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肝脏作为人体物质能量最重要的代谢枢纽，承担了体内糖、蛋白质、脂肪、维生素、激素等大部分物质的代谢过程与生物转化作用[1-3]。目前，肝脏疾病的筛查和早期诊断主要依靠两类检查手段：影像学检查和肝脏肿瘤标志物检测[4]。CT等影像学检测手段在分辨率和准确性上不具优势，而现有的肿瘤标志物主要是基于基因水平和蛋白水平发现的，无法满足肝脏疾病的早期诊断筛查所需的特异度和敏感度。因此，寻找高敏感性、高特异性、非侵入性的肝脏疾病诊断标志物是一项紧迫且具有挑战性的任务。
目前，从系统和综合的观念出发探索生命现象的本质规律日益成为生命科学研究的主流。代谢组学的研究，一般包括样品的采集及制备、样品的检测、代谢物数据的预处理、多变量统计分析和代谢途径分析等步骤。代谢组学作为系统生物学的重要组成部分，可以利用临床上较容易取得的体液样本，比如血浆、尿液或唾液等，分析其中的代谢物来反应不同生理或病理状态[5]，已广泛应用于生理评价、疾病诊断和预后等领域[6-7]，代谢组学分析也可应用于发现新的代谢调控机制和发现新的代谢通路。代谢组学的研究对象为相对分子质量<1000道尔顿的代谢小分子，通过同时定量测定和定性分析这些小分子代谢物，监测特定代谢物的动态规律变化，还原相关联生物事件，提示生物体的病理生理变化实质和机制所在，最终为疾病的早期诊断提供重要信息[8]。
液质联用技术因色谱选择性好、分辨率与灵敏度高等优点，已广泛应用于疾病相关生物标志物代谢组学研究中，然而受代谢物识别、数据挖掘和生物标志物鉴定等因素的影响，有关肝脏疾病相关代谢途径及整体代谢产物的全面定性定量分析仍然不足[9]。基于LC-MS/MS检测技术的中心碳代谢分析方法，可用于体内215种内源性中心碳代谢物的分析，首先使用LC-QQQ-MS采集数据，然后使用MH Quant对采集的数据与数据库进行匹配和定量分析，之后把定量数据导入MPP进行差异分析和路径分析，与常规液质联用方法相比，更为简单、灵敏、稳健，极大的简化了数据分析步骤，大大节省了生物标志物的鉴别时间。因此，本研究纳入胆管囊肿、胆道结石、肝癌、肝门部胆管癌和健康志愿者样本，采用UPLC-MS/MS检测技术结合中心碳代谢物小分子数据库筛查方法及多元统计分析筛选肝胆系统疾病显著改变的生物标志物及代谢通路，尝试揭示肝胆系统病变的可能致病机制。
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Agilent 1260高效液相色谱仪，包括在线脱气机，二元泵，自动进样器，柱温箱；Agilent 6410三重四级杆质谱仪，配有电喷雾离子源（Agilent，美国）；Mass Hunter B4.0色谱工作站（Agilent，美国）；Micro17R低温离心机（Thermo，美国）；Vortex 6型涡旋混合器（其林贝尔，海门）；Arium mini超纯水机（Sartorius，美国）。
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甲醇、乙腈为色谱纯（Honeywell，美国），甲酸为色谱纯（SIGMA，美国），三丁胺为色谱纯（GC，纯度≥99%），冰醋酸为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。
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海军军医大学附属东方肝胆外科医院伦理委员会审核并通过了本研究的样品收集方案及流程。所有招募患者都签署了知情同意书并表示愿意参与本研究[10]。采集志愿者静脉血5 ml，置抗凝（EDTA）管中，在4 ˚C下3000 g离心10 min，取上清置样本管，储存于−80 ˚C冰箱中待用，避免在分析前经历两次以上的冻融循环。
从−80˚C冰箱取出样品，室温解冻，取50 μl，分别加入150 μl的乙腈用于沉淀蛋白，涡旋1 min后，在4˚C下12000 g离心10 min，吸取100 μl上清液转移至进样小瓶，进样分析。质量控制（QC）样品则通过合并等量不同血清样品制备得到。
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色谱分离采用Extend C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm，Agilent），柱温35 ℃。流动相A为97%水+3%甲醇溶液含10 mmol/L TBA和15 mmol/L冰醋酸，流动相B为甲醇溶液含10 mmol/L TBA和15 mmol/L冰醋酸，采用梯度洗脱，洗脱程序：0~2.5 min，0% B；2.5~7.5 min，0%~20% B；7.5~13 min，20%~45% B；13~20 min，45%~99% B；20~24 min，99% B；流速为250 μl/min，进样量为2 μl。
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离子源为AJSESI，离子源参数设置：干燥气温度 150 ℃；干燥气流速13 L/min；雾化器压力 45 psi；鞘气温度 325 ℃；鞘气流速 12 L/min；毛细管电压2 000 V，喷嘴电压 500 V，负离子模式下采用动态多反应离子检测（dMRM）模式扫描。
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本实验首先通过MH Quant方法对UPLC-QQQ-MS采集的原始数据与数据库中所有化合物进行匹配和定量分析，其次将定量分析得到的数据导入MPP（Mass Profiler Professional）软件进行统计分析，之后将MPP处理得到的192个差异代谢物组成的矩阵导入SIMCA-P 11.0（Umetrics，Sweden）进行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）。通过交叉验证参数Q2Y和R2Y对所构建的模型质量进行评判。应用单因素方差分析（one-way ANOVA）对有显著性差异的变量在健康对照组、胆管囊肿组、胆道结石组、肝癌组和肝门部胆管癌组中的平均含量进行分析，并进行多组间的两两比较。当变量满足P值小于0.05且VIP（OPLS-DA多维分析得到的代谢物重要性参数）大于1，认为其为潜在的生物标志物。为了进一步揭示肝脏良性病变与肝脏恶性肿瘤显著改变的代谢通路，将上述鉴别得到的差异代谢小分子及其相对含量导入MetaboAnalyst平台（
http://www.metaboanalyst.ca ），应用MetPA（http://metpa.metabolomics.ca./ ）进行具有先验经验的智能通路分析。 -
剔除年龄性别及其他影响代谢的慢性疾病等混杂因素对研究结果的影响，最终共收集169份血浆样本，包含23名胆管囊肿患者，19名胆道结石患者，45名肝癌患者，50名肝门部胆管癌患者，以及32名健康志愿者纳入本次靶向代谢组学分析研究，各组样本群体之间不存在任何人口统计和基线特征的显著差异（包括年龄、性别、体质量指数、有无糖尿病等），从而排除了人口统计和基线特征差异相关混杂因素对实验结果的影响。
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为了探索肝脏病变改变的代谢物群，对UPLC-QQQ-MS采集经MPP软件处理后所得数据进行多元统计分析。首先，对不同分组方式，包括：①正常组、胆管囊肿、胆道结石、肝癌、肝门部胆管癌；②正常组、肝脏良性病变（胆管囊肿&胆道结石）、肝脏恶性肿瘤（肝癌&肝门部胆管癌）；③正常组、肝脏良性病变（胆管囊肿&胆道结石）、肝癌；④正常组、肝脏良性病变（胆管囊肿&胆道结石）、肝门部胆管癌的数据分别采用非监督的主成分分析（PCA）来探讨各组之间的代谢组差异及其相关性。如图1所示，在PCA的三维得分图中可以看到：组与组之间存在明显的分离趋势，另外，PCA得分图中QC样品的分布集中，表明本研究采用的方法稳定性和重现性良好，分析获得的数据可信。
图 1 基于UPLC-QQQ-MS的PCA得分图、相应的交叉验证图及S-plot图
进一步采用200次置换检验的方法对模型进行验证，置换检验的原理即验证初始模型是否与置换检验的模型过拟合，如图1所示，所有分组数据经置换后的R2（cum）和Q2（cum）值（左侧）均要小于初始值（右侧），且Q2（cum）的回归线（蓝色）截距为负值，上述结果表明模型未过拟合，不同分组方式所构建的偏最小二乘法-判别分析（PLS-DA）分类模型稳健性好，表明具有很好的预测能力及可靠性。
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代谢物被确认为潜在生物标志物之前需要经过仔细的筛选。首先根据S-plot筛选有显著差异的代谢变量，整个过程基于协方差相关性原理执行，从而减少了代谢物筛选过程中出现假阳性的概率。如图1所示，S-plot主要来自预测模型中的第一主成分，而第一主成分几乎涵盖了分析数据的大部分变量，在S-plot图上偏离原始点越远的变量对组间的分离趋势贡献越大，这些变量被认为可能是潜在的生物标志物；其次，变量重要性投影（VIP）反映了变量的重要性，在这里被用来过滤模型中的重要代谢变量，通常认为VIP 大于 1 的变量可能是潜在的生物标志物，进一步对多元统计分析筛选得到的差异代谢物采用单因素方差分析做单元统计分析，P值小于 0.05 的变量被认为差异有统计学意义。基于以上标准，共筛选到15个胆管囊肿显著相关的潜在生物标志物，包括肌醇、L-山梨糖、D-甘露糖、牛磺酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸、乳酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、2-甲基-1-丁醇、丙酮酸、丙二酸、顺式乌头酸和反式乌头酸；7个胆道结石显著相关的潜在生物标志物，包括肌醇、L-苏氨酸、L-谷氨酸、丙二酸、α-D-葡萄糖-1-磷酸、顺式乌头酸和反式乌头酸；7个肝癌显著相关的潜在生物标志物，包括肌醇、L-天冬氨酸、2-甲基-1-丁醇、丙酮酸、α-酮戊二酸、顺式乌头酸和反式乌头酸和3个肝门部胆管癌显著相关的潜在生物标志物，包括肌醇、L-山梨糖和D-甘露糖，具体结果及其变化趋势见表1。
表 1 鉴别的潜在生物标志物
序号 组分 VIP p 值 Trend1 Trend2 Trend3 Trend4 Trend5 Trend6 Trend7 Trend8 1 肌醇 5.52 0.00 ↓* ↑** ↑* ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 2 L-山梨酸 2.04 0.00 ↓*** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↑ 3 D-甘露醇 1.03 0.00 ↓** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 4 牛磺酸 1.66 0.00 ↓* ↓ ↓ ↑ ↑ ↑*** ↑ ↑* 5 L-苏氨酸 1.69 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 6 L-谷氨酸 2.88 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 7 L-苯丙氨酸 2.32 0.00 ↓*** ↓ ↓ ↑ ↑** ↑*** ↑ ↑*** 8 L-天冬氨酸 1.59 0.00 ↓* ↓ ↓*** ↑ ↑ ↑** ↑ ↑* 9 尿酸 3.77 0.76 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 10 半乳糖酸 1.08 0.38 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ 11 D-葡萄糖酸 1.90 0.19 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↓ ↓ 12 乳酸 4.53 0.00 ↓*** ↓ ↑ ↓ ↑*** ↑*** ↑ ↓ 13 L-色氨酸 1.09 0.06 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑** ↑ ↑ 14 α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐 1.04 0.00 ↑*** ↑*** ↑ ↑ ↓*** ↓*** ↓** ↓*** 15 2-甲基-1-丁醇 2.84 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 16 丙酮酸 2.86 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 17 2-丁酮酸 1.26 0.13 ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓ ↑ ↓ 18 丙二酸 2.37 0.00 ↓*** ↓*** ↓*** ↓ ↑ ↑*** ↑ ↑*** 19 琥珀酸 2.41 0.24 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ 20 α-酮戊二酸 1.96 0.04 ↓ ↑ ↑* ↑ ↑** ↑ ↑ ↑ 21 戊酮酸 1.05 0.66 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 22 DL-异柠檬酸 4.35 0.13 ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↑ 23 顺式-乌头酸 2.87 0.00 ↑* ↑** ↑ ↓ ↓ ↓*** ↓ ↓*** 24 反式-乌头酸 4.60 0.00 ↑** ↑*** ↑** ↑ ↓ ↓* ↓ ↓** 25 4-吡哆酸 1.01 0.40 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ 26 水杨酸 1.07 0.43 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ 注：Trend1：胆管囊肿 vs 健康对照；Trend2：胆道结石 vs 健康对照；Trend3：肝癌 vs 健康对照；Trend4：肝门部胆管癌 vs 健康对照；Trend5：肝癌 vs 胆管囊肿；Trend6：肝门部胆管癌 vs 胆管囊肿；Trend7：肝癌 vs 胆道结石；Trend8：肝门部胆管癌 vs 胆道结石；*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001 -
代谢组学研究的目的不仅是找到肝脏病变导致的机体代谢组改变，更希望发现肝脏病变后显著改变的代谢通路，这些显著改变的代谢通路对于揭示肝脏病变的可能致病机制非常重要，因此，本研究通过MetPA平台的智能通路分析表征肝脏良性病变与肝脏恶性肿瘤显著改变的代谢通路，既而进一步探讨肝脏病变的可能致病机制。通过考察代谢通路所处的节点位置重要性作为代谢通路显著性评价指标，在代谢通路拓扑分析中，设置代谢通路的重要值大于 0.10时，可被认为是潜在的靶标代谢通路。图2中所有代谢通路都以圆点表示，结合 P 值及重要性，圆点越大颜色越深表明其在代谢网络中所处的节点位置越重要。结果表明胆管囊肿显著改变了8条代谢通路，结果如图2A所示，具体包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（Alanine, aspartate and glutamate metabolism），牛磺酸和次牛磺酸代谢（Taurine and hypotaurine metabolism），丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism），三羧酸循环(TCA cycle)，苯丙氨酸代谢（Phenylalanine metabolism），谷氨酰胺和谷氨酸代谢（D-Glutamine and D-glutamate metabolism），磷酸肌醇代谢（Inositol phosphate metabolism）以及淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）；胆道结石显著改变了4条代谢通路，结果如图2B所示，具体包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，谷氨酰胺和谷氨酸代谢，磷酸肌醇代谢以及淀粉和蔗糖代谢；肝癌显著改变了4条代谢通路，结果如图2C所示,具体包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢，丙酮酸代谢（Pyruvate metabolism），三羧酸循环 (TCA cycle)和磷酸肌醇代谢；肝门部胆管癌显著改变了1条代谢通路：磷酸肌醇代谢，结果如图2D所示。上述代谢通路富集分析结果提示肝脏病变显著改变了机体的能量转换、物质转化、氨基酸的代谢和转运，说明这些代谢在肝脏系统疾病中具有重要的调节作用。后续可进一步分析差异蛋白，探究具体涉及的信号通路，深入探讨这些通路在肝胆系统疾病发病机制中的作用。
图 2 IPA分析方法得到的肝脏病变相关重要代谢通路
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肝门部胆管癌因发病隐匿，易被误诊为胆道结石、胆管囊肿等，且其预后极差。如果能够在肝癌早期就及时发现并及时治疗，将会大大提高肝门部胆管癌患者的生存期及生存质量。肝癌的术前诊断主要依靠CT、超声或MRI等影像学检查。CT等影像学检测手段在分辨率和准确性上不具优势，无法满足该疾病早期诊断筛查所需的特异度和敏感度。因此，寻找高敏感性、高特异性、非侵入性的生物标志物具有重要的临床诊断意义。本研究认为与肝脏疾病进程相关的潜在生物标志物的含量变化应该呈现规律的上调或下调，基于这一原则筛选到的差异代谢物对于肝癌的早期诊断和筛查具有更重要的意义。如图3所示，胆管囊肿患者、肝门部胆管癌患者与健康志愿者相比，天冬氨酸和丙二酸含量均呈明显下调趋势，而反式乌头酸含量均呈明显上调趋势，而肝癌以胆管囊肿为比较时，未找到规律上调或下调的差异代谢物, 具体如图3A；胆道结石患者、肝癌患者与健康志愿者相比，丙二酸含量均呈明显下调趋势，而肌醇和反式乌头酸含量均呈明显上调趋势, 具体如图3B；胆道结石患者、肝门部胆管癌患者与健康志愿者相比，肌醇含量均呈现明显上调趋势, 具体如图3C。综上，虽然研究发现了在肝脏系统疾病进程中具有相同变化趋势的差异代谢物，然而这些差异代谢物在肝脏系统疾病患者体内的平均水平并没有显著差异，可能原因是样本量还不够大，个体间的差异掩盖了组间的差异，然而具体真实的原因还有待后续进一步研究探索。
图 3 潜在生物标志物在健康对照组、胆管囊肿、胆道结石、肝癌和肝门部胆管癌患者中平均含量比较
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本研究运用UPLC-QQQ-MS技术结合DMRM数据库及化学计量学方法进行了胆管囊肿、胆道结石、肝癌、肝门部胆管癌患者和健康志愿者血清的代谢组学研究，分别鉴定出15个、7个、7个和3个在胆管囊肿患者、胆道结石患者、肝癌患者和肝门部胆管癌患者与健康人血清中存在显著性差异的潜在生物标志物，并根据这些显著性差异的代谢物分别富集到8条、4条、4条、1条在胆管囊肿患者、胆道结石患者、肝癌和肝门部胆管癌患者体内显著改变的代谢通路。根据上述鉴别的差异代谢物和富集的代谢通路结果，表明肝脏病变主要影响了机体的能量代谢及氨基酸的代谢与转运，而磷酸肌醇代谢在胆管囊肿、胆道结石、肝癌、肝门部胆管癌中均显著改变。
Serum metabolomics study on benign liver lesions and hepatic malignancies by central carbon pathway metabolites
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摘要:
目的 采用超高效液相色谱三重四级杆质谱技术（UPLC-QQQ-MS）对肝胆疾病患者血浆样本内源性中心碳代谢相关化学成分进行分析，寻找肝胆系统病变的可能特征代谢物及显著改变的代谢通路。 方法 招募健康志愿者32人、胆管囊肿患者23人、胆道结石患者19人、肝癌患者45人及肝门部胆管癌患者50人，采集血浆样本，进行UPLC-QQQ-MS分析，采用MPP软件进行统计分析，结合模式识别分析各组间代谢组差异，研究肝胆疾病显著改变代谢通路及可能致病机制。 结果 代谢组学分析得到胆管囊肿患者15个、胆道结石患者7个、肝癌患者7个和肝门部胆管癌患者3个与健康人血浆中存在显著性差异的可能生物标志物，并分别富集胆管囊肿患者8条、胆道结石患者4条、肝癌4条和肝门部胆管癌患者1条在体内显著改变的代谢通路。 结论 根据上述鉴别的差异代谢物和富集的代谢通路结果，表明肝脏病变主要影响了机体的能量代谢及氨基酸的代谢与运输，而磷酸肌醇代谢在胆管囊肿、胆道结石、肝癌和肝门部胆管癌中均显著改变。 Abstract:Objective To screen potential metabolites and significantly altered metabolic pathways of liver lesions by central carbon pathway metabolites. Methods 32 healthy volunteers (HC), 23 patients with biliary cysts (CYST), 19 patients with biliary stones (Stone), 45 patients with hepatocellular carcinoma (HCC), and 50 patients with hilarcholangiocarcinoma (HCCA) were recruited. Their serum samples were collected for UPLC-QQQ-MS analysis and further MPP statistical analysis. Pattern recognition was further used to discovery the differences in metabolome between groups, and to explore the significantly altered metabolic pathway and possible pathogenic mechanism of liver diseases. Results A total of 15, 7, 7, and 3 metabolites and a total of 8, 4, 4, and 1 metabolic pathway that were significantly different in serum between CYST, Stone, HCC, HCCA and healthy controls were identified and enriched through serum metabolomics analysis, respectively. Conclusion According to the above identified differential metabolites and enriched metabolic pathway results, it is shown that liver lesions mainly involved in the energy metabolism and amino acid metabolism & transport, in addition, inositol phosphate metabolism were significantly changed both in CYST, Stone, HCC and HCCA. -
Key words:
- UPLC-QQQ-MS /
- metabolic target analysis /
- biliary cyst /
- liver cancer /
- hilar cholangiocarcinoma
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0. 前言
肥胖是因体内脂肪过度蓄积导致健康损害的一种机体状态。目前已证实与肥胖相关联的疾病多达21种，广泛涉及心血管、消化、呼吸、神经、肌肉骨骼等系统相关疾病甚至传染性疾病[1]。根据2023年3月世界肥胖联盟（WOF）公布的《2023世界肥胖地图》，预计到2035年，肥胖或超重（WHO标准BMI≥25 kg/m2）率将达到51%，引起的经济损失超过4万亿美元[2]。中国同样面临肥胖发病率逐年增高的严峻问题，根据最新报道，按照中国人的BMI分级（BMI≥24 kg/m2），我国目前已有34.8%的人超重，14.1%的人肥胖[3]。而我国上市的关于肥胖的治疗药物却屈指可数，自2007年脂肪酶抑制剂奥利司他获批以来，只有胰高血糖素样肽-1（GLP-1）受体激动剂利拉鲁肽和贝纳鲁肽于2023年7月获批超重（肥胖）适应证[4]。但这两类药物仍存在各自的弊端：奥利司他因严重脂肪泻导致部分患者不耐受，且因减肥效果有限而不被推荐用于合并并发症的肥胖治疗[5]；利拉鲁肽和贝纳鲁肽减肥效果优异[6]，但需注射给药且价格昂贵，近期还有报道称此类药物胃肠道不良反应远比其公布的要严重[7]，并有可能增加肠梗阻风险，甚至使少数使用者产生自杀念头[8]。因此，研发可有效治疗肥胖且不良反应小的药物对治疗肥胖、减少并发症具有重要的意义。
研究人员前期发现，脂肪因子血清类粘蛋白（ORM）可作用于下丘脑瘦素受体，抑制摄食并调控能量平衡[9]，是潜在的减重药物研发靶点（专利号：ZL201510230870.2）。但ORM为高度糖基化的大分子蛋白质，制备困难且需注射给药，限制了其药物开发前景。研究人员前期筛选到一个全新小分子化合物HMS-01，该化合物由大环内酯类抗菌药红霉素改造而来，为一种未上市的在研新药，可显著升高ORM并降低肥胖小鼠体质量，且具有可经消化道用药、无抗菌活性的特征，有望为药物治疗肥胖开辟新赛道。
根据创新药物临床前研究的国际国内指导原则[10-11]，新药上市前需通过药效学和毒理学研究评估药物的有效性和安全性，其中，遗传毒性研究是毒理学研究的重要部分。遗传毒性是指化合物能直接或间接损伤生物体遗传物质，造成基因改变或突变，危及生物体及其后代健康。近年来，因具有致突变性而引起的药品召回事件时有发生[9]。本研究通过鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）对该化合物的遗传毒性进行实验探究，以期为创新药物的遗传安全性及其临床前毒理学评估提供支持。
1. 实验材料
1.1 受试样品及对照品
受试样品：HMS-0（西安秦申嘉合药物研究有限公司，批号20190127，纯度98%）。阴性对照品：二甲基亚砜（DMSO，Sigma-aldrich，CAS:67-68-5）。阳性对照品：吖啶诱变剂ICR-191（Sigma-aldrich，CAS：17070-45-0）、2-硝基芴（Sigma-aldrich，CAS：607-57-8）、叠氮钠（Sigma-aldrich，CAS：26628-22-8）、甲基磺酸甲酯（Sigma-aldrich，CAS：66-27-3）、2-氨基蒽（Sigma-aldrich，CAS：613-13-8）。
1.2 主要试剂及配制方法
营养肉汤（赛默飞，CM0067）；磷酸盐缓冲液（生工生物）；顶层琼脂培养基（Solarbio，货号：LA3080） ；底层培养基（Solarbio，货号：3090）；S9混合液溶剂（按照180 ml试验用量配制）：氯化钾（生工生物，CAS：7447-40-7）6.6 mmol、氯化镁（生工生物，CAS：7791-18-6）1.6 mmol、葡糖-6-磷酸（Sigma-aldrich，CAS：3671-99-6）1 mmol、辅酶Ⅱ（Sigma-aldrich，CAS：24292-60-2）0.8 mmol、0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（20×PBS缓冲液，Solarbio，货号：P1032）120 ml、去离子水定容至180 ml；S9混合液： 代谢活化系统S9是经苯巴比妥/β-萘黄酮诱导的雄性SD大鼠肝匀浆上清液制备而成，购自Molecular Toxicology，使用前与S9溶剂按照1∶9（V/V）的比例配制。
1.3 主要仪器设备
全自动 Ames 实验仪（北京慧荣和科技有限公司，型号：HRH-AMES116）；全自动菌落分析仪（杭州泽析生物科技有限公司，型号：DTS3）；倒置显微镜[徕卡贸易（上海）有限公司，型号：Leica DMi8 M/C/A]。
1.4 试验菌株
此次试验所使用的组氨酸营养缺陷型（his−）鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535，购自Molecular Toxicology公司，符合实验要求。
2. 方法
根据毒理学研究的国际标准[12-13]，设计制定Ames试验以检测受试药物HMS-01的遗传毒性。Ames试验亦称细菌回复突变实验，是利用伤寒沙门氏菌具有回复突变的特性，以鉴定受试物是否具有致突变性的一种试验方法。his−鼠伤寒沙门氏菌，因不能自主合成组氨酸而不能在缺乏组氨酸的培养基上生长，但在外界致突变因素的作用下可突变为能自主合成组氨酸的原养型沙门氏菌，从而能在无组氨酸的培养基上正常生长。因此，可通过观测其经受试物作用后，在无组氨酸培养基上的菌落生长情况来判定受试物是否具有致突变毒性。
试验结果要求应满足以下条件：①阴性对照组的回复突变菌落均数在历史阴性/溶媒对照范围内；②阳性对照组的回复突变菌落均数为其对应的阴性对照组的3倍以上；③污染平皿数不超过平皿总数的5%。
2.1 试验菌鉴定及扩增培养
5种试验菌（TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535）应具备表1所示的特性，因此于实验前进行如下生物学特性鉴定 ： his−鉴定、脂多糖屏障缺陷（rfa突变）鉴定、氨苄青霉素抗性（菌株R 因子缺失）鉴定、紫外线敏感性（ΔuvrB突变）鉴定、四环素（pAQ1）抗性的鉴定、自发回变菌落数（his+）测定 、对阳性诱变剂的回变敏感性测定，以确定试验菌株符合试验标准。
表 1 各试验菌株生物学特性菌株名称 组氨酸
缺陷脂多糖
屏障缺损R因子
缺失ΔuvrB
突变抗四
环素自发回
落数TA97a + + + + − 90~180 TA98 + + + + − 30~50 TA100 + + + + − 120~200 TA102 + + + − + 240~320 TA1535 + + − + − 10~35 取鉴定合格试验菌分别接种于装有7 ml营养肉汤培养基的试管中，于（35±2） ℃、（120±25） r/min条件下在空气恒温震荡器中扩增培养16～18 h，使用酶标仪检测菌液光密度并估算活菌浓度，待浓度达1×109 个/ml以上时可用于试验。
2.2 试验分组
设置6个HMS-01实验组，最高剂量为HMS-01 5 000 μg/皿，其下等比稀释设置5个剂量组分别为1 666.7、555.6、185.2、61.7、20.6 μg/皿。除此之外，另设置空白对照组及各菌对应的阳性对照组，分组情况见表2。
表 2 各试验菌对应的阳性诱变剂及剂量代谢活化 菌株名称 阳性诱变剂 剂量（μg/皿） −S9 TA97a ICR-191 1 TA98 2-硝基芴 1 TA100 叠氮钠 2 TA102 甲基磺酸甲酯 1.3 TA1535 叠氮钠 2 +S9 TA97a 2-氨基蒽 3 TA98 2-氨基蒽 3 TA100 2-氨基蒽 3 TA102 2-氨基蒽 30 TA1535 2-氨基蒽 3 2.3 平板渗入法
用全自动Ames实验仪进行试验，即2 ml融溶状态下的顶层琼脂培养基与下列物质混合：0.5 ml S9混合液或0.5 ml磷酸盐缓冲液、0.1 ml对应受试药品、0.1 ml扩增菌液，迅速混匀，室温静置，待平皿凝固后倒置于（37±1） ℃培养箱内培养48～72 h。各组共设置3个平行皿，重复试验1次。
2.4 试验结果观察及判定
培养结束后肉眼或显微镜下观察各皿的受试药品是否有析出以及背景菌斑的生长情况，并计数各平行皿的回变菌落数。每个组分别求均值，并将结果以（
$ \bar{x}\pm s $ ）的方式列出，各组平行数表示为$ n $ 。根据中国食品药品检定研究院发布的《细菌回复突变试验技术指导原则（征求意见稿）》制定的结果判断标准，对于TA97a、TA98、TA100及TA102，其诱导的回复突变菌落均数大于各自阴性对照组的2倍，且具有浓度依赖性及可重现性，即可判定为阳性结果；对于TA1535，其诱导的回复突变菌落均数高出各自阴性对照组的3倍，且具有浓度依赖性及可重现性，结果可判定为阳性。受试药品在加S9或不加S9混合液的条件下，经上述5种试验菌株测定后，只要有1种试验菌株为阳性，即可认定该受试药品的细菌回复突变试验为致突变阳性，反之则判断为阴性。
3. 结果
3.1 受试样品析出及背景菌斑生长情况
受试药品HMS-01在有S9处理条件下的TA97a和TA1535菌株实验中，1 666.7和5 000 μg/皿浓度组有观察到镜下非干扰沉淀，其余所有处理条件均未观察到供试品沉淀，结果见表3。所有试验组均未观察到背景菌斑抑制现象。
表 3 HMS-01细菌回复突变试验结果（n=3）代谢活化 组别 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 背景菌斑 沉淀 +S9 阴性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 20.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 61.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 185.2 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 555.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 1 666.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 5 000.0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 阳性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 −S9 阴性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 20.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 61.7 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 185.2 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 555.6 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 1 666.7 T0 P1 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P1 5 000.0 T0 P1 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P1 阳性对照组 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 T0 P0 注：T0.正常； P0.正常；P1.镜下非干扰性沉淀。 3.2 回复突变菌落数
受试药品HMS-01在所有处理条件下的回复突变菌落平均数均小于各自阴性对照组的2倍，且无浓度依赖性升高，结果见表4。本次试验条件中，在有（或无）代谢活化条件时，受试品HMS-01对组氨酸营养缺陷型（his−）鼠伤寒沙门氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535均无潜在致突变性。
表 4 HMS-01细菌回复突变试验结果（n=3）代谢活化 组别 回复突变菌落数 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 +S9 阴性对照组 157.7±15.5 29.3±3.1 138.3±4.7 326.0±7.5 21.3±4.0 20.6 156.7±17.8 34.7±7.1 119.3±8.0 334.3±16.7 21.0±5.2 61.7 159.0±7.2 31.7±8.5 140.0±9.8 250.0±113.2 19.3±3.1 185.2 147.7±22.7 33.3±4.2 151.7±6.0 319.0±6.2 18.7±0.6 555.6 168.3±7.6 34.7±2.5 130.7±10.0 340.0±6.1 19.3±4.0 1 666.7 157.7±2.1 34.7±5.8 148.7±2.9 287.0±84.1 20.3±4.6 5 000 143.7±19.9 38.3±6.7 122.3±8.1 304.0±22.9 17.0±1.7 阳性对照组 704.0±30.2 122.7±10.1 646.7±46.0 1 758.7±86.3 574.7±9.2 −S9 阴性对照组 171.7±5.1 36.7±3.2 151.3±8.7 340.3±3.8 23.7±1.5 20.6 168.0±11.8 40.0±1.7 125.7±9.1 338.7±7.4 25.3±3.1 61.7 169.7±17.5 42.3±13.7 131.3±15.6 350.0±15.9 21.3±3.1 185.2 152.0±13.1 34.3±5.5 148.0±8.7 366.0±5.0 24.7±3.2 555.6 167.7±1.5 42.0±2.0 161.3±8.6 351.0±24.2 22.7±6.5 1 666.7 163.0±3.6 45.3±3.2 156.0±3.6 376.7±25.7 22.3±3.1 5 000 164.7±22.9 40.3±3.1 153.3±6.7 365.0±26.0 17.3±3.8 阳性对照组 1 384.0±4.0 1 264.0±17.4 504.0±38.6 1 365.3±48.4 188.0±32.7 4. 讨论
遗传毒性因其对生物体及其后代影响巨大，一直是新药临床前毒理学评价的重要组成部分。细菌回复突变试验由美国加利福尼亚大学B·N·Ames教授于1975年建立并经后来者的不断发展完善，也称为Ames试验，现今已成为全球基因毒性测试中的最为公认的方法之一，通常作为体外毒理学测试的第1步，被广泛应用于药物致突变性的初筛检验。该试验以his−的沙门氏菌为指示生物，试验中包含了加与不加代谢活化系统，通过该菌特定的生物效应能检测基因突变，对受试物的遗传毒性进行分析。本研究利用细菌回复突变试验对受试药物HMS-01遗传毒性进行评价，结果显示，HMS-01在有（或无）代谢活化条件下，均无致突变性，未发现其具有遗传毒性。该结果将为HMS-01的后续新药研发提供有力支撑。
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图 1 基于UPLC-QQQ-MS的PCA得分图、相应的交叉验证图及S-plot图
A.健康人组 vs 胆管囊肿组 vs 胆道结石组 vs 肝癌组 vs 肝门部胆管癌组；B.健康人组 vs (胆管囊肿&胆道结石) vs (肝癌&肝门部胆管癌) vs QC；C.健康人组 vs (胆管囊肿&胆道结石) vs 肝癌；D.健康人组 vs (胆管囊肿&胆道结石) vs 肝门部胆管癌
图 3 潜在生物标志物在健康对照组、胆管囊肿、胆道结石、肝癌和肝门部胆管癌患者中平均含量比较
A.胆管囊肿、肝癌相关潜在生物标志物；B.胆道结石、肝癌相关潜在生物标志物；C.胆道结石、肝门部胆管癌相关潜在生物标志物；*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，与健康对照组比较
表 1 鉴别的潜在生物标志物
序号 组分 VIP p 值 Trend1 Trend2 Trend3 Trend4 Trend5 Trend6 Trend7 Trend8 1 肌醇 5.52 0.00 ↓* ↑** ↑* ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 2 L-山梨酸 2.04 0.00 ↓*** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↑ 3 D-甘露醇 1.03 0.00 ↓** ↑ ↑ ↑* ↑*** ↑*** ↓ ↓ 4 牛磺酸 1.66 0.00 ↓* ↓ ↓ ↑ ↑ ↑*** ↑ ↑* 5 L-苏氨酸 1.69 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 6 L-谷氨酸 2.88 0.00 ↓*** ↓* ↓ ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑** 7 L-苯丙氨酸 2.32 0.00 ↓*** ↓ ↓ ↑ ↑** ↑*** ↑ ↑*** 8 L-天冬氨酸 1.59 0.00 ↓* ↓ ↓*** ↑ ↑ ↑** ↑ ↑* 9 尿酸 3.77 0.76 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 10 半乳糖酸 1.08 0.38 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↓ 11 D-葡萄糖酸 1.90 0.19 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↓ ↓ 12 乳酸 4.53 0.00 ↓*** ↓ ↑ ↓ ↑*** ↑*** ↑ ↓ 13 L-色氨酸 1.09 0.06 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑** ↑ ↑ 14 α-D-葡萄糖-1-磷酸二钠盐 1.04 0.00 ↑*** ↑*** ↑ ↑ ↓*** ↓*** ↓** ↓*** 15 2-甲基-1-丁醇 2.84 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 16 丙酮酸 2.86 0.00 ↓** ↓ ↑* ↑ ↑*** ↑*** ↑* ↑ 17 2-丁酮酸 1.26 0.13 ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ ↓ ↑ ↓ 18 丙二酸 2.37 0.00 ↓*** ↓*** ↓*** ↓ ↑ ↑*** ↑ ↑*** 19 琥珀酸 2.41 0.24 ↓ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↓ ↑ 20 α-酮戊二酸 1.96 0.04 ↓ ↑ ↑* ↑ ↑** ↑ ↑ ↑ 21 戊酮酸 1.05 0.66 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ 22 DL-异柠檬酸 4.35 0.13 ↓ ↓ ↑ ↑ ↑ ↑* ↑ ↑ 23 顺式-乌头酸 2.87 0.00 ↑* ↑** ↑ ↓ ↓ ↓*** ↓ ↓*** 24 反式-乌头酸 4.60 0.00 ↑** ↑*** ↑** ↑ ↓ ↓* ↓ ↓** 25 4-吡哆酸 1.01 0.40 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↑ ↓ ↑ 26 水杨酸 1.07 0.43 ↓ ↓ ↓ ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ 注：Trend1：胆管囊肿 vs 健康对照；Trend2：胆道结石 vs 健康对照；Trend3：肝癌 vs 健康对照；Trend4：肝门部胆管癌 vs 健康对照；Trend5：肝癌 vs 胆管囊肿；Trend6：肝门部胆管癌 vs 胆管囊肿；Trend7：肝癌 vs 胆道结石；Trend8：肝门部胆管癌 vs 胆道结石；*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001 
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