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中药丹参是唇形科鼠尾草属药用植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根茎，具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效[1]。水溶性的丹酚酸类物质和脂溶性的丹参酮类物质是丹参发挥药效的重要物质基础[2-4]。丹参主要来源于人工栽培，但随着种植规模的扩大，品质退化现象严重[5]。因此，阐明丹参活性成分形成规律对保证其临床用药安全尤为重要。近年来，科研工作者从转录水平对丹参品质形成机制开展了研究，鉴定出多个参与品质调控的转录因子[6-7]。但随着研究的深入，逐渐发现酶的稳定性在药材品质形成中发挥着不可或缺的作用。
泛素-26S蛋白酶体系统通过介导蛋白泛素化降解影响靶蛋白的稳定性[8-11]。其中，F-box蛋白作为Skip-Cullin-F-box（SCF）复合物的核心组分，通过其N端的F-box基序与SKP1相互作用形成骨架，并通过C端的多种蛋白质相互作用结构域选择性识别底物蛋白，这些结构域包括WD 40重复序列、TUB 结构域、Kelch 结构域和富含亮氨酸的重复序列（LRR）等[12]。基于这些不同的结构域，F-box蛋白家族被进一步细分为多个亚家族[13-16]。近年来，F-box-LRR （FBXL）家族蛋白在植物应对生物及非生物逆境中的关键作用日益受到关注。例如，拟南芥茉莉酸受体COI1的C端为18个串联的LRRs结构域[17]，能够特异性识别转录抑制子JAZ，并通过26S蛋白酶体途径降解，解除了JAZ对茉莉素途径转录激活因子MYC2的抑制作用，从而激活茉莉素信号途径下游信号防御通路[18-20]。水稻OsCOI1是拟南芥COI1的同源基因，通过与阻遏蛋白JAZ及E3泛素连接酶复合体SCF-COI1的相互作用，诱导一系列防御及生长发育相关基因的表达[21]。拟南芥中的MAX2蛋白，其C端富含LRR结构域，通过调控气孔开合，有效防御丁香假单胞菌和胡萝卜果胶菌的入侵[22]。TIR1/AFBs生长素受体蛋白具有高度保守的F-box-LRR结构域[23]，外源病原菌侵染后，miR393过表达导致TIR1水平下降，特异性提高了拟南芥对丁香假单胞杆菌的抗性[24-25]。拟南芥F-box蛋白AFBA1通过脱落酸（ABA）信号途径正调控植物抗旱反应[26]。F-box-Nictaba的表达在拟南芥中受热胁迫、丁香假单胞菌和水杨酸（SA）的诱导, 并通过SA途径介导植物抗病性反应[27]。 拟南芥AT5G15710 基因编码的F-box蛋白参与了对重金属Cu2+或Cd2+的胁迫过程[28]。目前，F-box家族在植物中的功能研究主要集中在拟南芥、水稻等模式植物中，在丹参这一重要药用植物中的研究尚显不足。本研究从丹参基因组中筛选出104条FBXL 基因，并进行生物信息学和表达模式分析，旨在为SmFBXL的后续研究提供依据。
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从CNCB网站（https://www.cncb.ac.cn/）中下载丹参基因组（GWHAOSJ00000000）数据及gff注释信息。从拟南芥信息网站（TAIR，https://www.arabidopsis.org/）中下载拟南芥FBXL 基因的氨基酸序列。使用TBtools v2.101中Blast Compare Two Seqs模块，将E值设置为10−5进行本地blast。此外，通过Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）查找丹参FBXL 基因家族特征结构域（PF00646、PF12937、PF13013），通过Simple HMM Search进行丹参FBXL 氨基酸序列的筛选。取两次筛选的序列ID的交集，最后使用在线生物信息学工具国家生物技术信息中心CDD搜索数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、InterPro数据库（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）和SMART网站（https://smart.embl.de）, 去除不含F-box和LRRs的序列。
使用ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）计算了预测丹参FBXL 基因蛋白的理化特征，包括氨基酸序列长度、理论等电点（pI）、分子量（Mw）、不稳定指数、脂肪族指数和总平均亲水性指数（GRAVY）等指标。使用CELLO在线网站（http://cello.life.nctu.edu.tw/）进行丹参FBXL 基因亚细胞定位预测。
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从PudMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站中下载大豆FBXL基因的氨基酸序列，连同丹参和拟南芥FBXL 基因的氨基酸序列进行系统发育关系分析。使用Clustal进行多序列比对，比对完成后使用MEGA11软件Neighbor-Joining（NJ），参数Bootstrap值设为
1000 ，进行系统发育树构建。使用iTOL（https://itol.embl.de/）对进化树进行可视化及美化。 -
使用在线MEME软件（http://www.OMI csclass. com/article/67）分析丹参FBXL 家族成员的基序结构，其中基序的最大数量设置为20，基序的最小宽度设置为6，基序的最大宽度设置为50。从丹参的基因组注释文件中提取丹参FBXL 基因的结构，包括CDS和UTR。最后，使用TBtools v2.101 进行可视化分析。
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从丹参的基因组注释文件中提取丹参FBXL 基因染色体位置信息，并使用Tbtools软件中Gene Location Visualize from GTF/GFF模块进行可视化。BLASTP程序用于鉴定丹参中的同源FBXL 基因，e值阈值设置为< e−5。使用MCScanX默认参数分析丹参FBXL 基因之间的共线性关系。使用TBtools进行可视化。为了进行共线性分析，从Phytozome v13 网站（https://phytozome-next.jgi.doe.gov/）下载拟南芥基因组序列和注释文件，从CNCB网站南丹参基因组序列和注释文件（GWHASIU00000000）。利用MCScanX程序分析了丹参与拟南芥、南丹参之间的共线性。
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每个SmFBXL 基因起始密码子（ATG）上游的2 000 bp区域被认为是启动子序列。使用TBtools提取启动子序列并用PlantCARE（https://bioinformatics.PSB.ugent.be/web tools/plant care/html/）预测顺式调控元件。使用TBtools中HeatMap模块对与胁迫反应、植物生长和发育、植物激素响应和光响应的顺式元件进行可视化和总结。
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丹参植株生长于海军医大学药学系温室，为唇形科植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge），于丹参生长一月后取其根、叶组织，立即液氮冷冻, 于−80℃冰箱保存，进行转录组测序。使用TBtools的HeatMap模块进行热图可视化，为避免基因表达量差异过大，影响可视化，对数据取Log2（以2为底差异表达倍数的对数）进行标准化，并进行列归一化和聚类分析。
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经CDD和Pfam在线分析后最终获得104个SmFBXL序列，均含有F-box和LRRs保守结构域，将所得到的SmFBXL基因序列进行编号，即 SmFBXL1~SmFBXL104。通过ProtParam工具预测理化性质，发现SmFBXL基因长度范围为645 ~ 3 012 bp，编码的蛋白氨基酸长度差异亦较大，为 214~2 362 aa，平均为 494 aa；相对分子质量为 24 333~268 357，与氨基酸长度成正比；等电点为4.41~9.36，其中43个为碱性蛋白质，61个为酸性蛋白质。亚细胞定位预测结果表明，42个 SmFBXLs蛋白定位在细胞核，表明其在细胞核发挥相关调控的功能；9个 SmFBXL蛋白定位在细胞质，表明其在细胞质发挥调控的功能；3 个 SmFBXL 蛋白定位在叶绿体，推测其可能参与叶绿体的基因表达调控；此外，还有1个成员定位于线粒体，37个定位于细胞质膜，12个定位于细胞外间质。
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为明确 SmFBXL基因家族成员间的亲缘关系及其与生物学功能的关系，采用NJ法构建丹参、拟南芥和大豆的FBXL 基因家族成员的系统发育进化树（图1）。SmFBXL 基因家族共分为8个亚族（亚族Ⅰ~Ⅷ）。其中，亚族Ⅰ的所有成员大部分来自大豆，仅有一个AtFBXL 家族成员，其他7个亚类中均有SmFBXL家族成员分布。其中，亚族Ⅱ中SmFBXL成员分布最多，有52个SmFBXL成员，其次是亚族Ⅲ、亚族Ⅳ、亚族Ⅷ，分别有17、10、8个，亚族Ⅴ、亚族Ⅶ均有6个SmFBXL成员，亚族Ⅵ仅有5个SmFBXL成员。另外，亚族Ⅱ中仅有SmFBXL和AtFBXL 家族成员，推测SmFBXL在进化过程中可能出现了功能特异蛋白。系统进化上与拟南芥直系同源基因比较相近的FBXL 基因，在其结构与功能上可能比较相似，可以作为推测丹参中FBXL 基因功能的参考依据。
图 1 丹参FBXL 基因的系统发育树
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为了进一步分析SmFBXL基因家族成员的结构和潜在功能，利用GSDS、MEME分析SmFBXL基因的外显子与内含子的分布、保守基序。SmFBXL基因家族的蛋白序列中，基序3出现在大多数亚族中，出现频率最高，其与F-Box-LRR保守结构域相关。同一亚族中的大部分SmFBXL基序组成相似，此外，有些基序仅出现在特定亚族中，如亚族Ⅱ成员中含有独有的基序2、基序6，亚族Ⅲ特有的基序5，亚族Ⅷ特有的基序8，推测这些亚族中的FBXL基因可能具有其他重要的生物学功能（图2）。对SmFBXL基因家族成员的结构分析发现，其内含子和外显子数量存在高度的差异性，基本都含有内含子1~10个，多数SmFBXL基因含有2个内含子，同一亚族的SmFBXL转录因子的基因结构相对保守（图2）。
图 2 丹参FBXL 编码蛋白基序分析及基因结构
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对丹参基因组中获得的SmFBXLs基因进行染色体定位分析（图3A），大部分基因分布在8条染色体的上下臂，每条染色体上的SmFBXL 基因数量为3~15个，基因在Chr01、Chr02、Chr03、Chr06、Chr07、Chr08染色体上分布的较少，集中在Chr04、Chr05染色体的较多，这可能与染色体结构和大小的差异有关。基因家族的形成与扩张很大程度上是由基因复制产生的，为了探究丹参中FBXL 家族的基因扩张情况，本研究对SmFBXL基因家族成员进行了基因复制分析。种内共线性分析（图3B）表明，丹参中FBXL 成员主要通过片段重复进行基因复制，其中涉及到片段重复的基因共有38个，占比36.5%。丹参同拟南芥、南丹参的基因组共线性分析（图3C）表明，丹参中36个FBXL 家族成员同拟南芥FBXL 具有共线性，丹参5号染色体上的基因大多对应拟南芥 3号染色体上；丹参中87个FBXL 家族成员同南丹参FBXL 具有共线性，说明丹参中FBXL 家族成员同南丹参FBXL 具有较高同源性。
图 3 丹参FBXL 基因染色体定位及共线性分析
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位于基因上游的启动子区域中存在的顺式作用元件可以通过结合转录因子调控基因表达，并对不同环境条件做出反应，这可能为基因功能推测和分化研究提供重要依据。对 SmFBXL 启动子进行顺式作用元件预测，观察到大量不均匀分布在所有基因上的顺式作用元件，将其分为4类：应激响应、光响应、激素响应和生长发育（图4）。统计显示，应激响应类别占比最高，占所有元件的33.7%，包括10种类型的元件，前4个主要元件分别是MYC（低温胁迫）、STRE（渗透压胁迫）、ARE（抗氧化响应）和AS-1（砷胁迫）。第二大类别是光响应元件，占所有元件的26.9%，所有SmFBXL基因家族成员启动子区均含有光响应元件，其中，Box 4的频率最高（光响应元件的34.5%），其次是G-box元件（光响应元件的21.4%）。激素响应占所有元件的25.1%，包括脱落酸（ABA）响应（ABRE）、水杨酸（SA）响应（TCA-element）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应（CGTCA-motif和TGACG-motif）、生长素（IAA）响应（TGA-element和AuxRR-core）、赤霉素（GA）响应（P-box和GARE-motif）以及植物雌激素响应（ERE）。ABRE（激素响应元件的26.1%）是最常见的激素响应元件。生长发育元件占比最低（占所有元件的14.3%），包括：负责分生组织表达的CAT-box、CCGTCC-box和CCGTCC motif、负责玉米谷蛋白代谢调控的O2-site、负责次生木质部发育的AAGAA-motif、负责胚乳表达的GCN4-motif、负责细胞周期调节的MSA-like以及负责生长发育的HD-Zip 1等。综上所述，SmFBXL 基因家族的启动子含有低温、渗透压、抗氧化、砷、光响应、SA、ABA、GA、IAA、MeJA和分生组织等响应元件，暗示SmFBXL可能在植物应激防御、激素响应和生长发育中发挥潜在作用。
图 4 丹参FBXL 基因启动子顺式作用元件及其数量分布
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通过转录组测序，分析104个 SmFBXL 基因在不同组织中的表达模式（图5）。结果表明，104个SmFBXL在丹参不同组织中的表达水平差异很大，其中SmFBXL20、SmFBXL10、SmFBXL89、SmFBXL39、SmFBXL7、SmFBXL17、SmFBXL78、SmFBXL25、SmFBXL6、SmFBXL14、SmFBXL24、SmFBXL72、SmFBXL19 这13个基因在叶和根中表达量均相对较高；SmFBXL40、SmFBXL41 2个基因仅在叶片中表达量较高；SmFBXL44、SmFBXL1、SmFBXL91 3个基因仅在根中的表达水平较高；其中44个基因的在叶和根中的表达量都很低，FPKM 值<1。以上结果表明SmFBXL在根和叶中均能发挥功能，其中有13个SmFBXL基因表达量明显高于其他家族基因，可作为后续研究SmFBXL基因家族的候选基因，其原因可能是SmFBXL 基因功能分化所导致的。
图 5 丹参FBXL 基因表达模式分析
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丹参酮和丹酚酸类物质是丹参中主要生物活性次生代谢产物。因此，明确丹参次生代谢产物的生物合成及其调控机制是丹参质量控制的基础。大量的研究集中在酚酸生物合成的转录调控上，但对控制酚酸生物合成的蛋白质翻译后修饰知之甚少。次生代谢物的产生受环境刺激的影响很大。当植物遭受胁迫时，相应的次生代谢物会迅速合成和积累，同时消耗大量的能量和营养[29]，这种生产过剩可能会随着逆境的消除而停止。因此，开启和关闭生物合成途径在植物的生命周期中发挥着同等重要的作用。泛素-蛋白酶体系统作为蛋白质翻译后修饰方式之一，通过介导转录因子或生物合成酶等靶蛋白的降解，在关闭生物合成途径中发挥着重要作用。例如，寒冷胁迫中，花青素可有效清除活性氧造成的氧化损伤，增强耐寒性。低温时，苹果中MdMYB23可激活MdANR的转录，促进花青素的生物合成；常温下，MdBT2介导的UPS可以降解MdMYB23，抑制MdANR，从而终止花青素的生物合成[30]，可以看到泛素化修饰在植物抗逆和次生代谢调控中发挥关键作用。
FBXL蛋白通过蛋白-蛋白相互作用域选择性募集靶蛋白，从而控制 SCF泛素连接酶复合物的特异性。FBXL 蛋白分布广泛，迄今为止，在拟南芥、水稻、大豆、玉米、苹果中分别鉴定出29、61、19、16、34 个FBXL 基因[31-33]。然而，关于丹参的FBXL 基因家族的研究还很少，有待进一步挖掘并进行功能鉴定。本研究在丹参基因组中鉴定了104个SmFBXL基因，比多数物种中的FBXL 基因数目多，其大小的差异可能是由于每个物种在进化和分化过程中全基因组多倍体化事件的发生。理化分析表明SmFBXL的氨基酸长度、相对分子质量和等电点差异较大，但基因结构较为保守，基本都含有内含子1~10个，多数SmFBXL基因含有2个内含子，类似的结果亦在水稻[31]、大豆[32]等植物中发现。保守基序对于蛋白质行使生物功能非常重要， 基序3在SmFBXL基因家族出现频率最高，其与F-Box结构域相关，有些基序仅出现在特定亚族中，推测这些亚族中的 FBXL 基因可能具有其他重要的生物学功能。这一现象与油菜[34]的结果相似。SmFBXL 蛋白具有较高的基序保守性，同一亚族的SmFBXL蛋白基序组成基本相似，但也有少数聚在一支的SmFBXL 蛋白基序构成并不相同，推测其可能与SmFBXL 家族成员的功能分化有关。
本研究采用NJ法构建了丹参、拟南芥和大豆的FBXL 基因家族成员的系统发育进化树，将丹参FBXL 基因家族分为了7个亚族。蛋白序列的相似性往往决定其功能的相似性，研究发现拟南芥FBXL 蛋白AT2G42620.1通过调控气孔开合，有效防御丁香假单胞菌和胡萝卜果胶菌的入侵[35]，同源进化分析发现，SmFBXL36与AT2G42620.1的同源关系较近，组织表达分析发现在叶中表达量较高，启动子分析发现含有低温响应元件LTR，推测可能与其同源蛋白具有相似的生物学功能。拟南芥AT3G60350.1和AT2G44900.1编码蛋白可以促进侧根发育，与野生型幼苗相比，突变株形成的侧根较少，而高表达株产生的侧根较多[36-37]。系统进化分析发现SmFBXL86、SmFBXL79 与AT3G60350.1、AT2G44900.1同源关系较近，SmFBXL79含有分生组织表达元件CCGTCC 基序和CCGTCC-box，暗示其可能在调控丹参侧根生长中起重要作用。AT5G01720.1（又称作RAE1）与SmFBXL82同属一个分支，是 SCF 型 E3 连接酶复合物的 F-box 蛋白成分。它是明矾诱导调节环路的一部分：STOP1 会诱导 RAE1 的活性，反过来RAE1又会泛素化 STOP1，然后将其降解[38]。AT4G33210编码 SLOMO（SLOW MOTION）蛋白，可以平衡生长素和启动嫩枝分生组织，用于调节温度介导的下胚轴生长[39]， SmFBXL40、SmFBXL11和AT4G33210同属一个分支，并且均含有生长素响应元件TGA-element，推测可能具有生长素调控功能。AT3G54650.1和SmFBXL15同源关系较近，可能参与细胞周期基因调控[40]。AT4G07400.1（VFB3）和SmFBXL5、SmFBXL32同源关系较近，与 VFB1、VFB2 和 VFB4 似乎存在功能冗余，当所有 4 个基因的水平都降低时，植株会表现出生长缺陷[41]。综上所述，结合启动子顺式作用元件和组织表达分析，推测SmFBXL家族在丹参逆境胁迫和生长发育中可能发挥重要作用。
基因表达是其发挥生物学功能的前提。SmFBXL基因呈现不同的组织表达特征，104个在丹参不同组织中的表达水平差异很大，部分家族基因仅在叶或根中表达，44个基因在根和叶中表达量都很低。SmFBXL20、SmFBXL10、SmFBXL89、SmFBXL39、SmFBXL7、SmFBXL17、SmFBXL78、SmFBXL25、SmFBXL6、SmFBXL14、SmFBXL24、SmFBXL72、SmFBXL19 这13个基因在叶和根中表达量均相对较高，表明这些SmFBXL可能在不同组织的转录调节中起协助作用，可能是SmFBXL基因功能分化所导致的。部分基因在丹参根中高水平表达，提示这些SmFBXL可能在丹参根发育中发挥重要作用。
当前研究关于SmFBXL基因在丹参中的作用尚待深入探索。该基因家族是否能增强丹参的抗逆性，诱导丹参酮及酚酸生物合成关键酶基因表达，以及其具体作用机制尚不明确。本研究对丹参FBXL家族进行了系统性鉴定，为中药模式植物丹参中FBXL介导的泛素化修饰的生物合成与调控机制解析提供了数据支持，有望为提升丹参的抗逆性及其品质改良提供分子育种上的新策略与参考依据。未来的研究将聚焦于这些核心问题，以期推动丹参种质资源的优化与发展。
Identification and expression pattern analysis of FBXL gene family in Salvia miltiorrhiza
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摘要:
目的 基于基因组数据鉴定丹参F-box-LRR （FBXL ）基因家族，并对其进行生物信息学与表达模式分析，为进一步深入阐明其基因功能提供依据。 方法 从丹参基因组数据库中鉴定出SmFBXL基因，运用生物信息学方法及在线工具分析其基因结构特征，启动子顺式作用元件，编码的蛋白理化性质、系统进化、组织表达等。 结果 从丹参的基因组中共鉴定出104个SmFBXL基因（SmFBXL1~SmFBXL104），不均等分布于8条染色体上，上游启动子含有与植物抗逆、生长发育和激素应答等相关的顺式作用元件。构建丹参、拟南芥和大豆的FBXL 家族成员的系统发育树，将104个SmFBXL基因分为7个亚族。通过同源进化分析，猜测SmFBXL36可能参与防御病原菌入侵，SmFBXL86、SmFBXL79可能在调控丹参侧根生长中起重要作用，SmFBXL11、SmFBXL40可能调节下胚轴生长。转录组数据显示SmFBXL基因在丹参不同组织中差异表达，其中13个SmFBXL基因在根和叶中的表达水平较高，可作为后续研究SmFBXL基因家族的候选基因。 结论 研究结果为进一步解析SmFBXL基因在丹参逆境响应及次生代谢产物生物合成中的调控机制提供了参考。 -
关键词:
- 丹参 /
- F-box-LRR基因家族 /
- 生物信息学 /
- 功能分析
Abstract:Objective To identify and analyze the bioinformatics and expression patterns of the F-box-LRR（FBXL） gene family of Salvia miltiorrhiza based on genomic data, and provide a foundation for further elucidating its gene functions. Methods The SmFBXL gene was identified from the Salvia miltiorrhiza genomic database. Its gene structure features, promoter cis-acting elements, physicochemical properties of encoded proteins, evolutionary relationships, and tissue expression were analyzed by bioinformatics methods and online tools. Results A total of 104 SmFBXL genes were identified from the Salvia miltiorrhiza genome, unevenly distributed on 8 chromosomes, with upstream promoters containing cis-acting elements related to plant stress resistance, growth and development, and hormone response. A phylogenetic tree of the FBXL family members of Salvia miltiorrhiza, Arabidopsis thaliana, and Glycine max was constructed, dividing the 104 SmFBXL genes into 7 subfamilies. Through homologous evolution analysis, it was speculated that SmFBXL36 might be involved in defense against pathogen invasion, SmFBXL86 and SmFBXL79 might play important roles in regulating lateral root growth in Salvia miltiorrhiza, and SmFBXL11 and SmFBXL40 might regulate hypocotyl growth. Transcriptome data showed differential expression of SmFBXL genes in different tissues of Salvia miltiorrhiza, with 13 SmFBXL genes showing higher expression levels in roots and leaves, serving as candidate genes for further research on the SmFBXL gene family. Conclusion The research results provided a reference for further elucidating the regulatory mechanisms of SmFBXL genes in stress response and secondary metabolite biosynthesis in Salvia miltiorrhiza. -
Key words:
- Salvia miltiorrhiza /
- F-box-LRR gene family /
- Bioinformatics /
- Functional analysis
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中药挥发性成分（VOCs）是指中药中一类具有芳香气并易挥发的成分，其化学组成复杂，主要包括挥发油类以及其他分子量较小、易挥发的化合物，例如萜类、脂肪族、芳香族化合物等。VOCs具有发汗解表、芳香开窍、镇咳祛痰、理气、驱风、抑菌、镇痛、杀虫等多种功效。作为中药学研究的热点之一，高效率、高标准的检测药材中VOCs十分关键。因此，利用现代化方法来实现对中草药挥发性成分的细致分析，意义巨大。
VOCs常用气相色谱-质谱联用（GC-MS）方法进行分析，虽分离能力强，但样品需要预处理且分析时间长。气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）法结合了GC突出的分离能力和IMS快速响应、高灵敏度的特点，具有样品准备简便、高灵敏度、高分辨率等显著优势，结合化学计量学分析中药材VOCs所呈现图谱，可实现对药材VOCs无损、快速区分[1]。
1. 气相色谱–离子迁移谱联用技术原理
GC-IMS 技术的基本原理[2]是通过将样品混合物引进气相色谱仪进行分离，样品分子和载气分子在离子源放射性物质的作用下发生一系列反应形成产物离子，这些产物离子在不同的电场驱动下通过离子门进入迁移区，与逆向而来的中性迁移气体分子发生碰撞而损失能量。产物离子在电场中的迁移速率不同，到达检测器上的时间不同，从而使样品差异化分离（如图1），最后可得到一个包含有离子迁移时间（X轴），气相色谱保留时间（Y轴），离子强度（Z轴）的三维谱图（如图2）。
顶空-气相色谱-离子迁移谱（HS-GC-IMS）是应用于检测药材中VOCs最为广泛的方式之一 [3]。其原理是首先将样品中的VOCs通过热孵育和振摇使之从药材中逸出，随后抽取顶空气体进行分析，避免复杂基质干扰，再使之进入气相色谱（GC）、离子迁移谱（IMS）中，得到相应谱图。HS-GC-IMS无需样品预处理，在分析复杂样品或需要快速检测场景方面更具优势。
自从1972年第一张经过GC分离的IMS谱图出现[2]，早期主要用于军事领域（如化学战剂检测）和毒品筛查的先进技术逐渐面向市场，应用于研究（如图3），引进国内后广泛使用于中药研究。现阶段，通过GC-IMS捕捉到中药材中的微量VOCs，将其应用于区分中药的不同种类和产地、监控中药炮制过程以及中药复方组分分析等[4]，为中药材的产地及真伪鉴别提供可靠的依据，同时也为质量控制和药效研究等方面提供数据支持。
2. 在中药鉴定中的应用
2.1 同属不同种的中药鉴别
同属不同种之间的中药材亲缘关系比较接近，在VOCs种类差异上不显著，利用GC-IMS技术善于捕捉挥发性化合物种类微小差异的特点，可对样品进行品种鉴别。
陈皮中主要含有三萜类、挥发油类等几百种成分，有平喘止咳、调节血管等药理作用[5-6]，刘主洁等[7]和Lv等[8]采用HS-GC-IMS对陈皮和广陈皮样品中VOCs进行研究，分析二者的特征信号，以邻氨基苯甲酸二甲酯为广陈皮最明显的特征标记物，柠檬烯、癸醛等也可作为广陈皮的特征信号，利用这些特征信号可对陈皮和广陈皮进行区分。山莓是覆盆子的混淆品之一，为保证用药安全有效，有必要对两者进行区分[9]，严爱娟等[10]采用GC-IMS技术检测山莓和覆盆子VOCs，明确鉴定出覆盆子特征成分较山莓多，其中癸醛、1-辛烯-3-醇等在覆盆子样品中的含量更高，苯甲醛、2-丁酮等在山莓样品中的含量更高，以此来实现山莓和覆盆子的区分。彭旭阳等[11]采用GC-IMS分析新疆和田地区“梭梭”和“红柳”肉苁蓉这两种不同寄主肉苁蓉挥发性物质之间的不同，找到了二者主要差异物质为苯甲醛、庚醛等。
2.2 中药不同产地鉴别
道地药材是指生长在特定的自然生态环境中，经过一系列技术培育和加工而成，且被公认为比其他地方生产的同种药材的质量和治疗效果好的药材[12]。但随着产地的迁移、品种的引入，在外观性状上对道地药材和其他产地的中药进行简单鉴别已经不能满足需求。
王振洲等[13]采用GC-IMS对来自不同产区的人参VOCs进行检测，发现2,5-二甲基吡嗪和2,6-二甲基吡嗪等VOCs在吉林集安四年生人参中含量较高，而吉林敦化四年生人参中含量相对较低，由此鉴别四年生吉林集安和敦化的人参。西洋参同属于五加科人参属，成功引种进入我国后，辽宁、吉林和山东是其主产区[14],王燕等[15]使用GC-IMS技术对美国、加拿大、山东等五个不同产地的西洋参进行研究，共鉴定出53种VOCs，其中美国西洋参中2-庚酮等成分的含量较高，而加拿大产α-蒎烯等成分的含量显著高于其它产区，中国产芳樟醇等成分的含量较高，其中吉林产地的含量是辽宁、山东产地的2.60和3.60倍，通过这些显著差异可对西洋参进行产地溯源和鉴别。
李曼祎等[16]使用GC-IMS技术对新疆、宁夏、内蒙古、青海四个主要产区的枸杞进行化学成分测定，分析出了四个地区含量差异较大的16种物质，发现内蒙古枸杞区别于另外三个产地特有的物质为正丁醇，同时筛选出了叶醇等五种标记性物质对枸杞产地进行区分。Li[17]等分别采用HS-SPME-GC-MS和HS-GC-IMS检测河北、河南、江苏、浙江、安徽以及山东6个不同地区的五味子，结果显示安徽的五味子萜类物质含量较高，同时该研究也证明了HS-GC-IMS对样品的分类效果优于HS-SPME-GC-MS。山东为瓜萎的道地产区[18]，河北也是瓜萎的重要产区，不同产地的瓜萎可能在品质及所含成分上有所差别，从而对药效也会产生一定的影响[19-20]。张敏敏等[19]采用GC-IMS在瓜萎皮样品中共鉴定出醛类和醇类等88种VOCs，分析发现山东瓜蒌皮中2-庚酮、正壬醛等物质的含量低于河北瓜蒌皮，但1-己醇、糠醇等含量更高的结论，通过这些差异基本实现了两地区瓜萎皮的区分。Li等[21]采用HS-GC-IMS联合PCA建立松茸特征图谱，对分别来自云南和四川的松茸样品以及它们的菌盖和菌柄进行研究，发现虽然指纹图谱相似度较高，但各自也有其特征性挥发物：苯乙醛和糠醇等仅在云南产松茸的菌柄中被发现，戊烷仅在四川产松茸的菌柄中被发现，戊醛仅在云南产松茸的菌盖中检出，甲基吡嗪仅在四川产松茸的菌盖中检出，通过特征性挥发物的不同，可对分别产自云南和四川的松茸进行区分。
2.3 中药复方中主成分的鉴别
中药复方成分众多且复杂，确保其质量符合标准、疗效可靠、使用安全是关键，采用HPLC特征图谱进行分析是目前公认的良好方法之一[22]。GC-IMS检测灵敏度高、分离效果好，是对HPLC表征中药复方质量分析的有益补充。
Yuan等[23]设置了对照组、慢性不可预测轻度应激（CUMS）组和CUMS＋百合鸡子黄汤组，采用HS-GC-IMS等方法对百合鸡子黄汤治疗CUMS大鼠粪便中挥发性化合物含量进行研究，鉴定出了11个生物标志物，找出了对照组大鼠粪便样品中甲硫醚含量较高，而CUMS组则较低，同时百合子鸡汤组抑郁表现出保护性干预作用；Yin等[24]采用HS-GC-IMS对开心散中的挥发性化合物进行分析，鉴别出β-细辛酮等十种VOCs可作为开心散的质量标记物，进一步为开心散质量控制及药效机制等的相关研究奠定基础；李巍等[25]利用HS-GC-IMS对清感秋饮中的VOCs进行定性定量分析，共鉴定出120种VOCs，其中，紫苏属酮、β-石竹烯等可能为其主要药效成分。
3. 在中药加工炮制中的应用
中药的加工炮制是提高临床疗效的重要手段，也是保证临床用药安全的重要措施[26]。应用不同的炮制方法可能会引起中药中的化学成分发生含量加减、成分转化与破坏等变化，采用GC-IMS技术对中药加工炮制过程中的VOCs进行动态监控，对于炮制工艺的规范、制定更优炮制方案等具有指导意义。
干燥是中药材和饮片加工制备过程中的重要且关键的环节之一，而中药中的VOCs易受干燥工艺的影响,对于富含VOCs的中药，准确控制干燥工艺有利于减少有效成分的损失。陈树鹏等[27]采用GC-IMS等技术确定烘干样品的整体香气属性优于晒干样品，这可能是由于烘干工艺对环境温度的调整使得烘干过程更有利于果香、柑橘香以及甜香香气保留。其中苯乙酸乙酯、乙酸乙酯等 12 种物质为晒干主要成分，2-甲基-1-丁醇、（E）-2-己烯-1-醇等为烘干主要成分；Wang等[24]在8S-GC-IMS技术的辅助下，了解了柑橘皮干燥以及不同条件下挥发性成分情况，研究柑橘皮各成分在不同干燥温度下的缺失，其中，70 ℃下干燥会导致2,2-苯基-1-苦基肼基和铁还原抗氧化能力显著降低。Yu等[29]通过GC-MS比较总离子色谱图中的峰面积与苯乙酸乙酯的峰面积，将VOCs的含量进行半定量再通过GC-IMS呈现图谱对结果进行比较，确定VOCs的身份，从而证实晒干有利于两个品种的网纹柑橘中萜醇类化合物的保存，热风干燥有利于脂肪族醛和倍半萜的保存，而冷冻干燥是保存酯类和酚类物质的最佳方法；Zhou等[30]对肉苁蓉进行酒制增效后粉碎、超微粉碎、醇提、水提等处理，采用HS-GC-IMS方法检测其VOCs并建立指纹图谱，发现增效处理的肉苁蓉VOCs的种类和含量有所减少，分析原因可能为各种化学物质之间在处理过程中会发生化学变化，而新鲜肉苁蓉则保存了更多种类的VOCs，超微粉碎处理和水提处理后的肉苁蓉挥发性化合物主要以醛类为主。除此之外，将其它中药基于GC-IMS技术在不同炮制方法中的应用汇总于表1。
表 1 GC-IMS技术在炮制研究方面的应用作者 药材及炮制方法 采用方式 实例 高以丹等 [31] 柴达木枸杞
冷冻干燥、自然阴干、热风烘干GC-IMS 从枸杞样品中鉴定出反-2-壬烯醛、2,4-庚二烯醛等52种VOCs，表明冷冻干燥法比自然阴干、热风烘干以及微波干燥更好，能够有效保留枸杞中的VOCs，使枸杞保持较高的品质。 时海燕等 [32] 六神曲
生品、炒品、焦品HS-GC-IMS 从六神曲生品、炒品和焦品中鉴别出60种化合物通过比较种类和差异，得出炒神曲比焦神曲健胃消食的效果更好。 林秀敏等 [33] 当归
酒洗、酒炙、酒浸GC-IMS 2-十一烯醛、丙酮等为酒洗与酒浸当归的主要差异性物质，2-十一烯醛、丙酮等为酒洗与酒炙当归的主要差异性物质，2-十一烯醛、辛酸乙酯等为酒浸与酒炙当归的主要差异性物质。 武旭等 [34] 胆南星
发酵炮制GC-IMS 发酵炮制有助于胆南星矫味矫臭 王雨晨等 [35] 太子参
常温晾干、晒干、热风干燥、
真空冷冻干燥GC-IMS 40 ℃热风干燥可以有效保留太子参样品中的VOCs，与晒干、晾干样品无差异，但真空冷冻干燥对太子参挥发性成分的影响较大，会造成挥发性成分以及风味的损失 焦焕然等 [36] 侧柏叶
常温晾干、晒干，热风干燥、
变温干燥GC-IMS 40 ℃和60 ℃热风干燥能够较好地保留瓜蒌样品中的核苷类和黄酮类成分 4. 与电子鼻联用
国内外也有许多采用GC-IMS与电子鼻联用对中药挥发性成分进行研究。电子鼻是一种通过模拟人嗅觉系统对检测物质进行品质评价的感官仪器，其原理是通过传感器阵列对气味分子进行检测和响应，将产生的信号经过预处理后送入模式识别系统，通过指纹图谱对挥发性成分或是气体进行定量或定性分析[37]。两种技术的联用为实验的结果研究提供了更高的准确度。
Feng等 [38]采用GC-IMS、GC-MS对不同地理标志的八种花椒的VOCs进行测定，证明了两种方法均可用于对不同花椒的分类，但相较之下GC-IMS操作时间更短，且有能够检测到含量很低物质，结果表明红花椒比青花椒能够释放出更多的萜烯、酯类和更少的醇类，同时该研究还与电子鼻联用表征花椒中的香气物质，W1W、W2W和W5S传感器对花椒样品VOCs的响应更强，说明花椒产品中可能含有更高丰度的萜烯、有机硫化物和氮氧化物。陈小爱等 [39]利用GC-MS、GC-IMS和电子鼻技术联用，分析老香黄在发酵期间的VOCs变化，GC-MS共鉴别出包括醇类等八个种类的46种VOCs，GC-IMS则检测出包括杂环类等九个类别的38种VOCs，同时电子鼻PCA有效区分了不同发酵时间的样品，发现发酵6个月后老香黄挥发性组分开始发生较大的变化，其中柠檬烯等14种是发酵期间含量较高且相对稳定的成分，发酵过程中产生的庚醛、糠醛等是构成老香黄特有气味的特征性成分。王世丽等 [40]通过电子鼻辨识南北柴胡气味特征物质与GC-IMS检测其挥发性成分，发现南北柴胡中短链烷烃、醛类等物质差异较大，癸醛、异戊烯醛等可作为南柴胡的特征物质，2-甲基丙酸、3-甲基丁醇可作为北柴胡的特征物质，此外乙酸、乙酸甲酯等成分在北柴胡中显著高于南柴胡。
5. 总结和展望
GC-IMS在中药研究中的应用前景非常广阔，不仅可以对同属不同种、不同产地来源、不同采收期以及不同贮存时间的中药VOCs进行分析鉴别，还可以帮助分析炮制前后中药VOCs含量变化以及在复方中寻找质量标志物，为药物质量控制与药效研究提供帮助。另外，随着技术的不断进步和中药现代化需求的增加，GC-IMS可以与特征图谱相结合，构建特征指纹图谱；也可以与电子鼻等其他分析手段融合，发挥出新的效果，让其所能提供的信息更加全面。但该项技术作为新兴科技仍需解决许多问题，比如应探索融合数据库的体系架构[41]。目前，GC-IMS通常使用的数据库为NIST出版的标准质谱图，对于中药VOCs的专业数据库搭建还不全面，部分VOCs需要自行判断建立文档保存入库，对实验进程造成不便。由于中药挥发性成分复杂，GC-IMS可能因峰重叠导致部分成分无法准确定性，例如分析复方丹参片时，GC-IMS仅能明确鉴定其中60%的化合物，需GC-MS辅助验证。而且GC-IMS对象单一，无法检测多糖、生物碱等非挥发性成分，难以全面评价中药质量。
总的来说，GC-IMS技术为中药研究提供了一种新的科学工具，有利于推动中药科学研究深入，也为中药产业的发展走向国际化和标准化提供支持。
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图 3 丹参FBXL 基因染色体定位及共线性分析
A. 丹参FBXL 基因染色体定位；B. 丹参FBXL 基因的共线性分析：FBXL 家族片段重复间用红色连接线连接；C. 丹参、拟南芥与南丹参物种间FBXL 家族基因共线性分析：橘黄色代表丹参染色体，绿色代表拟南芥染色体，蓝色代表南丹参染色体，红色连接线代表有不同物种间FBXL 基因存在的共线性
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[1] 马晓晶, 杨健, 马桂荣, 等. 中药丹参的现代化研究进展[J]. 中国中药杂志, 2022, 47(19):5131-5139. [2] 陈雨萌, 李倩, 刘维海, 等. 丹参活性成分治疗心血管疾病的药理作用、临床应用及不良反应研究进展[J]. 药学研究, 2023, 42(12):1028-1034. [3] 焦育强, 刘文斌, 袁夏, 等. 丹参素及其衍生物心血管作用机制的研究进展[J]. 药学实践杂志, 2015, 33(5):389-391,405. [4] 温萍, 张俊平. 隐丹参酮及其衍生物抗肿瘤活性研究进展[J]. 药学实践与服务, 2023, 41(4):207-211. [5] 杨彬, 赵文博, 张海燕, 等. 丹参资源的遗传多样性及其保护利用[J]. 寒旱农业科学, 2023, 2(11):1002-1008. doi: 10.3969/j.issn.2097-2172.2023.11.004 [6] YANG N, ZHOU W, SU J, et al. Overexpression of SmMYC2 Increases the Production of Phenolic Acids in Salvia miltiorrhiza[J]. Front Plant Sci, 2017, 8:1804. doi: 10.3389/fpls.2017.01804 [7] DENG C, HAO X, SHI M, et al. Tanshinone production could be increased by the expression of SmWRKY2 in Salvia miltiorrhiza hairy roots[J]. Plant Sci, 2019, 284:1-8. doi: 10.1016/j.plantsci.2019.03.007 [8] SADANANDOM A, BAILEY M, EWAN R, et al. The ubiquitin-proteasome system: central modifier of plant signalling[J]. New Phytol, 2012, 196(1):13-28. doi: 10.1111/j.1469-8137.2012.04266.x [9] BUCKLEY D L, CREWS C M. Small-molecule control of intracellular protein levels through modulation of the ubiquitin proteasome system[J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2014, 53(9):2312-2330. doi: 10.1002/anie.201307761 [10] SANG Y, YAN F, REN X. The role and mechanism of CRL4 E3 ubiquitin ligase in cancer and its potential therapy implications[J]. Oncotarget, 2015, 6(40):42590-42602. doi: 10.18632/oncotarget.6052 [11] XU G, MA H, NEI M, et al. Evolution of F-box genes in plants: different modes of sequence divergence and their relationships with functional diversification[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(3):835-840. doi: 10.1073/pnas.0812043106 [12] LECHNER E, ACHARD P, VANSIRI A, et al. F-box proteins everywhere[J]. Curr Opin Plant Biol, 2006, 9(6):631-638. doi: 10.1016/j.pbi.2006.09.003 [13] CUI H R, ZHANG Z R, LV W, et al. Genome-wide characterization and analysis of F-box protein-encoding genes in the Malus domestica genome[J]. Mol Genet Genomics, 2015, 290(4):1435-1446. doi: 10.1007/s00438-015-1004-z [14] JIA F, WU B, LI H, et al. Genome-wide identification and characterisation of F-box family in maize[J]. Mol Genet Genomics, 2013, 288(11):559-577. doi: 10.1007/s00438-013-0769-1 [15] GUPTA S, GARG V, KANT C, et al. Genome-wide survey and expression analysis of F-box genes in chickpea[J]. BMC Genomics, 2015, 16(1):67. doi: 10.1186/s12864-015-1293-y [16] WANG G M, YIN H, QIAO X, et al. F-box genes: Genome-wide expansion, evolution and their contribution to pollen growth in pear(Pyrus bretschneideri)[J]. Plant Sci, 2016, 253:164-175. doi: 10.1016/j.plantsci.2016.09.009 [17] YAN J, ZHANG C, GU M, et al. The Arabidopsis CORONATINE INSENSITIVE1 protein is a jasmonate receptor[J]. Plant Cell, 2009, 21(8):2220-2236. doi: 10.1105/tpc.109.065730 [18] SHEARD L B, TAN X, MAO H, et al. Jasmonate perception by inositol-phosphate-potentiated COI1-JAZ co-receptor[J]. Nature, 2010, 468(7322):400-405. doi: 10.1038/nature09430 [19] CHINI A, BOTER M, SOLANO R. Plant oxylipins: COI1/JAZs/MYC2 as the core jasmonic acid-signalling module[J]. FEBS J, 2009, 276(17):4682-4692. doi: 10.1111/j.1742-4658.2009.07194.x [20] ZHANG C, LEI Y, LU C, et al. MYC2, MYC3, and MYC4 function additively in wounding-induced jasmonic acid biosynthesis and catabolism[J]. J Integr Plant Biol, 2020, 62(8):1159-1175. doi: 10.1111/jipb.12902 [21] LEE S H, SAKURABA Y, LEE T, et al. Mutation of Oryza sativa CORONATINE INSENSITIVE 1b(OsCOI1b)delays leaf senescence[J]. J Integr Plant Biol, 2015, 57(6):562-576. doi: 10.1111/jipb.12276 [22] PIISILA M, KECELI M A, BRADER G, et al. The F-box protein MAX2 contributes to resistance to bacterial phytopathogens in Arabidopsis thaliana[J]. BMC Plant Biol, 2015, 15:53. doi: 10.1186/s12870-015-0434-4 [23] PARRY G, CALDERON-VILLALOBOS L I, PRIGGE M, et al. Complex regulation of the TIR1/AFB family of auxin receptors[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(52):22540-22545. doi: 10.1073/pnas.0911967106 [24] NAVARRO L, DUNOYER P, JAY F, et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling[J]. Science, 2006, 312(5772):436-439. doi: 10.1126/science.1126088 [25] SI-AMMOUR A, WINDELS D, ARN-BOULDOIRES E, et al. miR393 and secondary siRNAs regulate expression of the TIR1/AFB2 auxin receptor clade and auxin-related development of Arabidopsis leaves[J]. Plant Physiol, 2011, 157(2):683-691. doi: 10.1104/pp.111.180083 [26] KIM Y Y, CUI M H, NOH M S, et al. The FBA motif-containing protein AFBA1 acts as a novel positive regulator of ABA response in Arabidopsis[J]. Plant Cell Physiol, 2017, 58(3):574-586. doi: 10.1093/pcp/pcx003 [27] STEFANOWICZ K, LANNOO N, ZHAO Y, et al. Glycan-binding F-box protein from Arabidopsis thaliana protects plants from Pseudomonas syringae infection[J]. BMC Plant Biol, 2016, 16(1):213. doi: 10.1186/s12870-016-0905-2 [28] REMANS T, SMEETS K, OPDENAKKER K, et al. Normalisation of real-time RT-PCR gene expression measurements in Arabidopsis thaliana exposed to increased metal concentrations[J]. Planta, 2008, 227(6):1343-1349. doi: 10.1007/s00425-008-0706-4 [29] WATERMAN P G. Roles for secondary metabolites in plants[J]. Ciba Found Symp, 1992, 171:255-269. [30] AN J P, LI R, QU F J, et al. R2R3-MYB transcription factor MdMYB23 is involved in the cold tolerance and proanthocyanidin accumulation in apple[J]. Plant J, 2018, 96(3):562-577. doi: 10.1111/tpj.14050 [31] JAIN M, NIJHAWAN A, ARORA R, et al. F-box proteins in rice. Genome-wide analysis, classification, temporal and spatial gene expression during panicle and seed development, and regulation by light and abiotic stress[J]. Plant Physiol, 2007, 143(4):1467-1483. doi: 10.1104/pp.106.091900 [32] JIA Q, XIAO Z X, WONG F L, et al. Genome-wide analyses of the soybean f-box gene family in response to salt stress[J]. Int J Mol Sci, 2017, 18(4):818. [33] KURODA H, TAKAHASHI N, SHIMADA H, et al. Classification and expression analysis of Arabidopsis F-box-containing protein genes[J]. Plant Cell Physiol, 2002, 43(10):1073-1085. doi: 10.1093/pcp/pcf151 [34] 左蓉, 吴姗, 刘杰, 等. 油菜F-box-LRR基因全基因组鉴定与核盘菌诱导应答分析[J]. 中国油料作物学报, 2022, 44(3):503-514. [35] CHANG W, QIAO Q, LI Q, et al. Non-transcriptional regulatory activity of SMAX1 and SMXL2 mediates karrikin-regulated seedling response to red light in Arabidopsis[J]. Mol Plant, 2024, 17(7):1054-1072. doi: 10.1016/j.molp.2024.05.007 [36] NIBAU C, GIBBS D J, BUNTING K A, et al. ARABIDILLO proteins have a novel and conserved domain structure important for the regulation of their stability[J]. Plant Mol Biol, 2011, 75(1-2):77-92. doi: 10.1007/s11103-010-9709-1 [37] GIBBS D J, VOSS U, HARDING S A, et al. AtMYB93 is a novel negative regulator of lateral root development in Arabidopsis[J]. New Phytol, 2014, 203(4):1194-1207. doi: 10.1111/nph.12879 [38] DING Z J, XU C, YAN J Y, et al. The LRR receptor-like kinase ALR1 is a plant aluminum ion sensor[J]. Cell Res, 2024, 34(4):281-294. doi: 10.1038/s41422-023-00915-y [39] ZHU S, PAN L, VU L D, et al. Phosphoproteome analyses pinpoint the F-box protein SLOW MOTION as a regulator of warm temperature-mediated hypocotyl growth in Arabidopsis[J]. New Phytol, 2024, 241(2):687-702. doi: 10.1111/nph.19383 [40] PAN T, GAO S, CUI X, et al. APC/CCDC20 targets SCFFBL17 to activate replication stress responses in Arabidopsis[J]. Plant Cell, 2023, 35(2):910-923. doi: 10.1093/plcell/koac360 [41] van den BURG H A, TSITSIGIANNIS D I, ROWLAND O, et al. The F-box protein ACRE189/ACIF1 regulates cell death and defense responses activated during pathogen recognition in tobacco and tomato[J]. Plant Cell, 2008, 20(3):697-719. doi: 10.1105/tpc.107.056978 -
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