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西红花，为鸢尾科多年生植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等功效 [1]。番红花是三倍体不育植物，只能通过被称为球茎的块状球茎无性繁殖。西红花的产量和品质与球茎大小直接相关 [2]。而球茎中包含的有机酸、脂肪酸、萜类等化合物 [3]与球茎生长代谢过程密切相关，并在很大程度上影响球茎的大小。然而，目前球茎中内源性代谢物的分析方法均需要将样本进行匀浆后检测，这就会造成空间信息的丢失，无法实现原位分析。因此，利用新的技术手段研究番红花球茎中内源性代谢物的空间分布规律至关重要。
解吸电喷雾电离质谱成像（DESI-MSI）无需复杂的预处理步骤，可直接对样品进行可视化分析 [4]。目前已在解析植物内源性代谢物的空间定位方面显示出强大的分析能力。本研究通过优化切片厚度，建立了一种灵敏、高覆盖的质谱成像分析方法，以可视化番红花球茎中内源性代谢物在不同产地及同一产地不同部位的空间分布，实现了番红花球茎中黄酮、有机酸、氨基酸、类胡萝卜素和环烯醚萜苷的原位表征。为探究番红花全生命周期内的生长过程和开展番红花球茎种质筛选提供了新的技术支持。
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1900-冷冻切片机（浙江益迪医疗科技有限公司）；SYNAPT G2-Si HDMS质谱成像仪、HD Imaging 质谱成像数据分析软件 （Waters公司）；标准级显微镜载玻片（上海泰坦科技股份有限公司）。
OCT 包埋剂（美国樱花SAKURA 公司）；甲醇（HPLC级，美国Merck公司）。
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番红花球茎分别购自上海崇明、浙江建德和安徽亳州西红花种植合作社，批号分别为20230901SH、20230830ZJ、20230830AH，经海军军医大学韩婷教授鉴定。将新鲜球茎置于冷冻切片机中预冷30 min之后，用OCT包埋剂固定于切片机样品托上。连续切片，分别制备成20、30、40、50 μm的切片，黏附于载玻片上，在室温下干燥20 min后备用。
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将准备好的组织切片置于X轴和Y轴二维操控台上，使用SYNAPT G2-Si HDMS质谱成像仪在正离子模式下进行检测。检测的质荷比（m/z）范围设定为50~650；空间分辨率为200 μm；施加在电喷雾针上的电压为3.0 kV；电喷雾针与二维操控台的角度为38°；离子传输管温度为100 ℃；二维操控平台移动速度为200 μm/s。质谱成像原始数据文件利用HD imaging软件转化成图片，用总离子流图进行归一化。
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组织切片是获得高质量质谱成像图像的关键步骤 [5]。组织切片的厚度会影响切片的完整性，如果碎裂就无法获得完整的空间分布图像 [6]。质谱成像在动物、人体内源性代谢物的可视化分布研究起步较早。对于哺乳动物组织，推荐5~20 μm作为检测低分子量的最优厚度 [7]。然而受限于植物组织富含水分，组织容易破碎的特点，难以制成薄片。为了获得高质量质谱图片，本研究进行了切片厚度的优化。在番红花球茎中，除了水分之外，淀粉是其干物质的重要组成之一 [8]，因此切片时成形性较差，极易造成组织破碎、结构不完整。本研究选用在20~50 μm之间的浙江建德球茎，以10 μm为梯度，进行了4个不同的切片厚度探索。结果表明，切片厚度为20 μm时，顶芽部位存在大部分缺失，球茎部分也存在部分碎裂；30 μm和40 μm时，顶芽的部位切片完整，但球茎部分仍然不完整，其中40 μm球茎完整度好于30 μm；而50 μm切片整体完整度较高，能良好的呈现球茎和顶芽形态（图1）。因此本研究选择50 μm切片厚度进行后续质谱成像检测。
图 1 不同切片厚度的优化
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使用优化的条件直接进行DESI-MSI检测，获得球茎切片在正离子模式下的平均质谱图，如图2所示，可以观测到丰富的信号峰，其中，m/z 范围在150~400之间信号丰度较高，在450~650范围内也观察到不少代谢物，但是丰度较低。用总离子流图进行归一化后在HD imaging软件中提取质荷比，结合数据库和已报道文献检索，共获得了66种化合物的空间分布信息。其中，观察到代谢物在球茎的不同部位具有不同的分布特征。
图 2 番红花球茎在正离子模式下的DESI质谱图
值得关注的是，芹菜素7-（6''-O-乙酰基）-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷几乎只分布在顶芽中；芹菜素7-O-二葡糖醛酸同样主要分布在顶芽中，球茎部分也有少量分布（图3）。蜀黍氰苷是广泛分布于植物界的一种含氮化合物，通过在食草动物的组织破裂时释放氰化氢而起到化学防御作用 [9]。在萌发的高粱种子中，发现蜀黍氰苷主要积累在萌发的胚芽中 [10]。本研究中观察到蜀黍氰苷主要在番红花球茎萌发的顶芽中分布，与文献报道一致，其分布的特异性可能是由于对抗食草动物从而保护新兴的组织。黄酮类化合物作为中药成分的重要药效部分，具有一定的抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡等作用 [11]。异鼠李素-3-O-葡萄糖苷在西红花中已有检测，本次发现其在顶芽中丰度较高，推测与芽承担运输功能有关。
图 3 浙江建德番红花球茎中不同部位代表性代谢物的质谱成像图
在球茎中，主要观察到氨基酸和部分次生代谢物的分布，如L-瓜氨酸、苯乙酰甘氨酸、紫苜蓿酚和栀子苷等均只特异性分布在球茎中（图3）。氨基酸作为一种重要的初生代谢物，不仅在植物生长发育过程中发挥着不可或缺的角色，还是生物碱合成的重要前体 [12]。因球茎是番红花的营养器官，故氨基酸主要积累于球茎部位，为其生长提供所需物质和能量。
某些化合物在顶芽和球茎中均可以观察到，如咖啡酸3-葡萄糖苷、咖啡酰基酪氨酸、迷迭香酸和牡荆素（图3）。有趣的是，酪氨酸除了分布于球茎部分，在顶芽中也有不少分布。研究表明，酪氨酸参与植物色素合成且是生物碱合成的重要前体 [12]，其在球茎和顶芽中均有分布，说明球茎在萌发过程中已经开始色素和生物碱合成的准备。
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总体来说，大多数化合物都呈现出一致的分布规律。对于在球茎部位分布的化合物来说，在上海的球茎中丰度最高，浙江次之，安徽最低，但是浙江球茎检测到的化合物种类最多。此外，我们还观察到了某些化合物在不同产地具有不同的分布规律。如栀子苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷和芹菜素7-（6''-O-乙酰基）-葡萄糖苷在上海球茎中未观察到分布，而异鼠李素-3-O-葡萄糖苷在安徽球茎中未观察到分布（图4）。番红花喜凉怕酷热、怕严寒、喜湿润，对生长环境要求较高 [13]。上海崇明地处中国最大河流长江入海口，气候温和湿润，年平均气温16.5 ℃，年平均降雨量1128.9 mm；浙江建德年平均气温17.8 ℃，年降水量1905.1 mm，气候同样温暖湿润；而安徽亳州年平均气温14.9 ℃，属温带半湿润气候区，年平均降雨量仅831 mm。与安徽亳州相比，上海崇明和浙江建德的气候特点显然更适于番红花生长。同时，从光学照片可以发现，浙江球茎的顶芽分化早于上海和安徽球茎，这可能是浙江球茎内代谢物较为丰富的原因之一。
图 4 不同产地番红花球茎中代表性代谢物的质谱成像图
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本文通过优化切片厚度，利用DESI质谱成像技术对不同产地番红花球茎内源性代谢物的分布特征进行了可视化研究，实现了黄酮、类胡萝卜素、氨基酸和有机酸的原位表征。不同化合物在球茎不同部位显示出不同分布，其中蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、芹菜素衍生物主要分布于顶芽中，而作为能量和物质供应的氨基酸则主要积累在球茎。此外，不同产地的番红花球茎也存在较大差异。从成像丰度来看，上海的球茎物质丰度较高，其次是浙江，安徽丰度最低。就化合物的分布规律而言，大部分代谢物在不同产地球茎中分布是一致的，但也观察到了一些差异。如栀子苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷和芹菜素7-（6''-O-乙酰基）-葡萄糖苷在上海未观察到分布，而异鼠李素-3-O-葡萄糖苷仅在上海和浙江产地观察到分布。我们推测，这可能是由于不同地域的温度、湿度等环境因素所致。本研究首次可视化了不同产地番红花球茎中不同物质在不同部位的分布特征，为探究番红花全生命周期内的生长过程和开展番红花球茎种质筛选提供了新的技术支持。
Analysis of tissue distribution of metabolites in Crocus sativus L. corms based on DESI mass spectrometry imaging technique
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摘要:
目的 探究不同产地番红花球茎中内源性代谢物的分布特征。 方法 利用解吸电喷雾（DESI）质谱成像技术，通过优化样品前处理，建立了一种对番红花球茎内源性代谢物可视化分析的方法。 结果 实现了黄酮、有机酸、氨基酸、类胡萝卜素和环烯醚萜苷等代谢物的原位表征；L-瓜氨酸、苯乙酰甘氨酸、紫苜蓿酚和栀子苷等特异性分布在球茎中；芹菜素7-（6''-O-乙酰基）-葡萄糖苷、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷、芹菜素7-O-二葡糖醛酸主要分布在顶芽中；对于在球茎部位分布的化合物，产于上海的番红花球茎丰度最高，浙江次之，安徽最低。 结论 番红花球茎在不同产地及同一产地不同部位的代谢物分布存在显著差异，黄酮和黄酮衍生物如异鼠李素-3-O-葡萄糖苷、芹菜素衍生物主要分布于顶芽中，此外，天然植物保护剂蜀黍氰苷6'-葡萄糖苷也主要在顶芽分布，而作为能量和物质供应的氨基酸则主要积累在球茎。 Abstract:Objective To explore the distribution characteristics of endogenous metabolites in Crocus sativus L. corms from different origins. Methods A method based on desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging and optimized sample pretreatment was developed for directly visualize metabolites in C. sativus corms. Results In situ characterization of metabolites such as flavonoids, organic acids, amino acids, carotenoids, and cyclic enol ether terpene glycosides was achieved. L-Citruline, phenylacetylglycine, sativol, and geniposide were specifically distributed in the corms. Apigenin 7-（6''-O-acetyl）-glucoside, isorhamnetin-3-O-β-D-Glucoside, dhurrin 6'-glucoside, and Apigenin 7-O-diglucuronide were mainly distributed in the terminal bud. For compounds distributed in the corms, the highest abundance was found in corms from Shanghai, followed by Zhejiang and the lowest from Anhui. Conclusion The distribution of metabolites in different parts of C. sativus corms from different origins and the same origin varies significantly. Flavonoids and flavonoid derivatives such as isorhamnetin-3-O-β-D-Glucoside and apigenin derivatives are mainly distributed in the terminal buds, in addition, the natural plant protection agent dhurrin 6'-glucoside is also mainly distributed in the terminal corms, whereas amino acids, which are used as energy and material supplies, are mainly accumulated in the corms. -
脑血管疾病是仅次于心脑血管疾病和癌症的第三大病症，其中脑缺血是常见的脑血管疾病之一。脑缺血的患病率和死亡率仍处于上升趋势，严重影响人们的健康。目前，西医对于脑缺血的主要治疗方式是溶栓和取栓，但有严格的溶栓时间窗和较大的取栓风险，并且缺血后造成神经功能的损伤没有有效的药物治疗[1]。中医药在脑缺血的预防和治疗中具有潜在作用，以气虚为本、血瘀为标作为主要病因[2]。查阅近几年文献发现，益气活血化瘀方药在防治脑缺血中表现出多方面和整体调节的优势。
参麻颈复方是临床名老中医经验方，临床应用发现具有活血通络，益气养血，宁神安脑，健筋壮骨之效。该方由首乌藤、丹参、山茱萸（制）、天麻、当归、川芎等组成，临床应用广泛。首乌藤有养血安神、祛风通络之效[3]，丹参有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之效[4]，当归有补血调经、活血散寒、消肿止痛生肌、润肠通便之效[5]，川芎、陈皮的补气之效辅佐以上药物活血功效运行，而且川芎具有活血化瘀之效，是传统中医防治中风选择最多的配方之一[6]。本研究评估参麻颈复方对小鼠脑缺血损伤的改善作用，并进一步探讨其对骨髓来源内皮祖细胞干预发挥防治脑缺血损伤的机制，为中药方剂治疗脑缺血提供新的思路、寻找新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器及试剂
细胞培养箱（Thermo公司）；倒置荧光显微镜（Leica 公司）；Odssey红外荧光显像（Li-Cor公司）；酶标仪（芬兰 Labsystens Dragon 公司）；涡旋混合器（江苏天翎仪器有限公司）；超净台（苏州净化设备有限公司）；电子天平JA2003（上海天平仪器厂）。 参麻颈复方颗粒（岳阳医院自制制剂，批准文号：沪药制字Z05050324）；尼莫地平片（天津市中央药业有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京西浓科技有限公司）；VEGF抗体（abcam公司）；BDNF抗体（abcam公司）；GAPDH内参抗体（abcam公司）；Tubulin内参抗体（abcam公司）；内皮细胞培养基（EGM-2 Single Quots，Lonza公司)；波连蛋白（vitronection，BD公司）。
1.2 实验动物及分组
实验动物为SPF级C57BL/6雄性小鼠30只（上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证：SCXK（沪）2017-0012），体重为18-20 g，6-7周龄。适应性饲养1周后，将30只小鼠随机分为模型对照组（Control组）、参麻颈组（SMJ组）、尼莫地平组（NMDP组），10只/组。实验过程中对于实验小鼠的所有处理均符合伦理学规定。
1.3 实验方法
1.3.1 制备动物模型
采用电凝法制备局灶性脑缺血模型[7]，用浓度为12%的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射，剂量控制在350 mg/kg。小鼠麻醉后，仰卧位固定在手术台。借助显微镜，用显微镊沿颞肌纤维束的方向钝性分离肌肉，直到颧骨及麟骨暴露，显微镊夹住颧骨固定小鼠头部，用牙科钻重点打磨颧骨和麟骨的交叉部位，骨壳变薄并有裂缝时，停止打磨，用撬棒沿已暴露的动脉血管剥离骨片，直至小鼠左侧大脑中动脉与伴行的迷走神经分叉暴露；在显微镜下，找准纹状体外侧动脉近心端，用双极电凝器凝断左侧大脑中动脉后，将电凝器缓慢移出，显微镜下再次确认是否凝断。最后用显微镊将皮肤和肌肉归置原位，以便于缝合。小鼠完全苏醒后，观察精神状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，即为造模成功。
参麻颈组在手术前通过灌胃方式给予6.88 g∙kg−1的参麻颈复颗粒；尼莫地平组给予2.16 mg/kg溶液灌胃；模型对照组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共14 d。
1.3.2 神经行为学功能评分
术后第3 d，由观察者在不知分组情况下记录神经行为学表现，并采用参考文献[7]评分方法，如提尾悬空试验等[8]，评估神经行为学功能评分。
提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠重复提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠测20次，并且每次测定的时间间隔不少于1 min，以保证小鼠得到充足的休息。小鼠的偏转率计算按以下公式：摆动频率（%）=（T−10）/10×100%。
T为实验小鼠头部向手术对侧偏转的次数。
平衡木试验：记录小鼠由木棍一端顺利通过平衡木80%长度所用的时间。在正式试验前对小鼠进行3次训练，正式试验时每只小鼠重复测定3次，对每只小鼠均间隔5 min后进行下一次实验。
1.3.3 脑组织TTC染色
行为学评分测完后，小鼠脱颈处死，取脑组织，放1×PBS中清洗干净，将脑组织放在脑片模具中，共切7片，每片2 mm，放2%的TTC溶液中，并在37 ℃水浴锅中染色10 min，染色结束后放4%多聚甲醛固定6 h，按照脑片大小顺序排好拍照，脑片使用Image J统计软件测定小鼠的脑梗死体积。
1.3.4 细胞功能测定
取脑组织的同时，提取小鼠骨髓来源内皮祖细胞，培养至第7d时，收集和处理细胞，对细胞黏附、迁移及形成小管能力进行测定。
细胞黏附实验：用胰酶消化细胞,按照3×105个/ml细胞接种于预先包被人纤维粘连蛋白的96孔板中，在细胞培养箱中培养5 h后弃掉未黏附细胞，再用4%多聚甲醛固定，以Hochest 33258染料染色后于倒置显微镜下拍照。
细胞迁移实验：调整细胞浓度3×105个/ml，Transwell小室置于24孔板，按分组下室加600 μl配好的下室溶液，细胞悬液接种于上室各100 μl,置培养箱内培养24 h，用PBS清洗2次，弃上清液，在2%多聚甲醛固定15 min。弃上清，PBS清洗2次，上室转移至含600 μl Hochest 33258染料的孔中，避光染色15 min。弃上清，PBS浸泡5 min,弃上清，光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组迁移细胞数。
小管形成实验：调整各组细胞至3×105个/ml，每孔100 μl的细胞悬液加到铺有基质胶的孔中，最后将96孔板移至培养箱孵育6 h，在光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组小管形成数量。
1.3.5 Western blot检测
细胞样本同“1.3.4”项中相同来源，六孔板放在冰枕上，用预冷PBS润洗细胞两次，弃上清液；向板内加入60 μl已配置好的细胞裂解液，在冰枕上裂解15 min，收集细胞液转移至1.5 ml EP管中，使用高速离心机在12 000 r/min，4 ℃离心15 min，将离心后的上清液收集到新的离心管中并放到−80 ℃冰箱保存。应用紫外分光光度计测量蛋白浓度后，进行蛋白定量，95 ℃ 5 min蛋白灭活后，−20 ℃保存待用。SDS-PAGE凝胶电泳：初始电压调为50 V，电泳至Marker中红色条带分离出，将电压调为 120 V，直至Marker显示跑到胶的底部时停止电泳。转膜：恒流200 mA转膜，不同目的蛋白按其分子量大小设置转膜时间。封闭：用5%脱脂牛奶封闭1 h。封闭之后用1%牛奶配置的一抗4 ℃孵育过夜。第2天，用1%牛奶配制的二抗室温孵育1 h，NC膜放到Odyssey扫膜仪上进行扫描，保存扫描照片，使用Quantity One软件统计蛋白的灰度值。
1.4 统计学处理
使用Graphpad prism 5.0分析数据。实验数据均以（
$ \bar x $ ±s）表示，两组之间的差异采用非配对T检验进行分析，多组数据间的差异采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 各组小鼠神经功能学评分
小鼠造模成功后出现明显的神经功能障碍，表现为站立不稳、左前肢屈曲内收，肌张力下降。与对照组比较，尼莫地平组小鼠的神经功能有明显改（P<0.01）；与对照组比较，参麻颈组小鼠的爬杆时间（P<0.05）和对侧偏转率（P<0.01）均有显著降低，表明小鼠给予参麻颈复方后，能有效保护缺血后神经功能的缺损（图1）。
2.2 各组小鼠脑梗体积变化
用TTC染色后结果显示：对照组小鼠术后脑组织出现明显的梗死灶。与对照组比较，给参麻颈组小鼠脑缺血后脑梗体积显著减少（P<0.01）；给予尼莫地平的小鼠与参麻颈组相比，其脑梗体积虽有减少，但无统计学差异（图2）。 2.3 各组小鼠内皮祖细胞黏附功能比较
细胞黏附实验结果显示：对照组相比于另外两组，黏附细胞数目减少。预先给予参麻颈的小鼠，在发生脑缺血后，小鼠骨髓来源内皮祖细胞黏附于96孔板中细胞数目，明显高于对照组（P<0.01）；给予尼莫地平组，其细胞数目也比对照组增多（P<0.01）；而尼莫地平组和参麻颈组两组的差异无统计学意义（图3）。 2.4 各组小鼠内皮祖细胞迁移功能比较
迁移实验结果显示：与参麻颈组和尼莫地平组比较，模型对照组细胞迁移至Transwell板上室下面的数目可见减少。与对照组比较，给予参麻颈复颗粒后的脑缺血小鼠，其骨髓来源内皮祖细胞迁移数显著增加（P<0.05）；给予尼莫地平的小鼠与对照组比较，其迁移细胞数目增加（P<0.01）；参麻颈组和尼莫地平组，两组结果有差异但无统计意义（图4）。 2.5 各组小鼠内皮祖细胞形成小管能力比较
从图中可看出，对照组小鼠内皮祖细胞形成小管的数目减少。与对照组比较，参麻颈组内皮祖细胞形成小管数目有明显增加（P<0.05），尼莫地平组小管形成数目更为突出（P<0.01）；尼莫地平组形成的小管状态也优于参麻颈组（图5）。
2.6 各组小鼠内皮祖细胞中相关蛋白的表达水平
Western blot检测结果显示：与对照组比较，参麻颈组（P<0.01）和尼莫地平组（P<0.01）小鼠内皮祖细胞内BDNF蛋白表达增加，而参麻颈组和尼莫地平组之间结果差异无统计学意义（图6）。
3. 讨论
缺血性中风是一种以动脉粥样硬化为基础的中枢系统不可逆损伤；它是由阻塞颈内动脉、椎动脉或者脑血管的血栓形成引起的，这一过程减少了血液供应，导致细胞代谢紊乱和衰老，并进一步导致血管内皮损伤[9-10]。脑缺血后导致严重的脑损伤，并造成神经功能障碍，包括偏瘫、肢体痉挛和认知障碍等，从而降低患者的生活质量[11]。目前，西医临床治疗存在局限性，使得该疾病的残疾率仍然很高，以及带来的社会经济负担也在继续增加。中医药博大精深，很多研究者一直都在致力于寻找改善脑缺血所致神经功能障碍的中医疗法。
中医典籍《伤寒杂病论》早就将活血化瘀中药或中药复方用于缺血性疾病的治疗。活血化瘀中药复方通过多靶点、多途径的作用方式发挥整体性作用。现代研究方法——代谢组学、基因组学、蛋白质组学等为中药复方作用机制的阐述提供强有力的支持。前期相关研究显示，在传统中药中，发现许多成分可以促进血管的生成，如丹参酮，川芎嗪，三七总皂苷等[12-14]，这些是方剂中常用的中药，也是活血化瘀类草药的代表。而参麻颈复方中，大部分的中药具有活血化瘀作用，是否能够改善骨髓来源内皮祖细胞功能，又能否促进脑缺血损伤后的新血管的生成，需要进一步验证。
本研究中，参麻颈复方颗粒预处理后，小鼠脑缺血所致的神经行为学功能评分显著改善；TTC染色梗死体积也显著减少（P<0.01）。证明参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤具有保护作用，可改善神经功能和减小缺血梗死体积。
越来越多的临床前研究表明[15]，无论是缺血性脑卒中急性期还是慢性期，均会导致炎症和脑组织不可逆转的损伤。因此，为了减轻缺血组织的病理损伤，修复内皮功能障碍引起的血管损伤成为缺血性脑卒中治疗的主要方向。骨髓来源内皮祖细胞是内皮愈合和血管生成的关键效应因子。内皮祖细数量减少、内皮功能障碍与心血管事件风险增加息息相关[16]，这与内皮祖细胞介导的血管修复受损致使血管疾病进展是一致的[17]。为了响应缺血信号和血管损伤,骨髓来源的内皮祖细胞被动员到循环中并募集到内皮损伤部位，从而形成新生血管，这也是一种自然的防御机制[18]。
第二部分实验研究了参麻颈复方颗粒对脑缺血损伤小鼠内皮祖细胞的保护作用。结果显示，小鼠脑缺血损伤后，来自骨髓的内皮祖细胞黏附在96孔板和迁移至Transwell板下室的数目有显著减少，给予参麻颈复方颗粒预处理后，黏附细胞数目（P<0.01）和迁移细胞数目（P<0.05）均有明显增加。另外，脑缺血损伤可影响血管新生的速度和质量，表现为内皮祖细胞形成小管的能力，包括形成小管的数量和小管长度。本研究的结果中，参麻颈复方颗粒显著增加脑缺血损伤小鼠的内皮祖细胞形成小管的数量和长度（P<0.05）。
神经营养因子是一组对神经系统的发育、生长、存活和分化至关重要的蛋白质[19]。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经系统中含量最丰富、分布最广的神经营养因子。血管内皮细胞合成并分泌BDNF，并通过刺激其原肌球蛋白受体激酶B促进神经系统中的细胞分化、细胞生长、突触形成和神经发生[20-21]。重要的是，BDNF在缺血性和创伤性脑损伤后表现出许多神经保护特性[22]。BDNF通过促进新生血管、调节内皮一氧化氮生成和抑制凋亡来改善内皮细胞功能障碍[23]。
第三部分实验深入探讨了参麻颈复方颗粒保护小鼠脑缺血损伤的作用，结果显示，小鼠脑缺血后，大脑受到损伤，内皮祖细胞中BDNF蛋白表达显著降低，内皮祖细胞功能受损；参麻颈复方颗粒干预后，BDNF蛋白表达水平显著增加（P<0.01），细胞功能得以改善。这与二甲双胍上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中BDNF的表达逆转高糖状态下的细胞损伤相同[23]。由于BDNF蛋白表达的增加，脑缺血小鼠的神经功能得到改善，脑梗死体积减小。
综上所述，参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤有保护作用，这一作用可能与促进内皮祖细胞中脑源性神经因子BDNF蛋白表达，改善内皮祖细胞功能有关。我们这一研究为参麻颈复方颗粒在心血管疾病的治疗提供了新视角，并进一步验证了在心脑血管疾病治疗领域的应用，这可能减缓疾病的进展和改善预后。
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