颜色浅，而LCA组的棉球肉芽肿在色泽和大小上均有别于模型组。数据分析显示（表2、表3），与模型组相比，阳性药组吲哚美辛明显抑制大鼠的棉球肉芽肿（P<0.001），且干重、湿重的抑制率分别为48.73%和44.19%；LCA高剂量组也可明显减少棉球肉芽肿的干重及湿重（P<0.01），且抑制率达到23.89%和29.90%。
表 2 LCA对大鼠棉球肉芽肿湿重的影响(n=5，$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿湿重（m/mg） 抑制率（%） 模型组 300.1±53.26 — LCA组（20 mg/kg） 256.0±36.36 14.70 LCA组（40 mg/kg） 228.4±51.16*** 23.89 吲哚美辛组（5 mg/kg） 167.5±15.74*** 44.19 ***P<0.001，与模型组比较。 表 3 LCA对大鼠棉球肉芽肿干重的影响(n=5，$\bar{ x}\pm {{s}}$ )组别 棉球肉芽肿干重（m/mg） 抑制率（%） 模型组 48.1±10.05 — LCA组（20 mg/kg） 42.32±10.19 12.05 LCA组（40 mg/kg） 33.73±7.10** 29.90 吲哚美辛组（5 mg/kg） 24.67±7.39*** 48.73 **P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。 3.3 LCA对LPS刺激RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响
如图3所示，LCA的安全剂量不高于3 μmol/ml，且在0.75和1.5 μmol/ml浓度下显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌的NO和TNF-α浓度，差异均具有统计学意义（P<0.01）。
图 3 LCA对LPS刺激RAW264.7细胞增殖、NO和TNF-α分泌量的影响(n=5，$\bar{{{x}}}\pm {\bf{s}}$ )A. 细胞增殖率；B.NO浓度；C. TNF-α浓度；** P <0.01，*** P <0.001，与LPS组比较；## P <0.01，### P <0.001，与空白组比较。3.4 LCA对炎症相关的蛋白表达的影响
如图4所示，LCA在1.5 μmol/ml浓度下显著抑制了炎症相关蛋白iNOS、COX-2蛋白的表达（P<0.001）。
图 4 LCA对炎症相关蛋白表达的作用(n=3，$\bar{{{x}}}\pm {\bf{s}}$ )A. Western blotting检测iNOS、COX-2蛋白的表达水平；B. iNOS/GAPDH比值；COX-2/GAPDH比值；*P<0.05，***P<0.001，与LPS组比较；##P<0.01，###P<0.001，与空白组比较。4. 讨论
据报道[12]，许多从中药中提取的活性天然化合物可以达到抗炎效果，包括黄芩苷、青藤碱和大黄素等，多为甘草次酸酰胺类衍生物。LCA不同于这些抗炎药物，它具有新颖的二苄基丁烷型结构，本研究从体内、体外两方面对它进行较为系统的抗炎药效评价。
二甲苯诱导的小鼠耳肿胀模型是评价药物体内抗炎活性的急性炎症模型之一[13]，本实验模型组中二甲苯作为致炎剂刺激小鼠耳廓皮肤，促进血管舒张、增加血管通透性致使炎性物质渗出，耳片重量明显高于未经处理的耳片重量，LCA组能明显改善小鼠耳部的炎性渗出及肿胀程度，且高浓度组的抑制率高于阳性药吲哚美辛组（由于吲哚美辛高浓度有强烈的胃肠道反应，故根据临床用药剂量换算出实验动物的剂量，并参考相关文献确定用药量[13]，即8 mg/kg），表明LCA对急性炎症有显著作用。在慢性炎症期，由于巨噬细胞和纤维母细胞等增生而形成肉芽组织，棉球肉芽肿实验可模拟炎症病理过程中炎性细胞浸润和肉芽组织的增生[14]。结果显示LCA降低棉球肉芽肿的湿重与干重，表明LCA可以控制慢性炎症过程中炎性渗出物的转移，同时抑制棉球外侧小血管和结缔组织的增生，证明LCA可以减少慢性炎症进程中肉芽组织的形成。结合上述两个动物实验可知LCA对急性炎症以及慢性炎症都具有一定的抑制作用。
炎症的普遍特征是病灶区域有大量炎症细胞的浸润，并释放大量炎症因子和介质，如IL-1、IL-6、TNF-α、前列腺素（PG）、组织胺和NO等。其中，NO可激活NF-κB信号通路，诱导促炎因子（IL-6、TNF-α等）的分泌，引起机体组织损伤以及血管扩张；TNF-α可刺激细胞免疫中T细胞产生炎症因子，进而诱导炎症的加重和扩大。iNOS可介导产生的大量NO并参与炎症反应；COX-2介导产生的前列腺素与慢性炎症的发展和持续有关，致使白细胞聚集和浸润，引起微血管内皮细胞的损伤。在本研究中，LPS刺激后，RAW264.7细胞分泌的NO和TNF-α含量，以及细胞内iNOS和COX-2蛋白水平明显增高，LCA浓度为1.5 μmol/ml时显著抑制激活状态下NO和TNF-α炎症介质的分泌，同时下调iNOS及COX-2蛋白的表达水平。由此进一步证实LCA具有抗炎作用。然而，LCA抗炎的具体作用机制尚不明确，有待今后进行更深层次的研究探讨。
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图 7 雷公藤甲素预保护后毒素对心血管芯片上糖萼的损伤情况
A.糖萼免疫荧光染色图; B~D.分别为芋螺毒素、河豚毒素、环亚胺毒素的糖萼量化分析结果，*P<0.05，与对照组比较
表 1 心血管芯片上的糖萼损伤率
毒素 给药浓度(μmol/L) 糖萼损伤率（%） 预保护前 预保护后 CTX 0.5 36.30 14.90 5 48.04 13.47 20 52.28 26.52 TTX 0.04 29.55 6.52 0.4 40.30 6.69 4 41.97 14.60 GYM 4 23.53 0.22 10 25.89 3.65 40 40.41 6.01 
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