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骨质疏松症和阿尔茨海默病均为退行性疾病，越来越多的研究表明它们的发病机制具有关联[1]。骨质疏松症往往伴随着认知缺陷，Aβ沉积是阿尔茨海默病的典型症状，而阿尔兹海默病小鼠（APPswe/PS1dE9）的骨组织中也会出现Aβ沉积，并出现骨密度降低，骨强度减弱等骨质疏松症状[2]。另有研究表明，氧化应激会导致 Aβ沉积，这种氧化损伤状态可被抗氧化剂改善[3]。因此， Aβ沉积偶联氧化损伤可视为阿尔茨海默病及骨质疏松症的共同发病机制。巴戟天丸收载于明代《古今医统大全》，由君药巴戟天，臣药远志、石菖蒲、茯苓、人参以及地骨皮、茯神组成[4]。前期课题组研究已证实，巴戟天丸组方可以从体内外水平上改善D-半乳糖（D-gal）引发的骨丢失，但巴戟天丸组方治疗Aβ沉积所致的骨丢失及具体作用机制有待进一步阐明[4, 5]。因此，本研究拟以Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞模型，对巴戟天丸组方的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究，并通过网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。
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取质量比为5∶10∶10∶10∶10∶10∶3的巴戟天、茯苓、茯神、地骨皮、远志、石菖蒲、人参粉末，混合均匀。按照料液比1∶10加入去离子水，浸泡1 h后，加热煎煮，回流提取2次，每次1 h，所得药液过滤，合并两次的滤液。将收集到的滤液减压浓缩成浓度为2.6 g（生药量）/ml的巴戟天丸水提物母液。-20°C保存备用。
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新生 24 h Wistar 大鼠（上海西普尔-必凯实验动物有限公司）；胎牛血清（以色列BI）；MTT（上海碧云天）；BCIP/NBT 碱性磷酸酯酶显色试剂盒（上海碧云天）、ALP、CAT、SOD、GSH 、MDA 试剂盒（南京建成）；PBS（天津灏洋）；DMSO（上海博光）；α-MEM 培养基（上海富衡）； BMP2、RUNX-2、OPG、GAPDH抗体（美国Abcam）。
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采用二次消化法从新生 24 h Wistar 大鼠的颅盖骨中分离得到原代成骨细胞，将成骨细胞培养于 α-MEM 培养基中（10% 胎牛血清），置于 37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养，取第 3～5 代成骨细胞进行后续实验。
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将成骨细胞以 2×104个/孔接种于无菌 96 孔板中，孵育过夜。空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含N-乙酰半胱氨酸（NAC）的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.008、0.04、0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到 20 mmol/L。培养 48 h 后，采用 MTT 法测定细胞增殖水平。
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ALP 活性检测：按照“1.4.2”项的方法进行给药，培养 48 h 后，取上清液，根据说明书进行 ALP 活性测定。将成骨细胞以 1×105 个/孔接种于无菌6孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后进行染色，室温下避光孵育 48 h，洗去工作液后置于显微镜下拍照。
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将成骨细胞以2×104个/孔和5×104 个/孔分别接种于接种于无菌96孔和24孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，空白组和模型组更换新的完全培养基，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养液（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组、阳性药组和给药组给予Aβ1-42寡聚体进行损伤，使培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。培养 48 h 后根据说明书进行检测。
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将细胞以 2×105 个/孔接种于 6 孔板中，孵育过夜，细胞完全贴壁后，阳性药组加入含NAC的完全培养液（1 mmol/L）, 给药组分别加入含不同浓度的巴戟天丸组方完全培养基（0.2、1、5 μg/ml），4 h 后模型组和给药组加入Aβ1-42寡聚体，使完全培养基中Aβ1-42寡聚体浓度达到20 mmol/L。48 h 后，吸去培养基，PBS 洗涤 3 次。于冰上对细胞进行裂解提取总蛋白，采用 BCA 试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，经 SDS-PAGE 凝胶电泳后转移至 PVDF 膜进行转膜，室温封闭1 h后，加入相应的一抗，4 ℃过夜，1×TBST洗涤 3 次，加二抗于室温孵育 50 min，1×TBST洗涤 3 次，采用 ECL 化学发光试剂盒检测。
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使用 SPSS Staistics 24 统计分析软件进行统计学分析。计量数据均采用（
$\bar{x} $ ±s）表示，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。使用 Graphpad prism 9.0 软件进行统计及绘图。以P<0.05 为差异有显著性意义。 -
通过TCMSP（http://tcmsow.com/tcmsp.php）和ETCM数据库（http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php），查找巴戟天、地骨皮、茯苓、人参、石菖蒲和远志6味中药的成分。在TCMSP数据库中，选择药物口服利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18的成分，在ETCM数据库中根据DrugLikeness Grading评分，选择评分为Moderate和Good的成分[6]。
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通过Uniprot（http://www.uniprot.org/）数据库，将靶点映射成基因，利用Cytoscape 3.6.0软件绘制成分靶点图。
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通过Disgenet数据库（http://www.disgenet.org/）和Genecards数据库（https://www.genecards.org/）查找阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点，绘制PPI蛋白相互作用网络图，整合两大数据库中的靶点基因，去除重复的靶点。利用Venny2.1，将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析。
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利用Venny2.1，将阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方相关靶点进行交集分析。将药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。
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采用Metascape数据库，对关键靶点进行GO基因富集分析（http://geneontology.org/）和KEGG代谢通路分析（http://www.genome.jp/kegg/），分析巴戟天丸中的主要分子生物过程和信号通路。
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Aβ1-42寡聚体可显著抑制成骨细胞的增殖；巴戟天丸组方在 0.04、0.2、1、5 μg/ml浓度下均能够显著提高成骨细胞的增殖水平（图1A）。Aβ1-42寡聚体会显著抑制成骨细胞中骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达；给予巴戟天丸组方干预后，BMP2、RUNX-2、OPG的表达显著提高，提示巴戟天丸组方可显著促进Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞的骨形成（图1B）。与空白组相比，Aβ1-42寡聚体可以显著降低成骨细胞的 ALP 活性，而巴戟天丸组方显著逆转了 Aβ 损伤成骨细胞的 ALP 活性，促进成骨细胞的分化（图1C、D）。
图 1 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞增殖、骨形成相关蛋白以及ALP活性的影响（n=6）
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如图2 所示，Aβ1-42寡聚体显著降低了成骨细胞CAT（图2A）、SOD（图2B）、GSH（图2D）的活性，提高MDA的活性（图2C），导致成骨细胞的氧化损伤，而巴戟天丸组方低、中、高剂量均可以显著改善Aβ1-42寡聚体导致的氧化损伤。
图 2 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞抗氧化能力的影响（n=4）
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根据条件筛选后，其中，巴戟天成分为20种，地骨皮成分为12种，茯苓成分为10种，人参成分为18种，石菖蒲成分为10种，远志成分为5种，茯神成分0种，共计成分75种。
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通过TCMSP和ETCM数据库查找满足筛选条件的化学成分对应的靶点，得到151个预测靶点。删除重复靶点后，通过Uniprot数据库映射成基因ID，剔除重复靶点后，得到143个基因symbol（图3）。
图 3 巴戟天丸组方成分靶点图
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通过Disgenet数据库和Genecards数据库查找得到阿尔兹海默病相关疾病靶点10 362个，骨质疏松症相关疾病靶点4 582个，并将所得靶点进行蛋白相互作用网络分析（图4A、B）。将阿尔兹海默病和骨质疏松症相关的疾病靶点图进行交集分析，得到共有靶点2 674个（图4C）。
图 4 阿尔兹海默病、骨质疏松症靶点图
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将2 674个疾病交集靶点基因和143个药物成分靶点基因再次进行交集分析，得到共有靶点95个（图5A），将95个药物疾病交集靶点上传到String数据库进行分析，绘制PPI蛋白相互作用网络图。将单独节点去除后，图中共有94个节点，871条边，意味着它们间有特殊的关联，即蛋白质共同贡献一个共同的功能，每个靶点的平均节点度为18.3，说明交集靶点间关系密切而且存在很强的相互作用关系（图5B）。
图 5 阿尔兹海默病、骨质疏松症与巴戟天丸组方共同靶点图
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GO富集分析包括生物过程（BP）、分子功能（MF）及细胞组分（CC），将每个结果前 10 的条目可视化为条形图（图6A）。巴戟天丸活性物质参与的BP主要包括对脂多糖的反应、对氧含量的反应、细胞凋亡信号途径、活性氧代谢过程。MF主要包括G蛋白偶合胺受体的活性、神经递质受体的活性、氧化还原酶活性、参与凋亡信号通路的半胱氨酸型内肽酶活性、泛素类蛋白连接酶结合。CC主要包括膜筏、突触膜的整体组成部分、浆膜筏等。 KEGG 通路富集分析中主要涉及与阿尔兹海默症、骨质疏松症相关的通路有AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等（图6B）。
图 6 巴戟天丸GO基因富集分析和KEGG代谢通路分析
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骨骼重塑是一个重要的生理过程，其主要包括两个阶段，成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收[7]。其中，成骨细胞的增殖能力反映骨形成的强弱，其分泌的 ALP 是分化阶段的关键酶，可促进骨组织矿化[8]。本研究中，各剂量巴戟天丸均可显著改善Aβ损伤成骨细胞的增殖抑制，且0.2 μg/ml效果最好，5 μg/ml的效果优于0.04 μg/ml，故选择0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml作为巴戟天丸给药剂量进行后续实验，并发现其可显著提高Aβ损伤成骨细胞的ALP活性和骨形成相关蛋白 BMP2、RUNX-2、OPG的表达，促进骨形成。GSH是细胞抗氧化系统的一个重要成员，高水平的GSH对于清除过多的活性氧（ROS）和解毒异物是不可缺少的[9]。MDA是细胞中多不饱和脂肪酸过氧化的最终产物之一，自由基的增加会导致MDA的过度生产，加剧氧化损伤[10]。SOD和CAT是重要的酶类抗氧化剂，二者活性的降低会导致氧化损伤[11,12]。本实验中巴戟天丸组方可逆转Aβ损伤成骨细胞GSH、SOD、CAT活性的降低， MDA活性的升高，结果所表现的剂量依赖与增殖实验相吻合，表明巴戟天丸组方可作为抗氧化剂改善成骨细胞的氧化损伤。后采用网络药理学方法进一步探究巴戟天丸干预Aβ损伤成骨细胞的作用机制，结果显示，巴戟天丸促进Aβ损伤状态下成骨细胞骨形成的作用可能与AGE-RAGE、PI3K-Akt及MAPK等信号通路有关。其中，AGE-RAGE信号通路的激活会扰乱细胞的氧化还原平衡并调节各种细胞死亡途径 [13]。作为AGE-RAGE信号通路的下游， PI3K-Akt信号通路的激活会增强细胞的抗氧化能力，保护细胞免受氧化应激[14]。此外，MAPK通路的激活同样可以减轻氧化应激状态[15]，故网络药理学研究结果同样提示巴戟天丸组方可通过缓解氧化损伤发挥干预Aβ沉积损伤成骨细胞的作用。
The roles of Bajitianwan formula on Aβ-injured osteoblasts and the mechanism based on network pharmacology
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摘要:
目的 探讨巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的骨形成作用及其机制。 方法 以新生24 h Wistar大鼠所分离的成骨细胞为研究对象，用 Aβ1-42 寡聚体对成骨细胞进行损伤，并用巴戟天丸组方水提物进行药物干预。分别采用MTT法、碱性磷酸酶（ALP）活性检测、过氧化氢酶（CAT）活性检测、超氧化物歧化酶（SOD）活性检测、谷胱甘肽（GSH）活性检测以及丙二醛（MDA）活性检测。采用蛋白质印迹法检测骨形成相关蛋白骨形态发生蛋白2（BMP2）、成骨特异性转录因子（RUNX-2）、骨保护蛋白（OPG）的表达水平；明确巴戟天丸组方对Aβ损伤成骨细胞的作用后，采用网络药理学方法对潜在的作用机制进行预测。 结果 巴戟天丸组方可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖，提高 ALP、SOD、GSH 活性，抑制MDA活性，并促进骨形成相关蛋白BMP2、RUNX-2、OPG的表达。网络药理学分析显示，巴戟天丸组方发挥改善Aβ损伤成骨细胞的作用主要与AGE-RAGE信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路以及神经活性配体与受体的相互作用通路等有关。 结论 明确巴戟天丸组方具有改善Aβ损伤成骨细胞的作用，并通过网络药理学方法探究其相关作用通路，为传统方剂巴戟天丸抗骨质疏松的临床应用提供借鉴。 Abstract:Objective To explore the effect of Bajitianwan（BJTW）formula on bone formation of Aβ-injured osteoblasts and its mechanism. Methods Osteoblasts isolated from neonatal 24-hour Wistar rats were used for the study, and osteoblasts were subjected to damage with Aβ1-42 oligomers, and pharmacological intervention was performed with the aqueous extract of BJTW formula. The MTT assay, alkaline phosphatase（ALP）activity assay, catalase（CAT）activity assay, superoxide dismutase（SOD）activity assay, glutathione（GSH）activity assay and malondialdehyde（MDA）activity assay were carried out respectively. The expression levels of bone morphogenetic protein 2（BMP2）, osteogenic specific transcription factor（RUNX-2）and osteoprotective protein（OPG）were detected by Western blotting. After confirming the effect of BJTW formula on Aβ-injured osteoblasts, the network pharmacology method was used to predict the potential pathways. Results The BJTW formula significantly promoted the proliferation of Aβ-injured osteoblasts, increased ALP, SOD and GSH activity, inhibited MDA activity, and promoted the expression of bone formation-related proteins BMP2, RUNX-2 and OPG. Network pharmacological analysis showed that the effect of ameliorating of Aβ-injured osteoblasts by BJTW formula was mainly mediated by AGE-RAGE, PI3K-Akt, MAPK and neuroactive ligand-receptor interaction signaling pathways. Conclusion In this study, the effect of BJTW formula on improving the osteoblasts damaged by Aβ was confirmed for the first time, and its related mechanism was explored based on network pharmacology method. The results lay a strong foundation for the clinical application of traditional formula BJTW against osteoporosis. -
Key words:
- osteoblasts /
- Bajitianwan /
- Aβ deposition /
- network pharmacology
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肺结核是我国青藏高原多发病[1]。2000年以来，全国肺结核发病率普遍下降，由峰值96.3/10万降至 59.3/10万。与之相反，肺结核发病率在青海地区呈总体上升趋势，由48.7/10万（2002年）上升至140.3/10万（2018年），远高于全国平均水平[2-5]。肺结核是一种慢性肺部疾病，由结核分枝杆菌引起，其特点是肺部损伤伴有干酪样化、坏死和纤维化，导致空腔形成，该空腔富含氧气和坏死组织物质，因此它成为包括念珠菌在内的多种生物的生长场所[6]。自然界中念珠菌种类众多，但绝大多数的侵袭性念珠菌感染由白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌，这5种最常见的病原体引起[7]。在临床治疗中，高原肺结核患者的特点为：症状重、病程进展快、合并症多；且肺结核与肺部念珠菌感染的症状类似，但肺部念珠菌感染症状更隐匿，易漏诊和延迟治疗，影响患者治疗及预后[8]。该研究选取2020年3月1日至2020年12月31日青海省第四人民医院（本院）3 012例住院肺结核患者为调查对象，分析肺结核合并肺部念珠菌感染分布特点及耐药率，为临床诊疗提供理论依据。
1. 资料与方法
1.1 临床资料
调查对象为2020年3月1日至2020年12月31日本院3 012例住院肺结核患者。男性1 895例，占62.92%；女性1 117例，占37.08%；年龄18～94岁，平均（39.30±5.5）岁；患者主要临床症状表现为胸痛、发热、咳痰、咯血、气短及呼吸困难等。
1.1.1 纳入标准
①经实验室和影像学检查，检测值均符合中华医学会结核病学分会肺结核的诊断标准及《内科学（第6版）》中肺部感染[9]的诊断标准；②签署知情同意书。
1.1.2 排除标准
①免疫性疾病相关患者；②肺部肿瘤等其他肺部疾病患者。本研究经医院伦理委员会批准，符合伦理规范，同意本研究的开展。
1.2 试验方法
收集确诊肺结核患者痰液样本，经过念珠菌培养2次，结果均为念珠菌属阳性感染。采用梅里埃公司VITEK-32-YBC细菌分析系统进行念珠菌鉴定，对检出念珠菌进行药敏试验，结果证明白念珠菌为质控菌株。
1.3 统计分析
使用SPSS21.0软件对数据进行统计分析，分析数据结果，率的比较采用χ２检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 不同类型肺结核患者念珠菌感染分布特点
3 012例肺结核患者中合并念珠菌感染的患者为283例，感染率为9.40%，详见表1。
表 1 不同类型肺结核患者念珠菌感染率肺结核分型 调查例数 感染例数 感染率（%） χ２ P 浸润型 903 38 4.21 44.629 <0.001 纤维空洞型 2 044 242 11.84 血行播散型 65 3 4.62 2.2 肺结核患者感染念珠菌构成比
在283例念珠菌感染患者中，白念珠菌占79.86%，见表2。
表 2 肺结核患者痰培养念珠菌构成比念珠菌 株数 构成比（%） 白念珠菌 226 79.86 光滑念珠菌 35 12.37 热带念珠菌 10 3.53 克柔念珠菌 5 1.77 近平滑念珠菌 2 0.71 其他 5 1.77 合计 283 100.00 2.3 感染念珠菌对抗真菌药耐药率
该研究选取10种抗真菌药物，对白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌及近平滑念珠菌进行药敏试验，详见表3。
表 3 肺结核患者感染念珠菌对抗真菌药物的耐药率（%）抗真菌
药物白色念珠
菌耐药率光滑念珠
菌耐药率热带念珠
菌耐药率克柔念珠
菌耐药率近平滑念珠
菌耐药率两性霉素B 0.87 0.00 0.00 15.23 0.00 氟胞嘧啶 7.36 0.00 0.00 14.78 0.00 制霉菌素 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 咪康唑 0.50 0.00 0.12 0.26 0.00 伊曲康唑 78.35 63.89 0.00 45.63 0.00 伏立康唑 77.06 65.63 7.63 56.36 0.00 氟康唑 81.90 63.33 0.00 100 0.00 酮康唑 0.50 0.00 0.15 0.00 0.00 卡泊芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 米卡芬净 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 3. 讨论
3.1 青藏高原肺结核合并念珠菌感染的主要类型
在该研究调查的3 012例肺结核患者中，念珠菌感染283例，占总数的9.40%，其中纤维空洞型242例，浸润性38例，血性播散型3例。纤维空洞型肺结核对肺部产生慢性破坏，干酪化、纤维化及坏死组织导致肺部空洞形成和支气管扩张，空洞内大量干酪样坏死物质形成，支气管扭曲变形，导致肺组织结构完整性被破坏，局部抵抗力下降，为结核杆菌和包括念珠菌在内的多种真菌提供下行感染的滋生地，即使在结核杆菌被消灭的情况下，念珠菌也经常会定植于肺部空腔并持续破坏已经扩张的支气管，导致纤维空洞型感染为肺结核合并念珠菌菌感染的主要类型[10]。
3.2 青藏高原肺结核合并念珠菌感染的主要因素
该次调查研究主要针对高海拔地区，秦毅等[1]通过青藏高原疾病流行分析，发现青海地区肺结核的发病率从2002−2018年持续上升，至2018年全省结核病发病率为全国平均水平的2.3倍。肺结核发病率高考虑与藏区自然条件艰苦，医疗条件、经济水平落后，群众防疫宣传教育普及率低，人民防病意识较差，人群总体疫苗接种率较低等因素相关。青藏高原地广人稀，近年来，随着交通状况改善，群众社会交往增多，但该地区海拔高，低气温时间长，春、秋、冬季社会活动多聚集于室内，温暖的室内环境导致结核菌更易通过飞沫传播。该疾病在临床上具有致死率高、传染力强、致病性高、病程长等特点，且易反复发作、难治愈[11]。高海拔地区肺结核治愈率仅有58.3%，仅达到平原地区治愈率的60%[1]，且极其容易发生二重感染，尤其以合并念珠菌感染为主。高海拔肺结核合并念珠菌感染的原因主要包括：①肺结核患者处于慢性炎症状态，结核杆菌导致呼吸道黏膜损伤，长期服用抗结核药抑制正常菌群，故会引起菌群紊乱，条件致病菌生长，且高海拔地区慢性支气管炎、肺心病高发，并发症较多，使用广谱抗菌药，更易导致肺部念珠菌感染。肺结核合并咯血等重症患者，临床惯用糖皮质激素治疗，该类药物可以抑制中性粒细胞及巨噬细胞吞噬念珠菌孢子的能力，对免疫过程中的诸多环节有抑制作用，进而引发肺部念珠菌感染[10]。②高海拔地区基础医疗薄弱，患者用药依从性差，而肺部念珠菌感染症状隐匿，患者出现症状反复后才转入本院，导致延迟治疗，错失最佳治疗时机，治疗难度增大，病情控制差，且病情危重，更易导致念珠菌感染，严重影响患者治疗及预后。③该研究资料分析结果显示，肺结核合并念珠菌感染发生率约为9.40%，而相关文献报道发生率为3.95 %[12]，考虑肺结核患者机体状况差，能量消耗增加，免疫力低，高海拔地区长期缺氧，气候干冷，天气变化剧烈，温差幅度大，容易快速削弱机体抵抗力，导致习服衰变[13]，器官功能进一步损伤，口咽部白念珠菌通过被破坏的呼吸道黏膜下行至肺部，产生较多的细胞外酶，损害机体细胞，导致念珠菌感染率高。
3.3 青藏高原肺结核合并念珠菌感染的耐药性分析
在肺结核合并念珠菌感染的283例患者中，共检出6种念珠菌，其中白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌3种主要的念珠菌检出271例，占病原体分离株的95.76%，与孟笑等[14]报道一致，符合国内大多数医院病原菌感染特征，但感染率相对偏高，其中，白念珠菌226株，占79.86%，光滑念珠菌35株，占12.37%，热带念珠菌10株，占3.53%。肺结核合并念珠菌感染的主要致病菌为白念珠菌，与张海燕等[15]、黄国军等[16]和程玲[17]报道一致，其他两种致病菌为光滑念珠菌、热带念珠菌。上述念珠菌耐药性实验结果显示，白念珠菌对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑的耐药率为70%以上；光滑念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑的耐药率可达60%以上；克柔念珠菌对氟康唑固有耐药，对伏立康唑、伊曲康唑耐药率为40%以上；氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑为治疗肺部真菌感染的常用药物，抗菌谱广，临床使用广泛，患者反复长期使用，且药物半衰期长，可能是导致这几种药物耐药率高的原因，且存在交叉耐药的情况。两性霉素B、氟胞嘧啶等药物耐药率低，虽然抗真菌效果相对较好，但对肝肾功能影响较大，两性霉素B会导致高热、寒颤、恶心呕吐等不良反应，氟胞嘧啶治疗周期长，使用剂量较大，且需要与其他药物联合使用，不是临床治疗念珠菌感染的一线用药[18-19]，但可以作为在唑类或棘白菌素不能使用时的治疗方案。棘白菌素对大多数念珠菌具有高度活性，且棘白菌素在本院使用量较少，考虑为棘白菌素类无耐药菌株产生的可能因素。
综上所述，抗念珠菌药物的选择需根据本地药敏结果和结核患者实际情况进行综合分析，得出更适合患者的有效治疗方案，从根源上使青藏高原地区肺结核合并念珠菌感染的发病率得到遏制。
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图 1 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞增殖、骨形成相关蛋白以及ALP活性的影响（n=6）
*P<0.05，**P<0.01与模型组比较，##P<0.01与空白组比较。
图 2 巴戟天丸组方对Aβ1-42寡聚体损伤成骨细胞抗氧化能力的影响（n=4）
*P<0.05，**P<0.01与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01与空白组比较。
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