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肝脏作为人体物质能量最重要的代谢枢纽,承担了体内糖、蛋白质、脂肪、维生素、激素等大部分物质的代谢过程与生物转化作用[1-3]。目前,肝脏疾病的筛查和早期诊断主要依靠两类检查手段:影像学检查和肝脏肿瘤标志物检测[4]。CT等影像学检测手段在分辨率和准确性上不具优势,而现有的肿瘤标志物主要是基于基因水平和蛋白水平发现的,无法满足肝脏疾病的早期诊断筛查所需的特异度和敏感度。因此,寻找高敏感性、高特异性、非侵入性的肝脏疾病诊断标志物是一项紧迫且具有挑战性的任务。
目前,从系统和综合的观念出发探索生命现象的本质规律日益成为生命科学研究的主流。代谢组学的研究,一般包括样品的采集及制备、样品的检测、代谢物数据的预处理、多变量统计分析和代谢途径分析等步骤。代谢组学作为系统生物学的重要组成部分,可以利用临床上较容易取得的体液样本,比如血浆、尿液或唾液等,分析其中的代谢物来反应不同生理或病理状态[5],已广泛应用于生理评价、疾病诊断和预后等领域[6-7],代谢组学分析也可应用于发现新的代谢调控机制和发现新的代谢通路。代谢组学的研究对象为相对分子质量<1000道尔顿的代谢小分子,通过同时定量测定和定性分析这些小分子代谢物,监测特定代谢物的动态规律变化,还原相关联生物事件,提示生物体的病理生理变化实质和机制所在,最终为疾病的早期诊断提供重要信息[8]。
液质联用技术因色谱选择性好、分辨率与灵敏度高等优点,已广泛应用于疾病相关生物标志物代谢组学研究中,然而受代谢物识别、数据挖掘和生物标志物鉴定等因素的影响,有关肝脏疾病相关代谢途径及整体代谢产物的全面定性定量分析仍然不足[9]。基于LC-MS/MS检测技术的中心碳代谢分析方法,可用于体内215种内源性中心碳代谢物的分析,首先使用LC-QQQ-MS采集数据,然后使用MH Quant对采集的数据与数据库进行匹配和定量分析,之后把定量数据导入MPP进行差异分析和路径分析,与常规液质联用方法相比,更为简单、灵敏、稳健,极大的简化了数据分析步骤,大大节省了生物标志物的鉴别时间。因此,本研究纳入胆管囊肿、胆道结石、肝癌、肝门部胆管癌和健康志愿者样本,采用UPLC-MS/MS检测技术结合中心碳代谢物小分子数据库筛查方法及多元统计分析筛选肝胆系统疾病显著改变的生物标志物及代谢通路,尝试揭示肝胆系统病变的可能致病机制。
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剔除年龄性别及其他影响代谢的慢性疾病等混杂因素对研究结果的影响,最终共收集169份血浆样本,包含23名胆管囊肿患者,19名胆道结石患者,45名肝癌患者,50名肝门部胆管癌患者,以及32名健康志愿者纳入本次靶向代谢组学分析研究,各组样本群体之间不存在任何人口统计和基线特征的显著差异(包括年龄、性别、体质量指数、有无糖尿病等),从而排除了人口统计和基线特征差异相关混杂因素对实验结果的影响。
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为了探索肝脏病变改变的代谢物群,对UPLC-QQQ-MS采集经MPP软件处理后所得数据进行多元统计分析。首先,对不同分组方式,包括:①正常组、胆管囊肿、胆道结石、肝癌、肝门部胆管癌;②正常组、肝脏良性病变(胆管囊肿&胆道结石)、肝脏恶性肿瘤(肝癌&肝门部胆管癌);③正常组、肝脏良性病变(胆管囊肿&胆道结石)、肝癌;④正常组、肝脏良性病变(胆管囊肿&胆道结石)、肝门部胆管癌的数据分别采用非监督的主成分分析(PCA)来探讨各组之间的代谢组差异及其相关性。如图1所示,在PCA的三维得分图中可以看到:组与组之间存在明显的分离趋势,另外,PCA得分图中QC样品的分布集中,表明本研究采用的方法稳定性和重现性良好,分析获得的数据可信。
进一步采用200次置换检验的方法对模型进行验证,置换检验的原理即验证初始模型是否与置换检验的模型过拟合,如图1所示,所有分组数据经置换后的R2(cum)和Q2(cum)值(左侧)均要小于初始值(右侧),且Q2(cum)的回归线(蓝色)截距为负值,上述结果表明模型未过拟合,不同分组方式所构建的偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)分类模型稳健性好,表明具有很好的预测能力及可靠性。
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代谢物被确认为潜在生物标志物之前需要经过仔细的筛选。首先根据S-plot筛选有显著差异的代谢变量,整个过程基于协方差相关性原理执行,从而减少了代谢物筛选过程中出现假阳性的概率。如图1所示,S-plot主要来自预测模型中的第一主成分,而第一主成分几乎涵盖了分析数据的大部分变量,在S-plot图上偏离原始点越远的变量对组间的分离趋势贡献越大,这些变量被认为可能是潜在的生物标志物;其次,变量重要性投影(VIP)反映了变量的重要性,在这里被用来过滤模型中的重要代谢变量,通常认为VIP 大于 1 的变量可能是潜在的生物标志物,进一步对多元统计分析筛选得到的差异代谢物采用单因素方差分析做单元统计分析,P值小于 0.05 的变量被认为差异有统计学意义。基于以上标准,共筛选到15个胆管囊肿显著相关的潜在生物标志物,包括肌醇、L-山梨糖、D-甘露糖、牛磺酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、2-甲基-1-丁醇、丙酮酸、丙二酸、顺式乌头酸和反式乌头酸;7个胆道结石显著相关的潜在生物标志物,包括肌醇、L-苏氨酸、L-谷氨酸、丙二酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、顺式乌头酸和反式乌头酸;7个肝癌显著相关的潜在生物标志物,包括肌醇、L-天冬氨酸、2-甲基-1-丁醇、丙酮酸、α-酮戊二酸、顺式乌头酸和反式乌头酸和3个肝门部胆管癌显著相关的潜在生物标志物,包括肌醇、L-山梨糖和D-甘露糖,具体结果及其变化趋势见表1。
表 1 鉴别的潜在生物标志物
序号 组分 VIP p 值 Trend1 Trend2 Trend3 Trend4 Trend5 Trend6 Trend7 Trend8 1 肌醇 5.52 0.00 ↓* ↑** ↑* ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 2 L-山梨酸 2.04 0.00 ↓*** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↑ 3 D-甘露醇 1.03 0.00 ↓** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 4 牛磺酸 1.66 0.00 ↓* ↓ ↓ ↑ ↑ ↑*** ↑ ↑* 5 L-苏氨酸 1.69 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 6 L-谷氨酸 2.88 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 7 L-苯丙氨酸 2.32 0.00 ↓*** ↓ ↓ ↑ ↑** ↑*** ↑ ↑*** 8 L-天冬氨酸 1.59 0.00 ↓* ↓ ↓*** ↑ ↑ ↑** ↑ ↑* 9 尿酸 3.77 0.76 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 10 半乳糖酸 1.08 0.38 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ 11 D-葡萄糖酸 1.90 0.19 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↓ ↓ 12 乳酸 4.53 0.00 ↓*** ↓ ↑ ↓ ↑*** ↑*** ↑ ↓ 13 L-色氨酸 1.09 0.06 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑** ↑ ↑ 14 α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐 1.04 0.00 ↑*** ↑*** ↑ ↑ ↓*** ↓*** ↓** ↓*** 15 2-甲基-1-丁醇 2.84 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 16 丙酮酸 2.86 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 17 2-丁酮酸 1.26 0.13 ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓ ↑ ↓ 18 丙二酸 2.37 0.00 ↓*** ↓*** ↓*** ↓ ↑ ↑*** ↑ ↑*** 19 琥珀酸 2.41 0.24 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ 20 α-酮戊二酸 1.96 0.04 ↓ ↑ ↑* ↑ ↑** ↑ ↑ ↑ 21 戊酮酸 1.05 0.66 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 22 DL-异柠檬酸 4.35 0.13 ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↑ 23 顺式-乌头酸 2.87 0.00 ↑* ↑** ↑ ↓ ↓ ↓*** ↓ ↓*** 24 反式-乌头酸 4.60 0.00 ↑** ↑*** ↑** ↑ ↓ ↓* ↓ ↓** 25 4-吡哆酸 1.01 0.40 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ 26 水杨酸 1.07 0.43 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ 注:Trend1:胆管囊肿 vs 健康对照;Trend2:胆道结石 vs 健康对照;Trend3:肝癌 vs 健康对照;Trend4:肝门部胆管癌 vs 健康对照;Trend5:肝癌 vs 胆管囊肿;Trend6:肝门部胆管癌 vs 胆管囊肿;Trend7:肝癌 vs 胆道结石;Trend8:肝门部胆管癌 vs 胆道结石;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001
Serum metabolomics study on benign liver lesions and hepatic malignancies by central carbon pathway metabolites
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摘要:
目的 采用超高效液相色谱三重四级杆质谱技术(UPLC-QQQ-MS)对肝胆疾病患者血浆样本内源性中心碳代谢相关化学成分进行分析,寻找肝胆系统病变的可能特征代谢物及显著改变的代谢通路。 方法 招募健康志愿者32人、胆管囊肿患者23人、胆道结石患者19人、肝癌患者45人及肝门部胆管癌患者50人,采集血浆样本,进行UPLC-QQQ-MS分析,采用MPP软件进行统计分析,结合模式识别分析各组间代谢组差异,研究肝胆疾病显著改变代谢通路及可能致病机制。 结果 代谢组学分析得到胆管囊肿患者15个、胆道结石患者7个、肝癌患者7个和肝门部胆管癌患者3个与健康人血浆中存在显著性差异的可能生物标志物,并分别富集胆管囊肿患者8条、胆道结石患者4条、肝癌4条和肝门部胆管癌患者1条在体内显著改变的代谢通路。 结论 根据上述鉴别的差异代谢物和富集的代谢通路结果,表明肝脏病变主要影响了机体的能量代谢及氨基酸的代谢与运输,而磷酸肌醇代谢在胆管囊肿、胆道结石、肝癌和肝门部胆管癌中均显著改变。 Abstract:Objective To screen potential metabolites and significantly altered metabolic pathways of liver lesions by central carbon pathway metabolites. Methods 32 healthy volunteers (HC), 23 patients with biliary cysts (CYST), 19 patients with biliary stones (Stone), 45 patients with hepatocellular carcinoma (HCC), and 50 patients with hilarcholangiocarcinoma (HCCA) were recruited. Their serum samples were collected for UPLC-QQQ-MS analysis and further MPP statistical analysis. Pattern recognition was further used to discovery the differences in metabolome between groups, and to explore the significantly altered metabolic pathway and possible pathogenic mechanism of liver diseases. Results A total of 15, 7, 7, and 3 metabolites and a total of 8, 4, 4, and 1 metabolic pathway that were significantly different in serum between CYST, Stone, HCC, HCCA and healthy controls were identified and enriched through serum metabolomics analysis, respectively. Conclusion According to the above identified differential metabolites and enriched metabolic pathway results, it is shown that liver lesions mainly involved in the energy metabolism and amino acid metabolism & transport, in addition, inositol phosphate metabolism were significantly changed both in CYST, Stone, HCC and HCCA. -
Key words:
- UPLC-QQQ-MS /
- metabolic target analysis /
- biliary cyst /
- liver cancer /
- hilar cholangiocarcinoma
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表 1 鉴别的潜在生物标志物
序号 组分 VIP p 值 Trend1 Trend2 Trend3 Trend4 Trend5 Trend6 Trend7 Trend8 1 肌醇 5.52 0.00 ↓* ↑** ↑* ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 2 L-山梨酸 2.04 0.00 ↓*** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↑ 3 D-甘露醇 1.03 0.00 ↓** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 4 牛磺酸 1.66 0.00 ↓* ↓ ↓ ↑ ↑ ↑*** ↑ ↑* 5 L-苏氨酸 1.69 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 6 L-谷氨酸 2.88 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 7 L-苯丙氨酸 2.32 0.00 ↓*** ↓ ↓ ↑ ↑** ↑*** ↑ ↑*** 8 L-天冬氨酸 1.59 0.00 ↓* ↓ ↓*** ↑ ↑ ↑** ↑ ↑* 9 尿酸 3.77 0.76 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 10 半乳糖酸 1.08 0.38 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ 11 D-葡萄糖酸 1.90 0.19 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↓ ↓ 12 乳酸 4.53 0.00 ↓*** ↓ ↑ ↓ ↑*** ↑*** ↑ ↓ 13 L-色氨酸 1.09 0.06 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑** ↑ ↑ 14 α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐 1.04 0.00 ↑*** ↑*** ↑ ↑ ↓*** ↓*** ↓** ↓*** 15 2-甲基-1-丁醇 2.84 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 16 丙酮酸 2.86 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 17 2-丁酮酸 1.26 0.13 ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓ ↑ ↓ 18 丙二酸 2.37 0.00 ↓*** ↓*** ↓*** ↓ ↑ ↑*** ↑ ↑*** 19 琥珀酸 2.41 0.24 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ 20 α-酮戊二酸 1.96 0.04 ↓ ↑ ↑* ↑ ↑** ↑ ↑ ↑ 21 戊酮酸 1.05 0.66 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 22 DL-异柠檬酸 4.35 0.13 ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↑ 23 顺式-乌头酸 2.87 0.00 ↑* ↑** ↑ ↓ ↓ ↓*** ↓ ↓*** 24 反式-乌头酸 4.60 0.00 ↑** ↑*** ↑** ↑ ↓ ↓* ↓ ↓** 25 4-吡哆酸 1.01 0.40 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ 26 水杨酸 1.07 0.43 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ 注:Trend1:胆管囊肿 vs 健康对照;Trend2:胆道结石 vs 健康对照;Trend3:肝癌 vs 健康对照;Trend4:肝门部胆管癌 vs 健康对照;Trend5:肝癌 vs 胆管囊肿;Trend6:肝门部胆管癌 vs 胆管囊肿;Trend7:肝癌 vs 胆道结石;Trend8:肝门部胆管癌 vs 胆道结石;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 -
[1] 胡聪, 吴琳静, 熊印华, 等. 脂质组学在肝脏疾病中的研究进展[J]. 中国药理学通报, 2021, 37(1):6-12. doi: 10.3969/j.issn.1001-1978.2021.01.002 [2] 文露, 彭芳. 肝病患者粪便上清代谢组学研究及肠道菌群对代谢的影响[J]. 医学综述, 2017,23(6): 5. [3] 罗小芳, 茹清静. 代谢组学在肝脏疾病研究中的应用[J]. 云南中医学院学报, 2015, 38(5):97-100. doi: 10.19288/j.cnki.issn.1000-2723.2015.05.025 [4] 柏兆方, 董方, 柴煊,等. 肝癌血清学早期筛查与诊断标志物研究进展[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2016, 25(5):589-593. [5] 王淑凤. 基于LC-MS/MS技术的肝细胞癌患者血清代谢组学研究[D]. 北京:军事科学院, 2021. DOI: 10.27193/d.cnki.gjsky.2021.000071. [6] 厉颖, 李灿委, 范孟然,等. 酒精性肝病的代谢组学研究进展[J]. 实用医学杂志, 2021, 37(7):944-947. [7] 魏艳平, 李艳灵, 夏梦瑶, 等. 代谢组学在乳腺癌生物标志物中的应用进展[J]. 药物分析杂志, 2022, 42(6): 988-999. [8] ZAMPIERI M, SEKAR K, ZAMBONI N, et al. Frontiers of high-throughput metabolomics[J]. Curr Opin Chem Biol, 2017, 36: 15-23. [9] 李胜男, 原永芳. 代谢组学技术在肝毒性生物标志物筛选中的应用[J]. 医学综述, 2017, 23(11):2131-2134, 2139. [10] ZHOU J B, MIN Z H, ZHANG D, et al. Enhanced frequency and potential mechanism of B regulatory cells in patients with lung cancer[J]. J Transl Med, 2014, 12: 304.