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银屑病是受遗传与环境影响[1]的由免疫介导[2]的一种慢性、炎症性皮肤病，患者症状常表现为暗红色斑块或浸润性红斑，上覆有白色、层状鳞屑，有蜡滴、薄膜、点状出血等，又称为牛皮癣、白疕。其病理组织在显微镜下呈现表皮层异常增厚、颗粒层变薄或缺失、毛细血管扩张和炎症细胞浸润等特征[3]。据统计，全球约有1.25亿人受银屑病影响[4]，发病率呈逐年递增趋势，患者还常伴有心血管疾病、代谢性疾病、精神性疾病和免疫性疾病等合并共病，这些共病不仅影响患者的生活质量，还增加了治疗的难度和复杂性[5]。治疗银屑病存在周期长、易复发等难点，临床治疗主要以缓解患者症状、抑制病情复发及减少共病并发为主[6]。
目前，银屑病的治疗方法包括外用药物、口服药物、生物制剂、光疗法等。轻中度患者常单独外用润肤剂、糖皮质激素、维生素D3衍生物、维A酸类、钙调磷酸酶抑制剂和生物制剂等药物；中重度患者则多系统治疗，如联用糖皮质激素与维生素D3衍生物类等外用药物，口服甲氨蝶呤、环孢素、维A酸类、糖皮质激素等制剂，皮下注射生物制剂及结合光疗法、辅助疗法等[7]。然而，以上治疗方法疗效有限，长期使用可能诱发局部皮肤萎缩、酒渣鼻及依赖性等不良反应，因此，寻求安全、有效、延长复发的药物是治疗银屑病的难点。对此中医药具有辨证论治、副作用小、疗效显著及性价比高等优势。
近年来，多项临床研究表明，中药狼毒口服、外用均可有效治疗银屑病；其提取物可缓解疼痛、促进创面愈合，具有良好的抑菌、抗炎活性[8]。但狼毒的基源和药效物质尚不明确，阻碍了其临床应用。据记载，自西汉以来，药用狼毒以瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒（Stellera chamaejasme L.）或大戟科大戟属植物狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud.）、甘肃大戟（Euphorbia kansuensis Prokh.）的干燥根为主[9-10]，上述三种基源的狼毒均有临床应用。为了探究三种狼毒在临床上的疗效差异，本研究拟通过构建 IMQ 诱导的银屑病样小鼠模型，以醇提取物的方式，探究三种狼毒对银屑病的防治作用。
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SPF级雄性BALB/c小鼠36只，8 周龄，体质量约22～25 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物质量合格证号：20220004035001；实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2022-0004。 本实验经上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院实验动物伦理委员会批准。小鼠于上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院动物房适应性喂养１周后开始实验。
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瑞香狼毒（采自河北保定）、狼毒大戟（采自东北吉林）和甘肃大戟（采自甘肃兰州）经上海中医药大学朱建勇副主任药师鉴定为Stellera chamaejasme L.、Euphorbia fischeriana Steud.及Euphorbia kansuensis Prokh.）；凡士林[联合利华（中国）有限公司，规格：100 g]；5%咪喹莫特乳膏（四川明欣药业有限责任公司，规格：3 g/支）；卡泊三醇软膏（爱尔兰利奥制药有限公司，规格：30 g：1.50 mg）；95%乙醇（规格：20 kg/塑桶）、二甲苯（规格：500 ml）和30% 双氧水（H2O2，规格：500 ml），均购于国药集团化学试剂有限公司；4% 多聚甲醛固定液（上海碧云天生物技术股份有限公司，规格：100 ml）；苏木素-伊红染色剂试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，规格：100 ml）；柠檬酸抗原修复液（规格：1 L，pH 6.0，即用型），Anti-Ki67 小鼠单克隆抗体（规格：50 μl）、PBS缓冲液（规格：500 ml，pH 7.4，即用型）、牛血清白蛋白（BSA，规格：100 g）和DAB显色试剂盒（规格：200 T），均购于武汉赛维尔生物科技有限公司；超纯水（实验室自制）。
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BF-08小型高速粉碎机（河北本辰科技有限公司）；HDM-500恒温电热套（上海精密仪器仪表有限公司）；N-
1300 旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；EG1150H石蜡包埋机、RM2016切片机（德国徕卡仪器有限公司）；VS200全玻片扫描仪（日本奥林巴斯有限公司）；Heal Force SMART-N 超纯水机（香港力康生物医疗科技控股有限公司）。 -
将适量瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟的干燥根粉碎成粗粉，各取50 g加至回流提取装置中，用4倍量95％乙醇回流提取3次，每次1 h。将提取液过滤、合并，减压蒸馏回收乙醇，分别得瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟浸膏5.61 g、6.41 g和7.04 g。取适量浸膏，加超纯水制成生药含量为1 g/ml的醇提取物溶液，高压灭菌后备用。
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实验所用的BALB/c雄性小鼠，适应性喂养1周后，背部剃毛约2 cm × 3 cm面积，次日起，除空白组小鼠背部涂抹凡士林外，其余各组小鼠背部均匀涂抹 5% 咪喹莫特软膏，每次涂抹62.5 mg，每日1次，连续7 d。
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将36只小鼠随机分为空白组、模型组、瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组，每组6只。自造模第1 d起，除空白组和模型组外，其余各组小鼠背部在涂抹造模药4 h后，基于Selenge[11]、Wang[12]及徐[13]等人的报道及前期动物预实验结果，按0.4 ml/10 g分别涂抹浓度稀释至2.5 mg/ml的瑞香狼毒醇提取物、狼毒大戟醇提取物、甘肃大戟醇提取物溶液及62.5 mg卡泊三醇软膏，每日1次，连续7 d。
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每日拍照记录小鼠背部的皮肤变化。并采用 PASI 评分，按照无（0分）、轻度（1分）、中度（2分）、重度（3分）和极度严重（4分）5个等级，对小鼠的红斑（Erythema）、鳞屑（Scales）和浸润（Tickness）程度进行评分，并将三者的评分相加为总评分，取平均分（n = 6）绘制趋势线，以反映小鼠皮损的变化情况。
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末次给药24 h后，各组小鼠经异氟烷麻醉，脱颈处死后取小鼠背部皮损组织，采用4%多聚甲醛溶液固定24 h以上；经过脱水、石蜡包埋、切片和脱蜡处理后，苏木素染色5 min后，流水冲洗；用 1% 盐酸乙醇分化 0.5 min，流水冲洗 ；用伊红染色2 min，流水冲洗；用乙醇脱水后，二甲苯透化10 min；最后滴加中性树脂封片，自然晾干后，在显微镜下观察皮损组织病理变化，并利用Image J软件测量各组小鼠背部皮损组织表皮层厚度。
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取“2.5”项下皮肤组织切片脱蜡、水化，放入柠檬酸缓冲溶液煮沸10 min进行抗原修复，3% H2O2室温阻断内源性过氧化物酶25 min，PBS冲洗3次，3% BSA室温封闭30 min后，PBS冲洗3次，Ki67抗体（1：500）4 ℃孵育过夜，PBS冲洗3次，二抗室温孵育50 min，PBS冲洗3次，DAB显色2 min，流水冲洗终止显色，苏木精复染细胞核 1 min，脱水、透明、封片。风干后置显微镜下观察，并运用Image Pro Plus 8.0 软件统计Ki67阳性细胞数，并计算Ki67阳性细胞百分率及累计光密度（IOD）。
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采用GraphPad Prism 9统计软件进行数据分析及科研绘图；计量资料以
$ \bar x \pm s $ 表示，若满足正态分布且方差齐性，多组间比较采用单向方差分析，以P≥0.05表示无差异，P<0.05表示有差异且具统计学意义，P<0.01表示有显著差异。 -
如图1所示，空白组小鼠无皮损变化。与空白组相比，模型组小鼠经IMQ诱导后，其背部剃毛区出现不同程度的皮损；造模第4 d可见小鼠皮肤上伴有大面积红斑和片状鳞屑；第7 d斑块颜色有所加深，鳞屑呈层状分布，有部分鳞屑脱落，以上症状均与寻常型银屑病相符。与模型组相比，经瑞香狼毒、狼毒大戟和甘肃大戟干预后的银屑病样小鼠的皮损程度均有所缓解，其中瑞香狼毒醇提取物的效果较为显著，小鼠皮肤上的斑块颜色变浅、鳞屑大面积脱落、浸润程度减轻。
图 1 三种狼毒提取物对IMQ诱导的银屑病样小鼠的防治作用
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PASI评分结果显示（图2），小鼠自造模第1 d开始，其红斑、鳞屑、浸润及总积分会随时间推移而升高，在第 5 ～ 7 d达到峰值；而瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组的评分均低于同时期的模型组，且在第 4 ～ 5 d后呈下降趋势，其中以瑞香狼毒组的下降幅度最为显著。
图 2 三种狼毒提取物对IMQ诱导的银屑病样小鼠的PASI评分的影响（
$ \bar x \pm s $ ，n = 6） -
皮肤组织病理结果显示（图3），空白组小鼠表皮层厚度相对其余各组明显较薄（图4），基底层细胞正常排列，真皮浅层及血管周围未见明显炎性细胞浸润；模型组小鼠表皮层厚度显著增加，角化过度伴角化不全，角质层可见微脓肿，棘层肥厚，棘突向下延伸呈棒槌状，真皮层内毛细血管扩张，且血管周围淋巴细胞浸润明显，符合银屑病样皮肤组织病理特点。瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组小鼠的表皮层厚度均低于模型组（P<0.01），角化不全有所减轻，浸润情况有所改善。结果表明，三种狼毒醇提物均能抑制银屑病样小鼠表皮细胞的异常增殖，降低炎症细胞的浸润。与临床常见的外用药卡泊三醇相比，瑞香狼毒醇提取物的抗银屑病活性更为显著。瑞香狼毒醇提取物能显著改善IMQ诱导的寻常型银屑病小鼠皮损。
图 3 各组小鼠背部皮肤组织病理形态（HE染色，×200）
图 4 各组小鼠背部皮肤组织表皮层厚度（
$ \bar x \pm s $ ，n=6） -
免疫组化结果显示（图5），Ki67在银屑病小鼠的皮肤组织中为椭圆形、棕黄色点状分布。各组小鼠表皮中均有Ki67阳性细胞存在，但着色深浅与面积均有差异，其中空白组小鼠的表皮基底层有极少量Ki67表达，呈单层点状分布；与空白组相比，模型组小鼠的阳性表达显著增加（ P<0.01），呈多层密集分布；与模型组相比，三种狼毒均能降低Ki67的表达（ P<0.01），其中瑞香狼毒组中Ki67基本呈单层线状分布，其阳性细胞百分率（图6）和累计光密度值（图7）均显著降低（P<0.01），其抑制作用优于卡泊三醇组。
图 5 各组小鼠皮损表皮中Ki67的表达（免疫组化，×200）
图 6 各组小鼠皮损中Ki67阳性细胞百分率（
$ \bar x \pm s $ ，n=6）
图 7 各组小鼠皮损中Ki67的累计光密度值（
$ \bar x \pm s $ ，n=6） -
中医认为银屑病是由于血热、湿热、风邪[14]等因素导致的，治疗时使用清热解毒、祛风止痒、活血化瘀等中药可有效改善银屑病的症状[15]。据报道，狼毒在治疗血热证银屑病、角化病等皮肤病上具有显著的疗效[11]，在银屑病的治疗和预防方面具有潜在价值和应用前景。然而狼毒的同名异物品种很多，基源多达十几种，使得狼毒的质量和疗效存在一定的不确定性。据历代本草记载和近现代文献考证，瑞香科狼毒属瑞香狼毒 Stellera chamaejasme L.是药用狼毒的主流品种[16]，为狼毒正品，其味苦辛、性平，入肺、脾、肝经，可用于治疗心腹冷痛、结核及疥癣等诸多病症，具有镇痛、免疫调节、抗菌、抗病毒及抗肿瘤等药理活性[17]，其根含有二萜类、黄酮类和苯丙素类等多种化学成分[18-20]；而大戟科大戟属狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.和月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata分别是䕡茹和草䕡茹[21]，为狼毒的混淆品[22]，且经《中国植物志》中的形态对比，月腺大戟Euphorbia ebracteolata Hayata实为甘肃大戟Euphorbia kansuensis Prokh.的异名[23]。狼毒大戟根呈圆锥形，切面可见同心环；月腺大戟根偏椭圆型，切面可见不规则的大理石样纹理或环纹[24]。两者的根含有二萜类、三萜类、酚酸类、生物碱类和蒽醌类等成分[25-27]。
为了探究上述三种基源的狼毒治疗银屑病的疗程差异，本研究对其进行了体内抗银屑病活性实验。结果表明，三个品种的狼毒均能有效改善银屑病样小鼠皮损，其中瑞香狼毒的抗银屑病活性最佳，但其作用机制暂未明确。因此，本课题组后续拟借助中药靶点钩钓技术及体内外研究方式，将进一步探讨瑞香狼毒治疗银屑病的药效成分及作用机制，为银屑病的治疗提供新的思路和方法。同时，也为狼毒的质量控制和标准化提供参考，确保其安全性和有效性。
The preventive and therapeutic effects of three ethanol extracts derived from three sources of Stellera chamaejasme L., on imiquimod-induced psoriasis in mice
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摘要:
目的 考察三种基源的中药狼毒（瑞香狼毒Stellera chamaejasme L.、狼毒大戟Euphorbia fischeriana Steud.和甘肃大戟Euphorbia kansuensis Prokh.）乙醇提取物外用对咪喹莫特（Imiquimod，IMQ）诱导的银屑病小鼠的防治作用。 方法 将36只BALB/c 雄性小鼠随机分为空白组、模型组、瑞香狼毒组、狼毒大戟组、甘肃大戟组和卡泊三醇组，每组 6 只，通过PASI 评分记录各组小鼠的皮损变化，HE染色观察皮肤组织病理形态并测量表皮厚度，免疫组化检测小鼠皮损组织中细胞核抗原 Ki67 的表达情况。 结果 与模型组相比，三种狼毒乙醇提取物均能降低银屑病样小鼠PASI评分，抑制表皮异常增厚，减少表皮 Ki67异常表达，其中瑞香狼毒的治疗效果最为显著，且优于临床常用药卡泊三醇。 结论 瑞香狼毒乙醇提取物具有较好的抗银屑病活性作用，可抑制角质形成细胞异常增殖，减少皮损组织Ki67表达，显著改善银屑病样皮损。 Abstract:Objective To investigate the preventive and therapeutic effects of ethanol extracts derived from three sources of traditional Chinese medicine: Stellera chamaejasme L., Euphorbia fischeriana Steud., and Euphorbia kansuensis Prokh., on imiquimod （IMQ）-induced psoriasis in mice. Methods Thirty-six male BALB/c mice were randomly divided into the following 6 groups with 6 mice in each group: blank control, model, Stellera chamaejasme, Euphorbia fischeriana, Euphorbia kansuensis, and calcipotriol. PASI （Psoriasis Area and Severity Index） scores were used to record the changes of skin lesions in each group; HE （hematoxylin-eosin） staining was used to observe the pathological morphology of skin and measure the thickness of the epidermis. Immunohistochemistry was used to detect the expression of nuclear antigen Ki67 in the skin tissues of mice. Results Compared with the model group, the three kinds of ethanol extracts can reduce the PASI score, inhibit epidermal thickening, and decrease expression of Ki67 in the psoriasis mice. Among them, the therapeutic effect of Stellera chamaejasme was the most significant and it was better than the commonly used topical drug calcipotriol. Conclusion The ethanol extract of Stellera chamaejasme has good anti-psoriatic activity, can inhibit the abnormal proliferation of keratinocytes, can reduce the expression of Ki67, and can significantly improve psoriasis-like skin lesions. -
骨质疏松症（OP）是一种由骨吸收和骨形成之间的关系失衡造成，以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，导致骨质脆性增加和易于骨折的全身性骨代谢疾病。其中，成骨细胞是骨形成的功能细胞，在维持骨稳态中起到关键作用[1]。目前，高氧化应激相关的骨丢失已成为骨质疏松研究领域的热点。有研究表明，细胞保护酶是机体对抗氧化应激状态下活性氧（ROS）损伤的主要机制，其活性主要由转录因子Nrf2和FoxO调控，而二者所介导的氧化应激通路同样被证实具有调节成骨细胞氧化还原平衡以及促进骨形成分化的功能[2]。与此同时，β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的沉积可使机体ROS生成增多，进而抑制成骨细胞的增殖、成骨基质的产生及矿化[3]。由此可见，Aβ沉积偶联的氧化损伤是破坏成骨细胞骨形成，进而引发骨丢失的一大诱因。
啤酒花（Hops, Humulus lupulus L.）为桑科葎草属多年生草质蔓生藤本植物，其雌性球穗花序不仅作为啤酒酿造的添加原料，也是全球广泛应用的植物药，在欧洲广泛用于缓解更年期潮热及绝经后骨质疏松症[4]。我们前期研究发现啤酒花能够促进成骨细胞骨矿化结节的形成，降低活性氧水平，并显著改善APP/PS1转基因小鼠的骨丢失[5-6]，但其对外源性Aβ损伤成骨细胞的氧化应激水平及骨形成的影响尚不明确。此外，我们首次确认了氧化应激和Aβ沉积之间的双向关联，及其在老年性骨质疏松症发病中的重要作用[7-8]。故本文拟以Aβ损伤的成骨细胞为模型，以Nrf2和FoxO1两条经典氧化应激相关通路为核心，对啤酒花的抗氧化能力及对骨形成干预作用进行探究。
1. 材料与方法
1.1 药材及试剂
啤酒花药材购于昌吉市山水啤酒花有限公司（产地：新疆昌吉；批号：PJH-01），经海军军医大学药学系生药学教研室辛海量副教授鉴定为啤酒花 Humulus lupulus L.的雌性球穗花序。称取啤酒花药材粉末70 g，加入料液比为1∶15的75%乙醇，回流提取3次，减压浓缩干燥成浸膏，HPLC测定得浸膏中主要成分黄腐酚含量为0.55%[9]，使用前配制成相应浓度（生药量/ml）的提取液。
其他试剂及厂家：Aβ1-42寡聚体（上海吉尔）；N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，上海碧云天）；胎牛血清（Gibco，美国）；α-MEM培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；碱性磷酸酶（ALP）染色试剂盒（南京建成）；I型胶原酶（COL-I）、骨桥蛋白（OPN）、核因子-E2-相关因子（Nrf2）、血红素加氧酶-1（HO-1）、NAD(P)H：醌氧化还原酶（NQO1）、细胞叉头框蛋白O1（FoxO1）、超氧化物歧化酶（SOD-2）抗体（Abcam，英国）。
1.2 实验动物及原代成骨细胞分离培养
新生24 h Wistar大鼠，购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：2013001831722；许可证号：SYXK（沪）2017-0004]。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。采用二次消化法从新生大鼠颅盖骨分离得到原代成骨细胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液进行培养，取3～4代成骨细胞进行后续实验分析。
1.3 成骨细胞增殖及碱性磷酸酶检测
取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×104个/ml细胞悬液接种于96孔板，根据前期实验结果[9]设置分组：空白对照组，模型组（40 μmol/L Aβ），阳性对照组（NAC, 2.5 mmol/L），啤酒花提取物低剂量组（HLE, 4 μg/ml）、中剂量组（HLE, 20 μg/ml）、高剂量组（HLE, 100 μg/ml），每组设置4个复孔。24 h后按照上述分组更换为含药培养液。给药48 h后采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。
取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×104个/ml细胞悬液接种于24孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d更换1次含药培养液。第8天裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13 800×g 离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞ALP活性[10]。参照ALP染色试剂盒说明书对成骨细胞进行染色。
1.4 成骨细胞凋亡检测
取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为2×105个/ml细胞悬液接种于6孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。给药48 h后收集各孔中培养基上清液，加入200 μl 0.25%胰蛋白酶消化30 s，离心并重悬，参照凋亡检测试剂盒装载探针，室温避光孵育5 min后，用流式细胞仪进行凋亡率检测。
1.5 蛋白质印迹检测
取3～4代成骨细胞接种于6孔板，24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。给药48 h后进行细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒进行蛋白定量。蛋白变性后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜、封闭后，分别加入COL-I、OPN、Nrf2、HO-1、NQO1、FoxO1及SOD-2抗体，4 ℃孵育过夜。用洗膜缓冲液（Tris-buffered saline/Tween-20，TBST）洗膜3×10 min，加入二抗，室温孵育30 min。用TBST再次洗膜3×10 min，采用ECL试剂进行检测。采用Tanon Image软件对蛋白印迹进行半定量分析。
1.6 免疫荧光检测
取3～4代成骨细胞配制成浓度为2×104个/ml细胞悬液接种于无菌激光共聚焦皿中。24 h后分别更换为含药培养液（Aβ, 40 μmol/L HLE, 100 μg/ml）。给药48 h后用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，PBS浸洗后用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透20 min，并用5% BSA封闭液室温封闭1 h。先后加入FoxO1抗体及荧光二抗（TRITC标记山羊抗兔抗体）进行孵育，加入DAPI染液避光孵育10 min进行染核。最后洗去多余的DAPI染液，加入少量PBS使细胞保持湿润，并置于荧光显微镜下观察采集图像。
1.7 统计学分析
实验结果以均值±标准差（
$ \bar x$ ±s）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。2. 结果
2.1 啤酒花提取物促进Aβ损伤成骨细胞增殖，提高ALP活性
如图1A所示，与空白组相比，Aβ损伤成骨细胞后，其增殖能力显著降低。药物治疗后，低、中、高剂量的啤酒花提取物均可显著促进Aβ损伤成骨细胞的增殖。另一方面，与空白组比，Aβ显著降低了成骨细胞的ALP活性，而啤酒花提取物显著逆转了Aβ损伤成骨细胞的ALP活性，促进成骨细胞的分化（图1B-C）。
2.2 啤酒花提取物抑制Aβ损伤成骨细胞凋亡
如图2所示，与空白组相比，Aβ损伤提高了成骨细胞的凋亡率，而啤酒花提取物（20，100 μg/ml）可显著抑制Aβ损伤成骨细胞的凋亡。提示啤酒花提取物对Aβ诱导的成骨细胞具有较强的抗凋亡作用。
2.3 啤酒花提取物促进Aβ损伤成骨细胞中骨形成相关蛋白表达
如图3所示，Aβ损伤成骨细胞后，细胞中骨形成相关蛋白COL-I和OPN的表达显著降低。给予啤酒花提取物（20，100 μg/ml）干预后，COL-I及OPN的表达显著增加，提示啤酒花可显著促进Aβ损伤成骨细胞的骨形成。
2.4 啤酒花提取物调节Nrf2氧化应激通路
采用Western blot分析Aβ和啤酒花提取物对成骨细胞中Nrf2及其下游抗氧化酶HO-1和NQO1的影响。结果显示，Aβ显著抑制了成骨细胞中Nrf2及其下游蛋白HO-1和NQO1的表达；而低、中、高剂量的啤酒花提取物均可显著促进Aβ损伤成骨细胞中Nrf2、HO-1及NQO1的表达（图4），提示其能够通过介导Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。
2.5 啤酒花提取物调节FoxO1抗氧化通路
采用免疫荧光及Western blot分析Aβ和啤酒花提取物对成骨细胞中FoxO1信号通路的影响。结果显示，与空白组相比，Aβ显著降低了成骨细胞中的FoxO1含量，而啤酒花提取物（100 μg/ml）可显著下调FoxO1的表达，且使其更多聚集在细胞核内（图5A）。此外，啤酒花提取物（4、20、100 μg/ml）还可显著促进Aβ损伤成骨细胞中FoxO1及其下游蛋白SOD-2的表达，提示啤酒花能够通过介导FoxO1信号通路发挥抗氧化作用。
图 5 啤酒花提取物对Aβ损伤成骨细胞中FoxO1及SOD-2表达的影响（n=3）# P<0.05, ## P<0.01，与空白组比较；*P<0.05, **P<0.01，与模型组比较3. 讨论
成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在骨形成过程中经历增殖、分化、矿化和凋亡四个阶段。其中，成骨细胞的增殖水平反映骨形成的强弱，其分泌的ALP是成骨细胞分化阶段的关键酶[11]，可介导骨组织矿化。在骨形成相关蛋白中，COL-I是骨细胞外基质的主要成分之一，约占骨总蛋白的80%[12]，而OPN是一种骨基质糖蛋白，能够促进成骨细胞的黏附和分化[13]，二者均为成骨细胞分化成熟的标志。此外，Aβ沉积会引起机体的氧化损伤，在骨代谢中可降低骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化，破坏成骨细胞的活性和功能，抑制骨形成[14]。我们前期研究同样发现过量的Aβ在聚集过程中会产生大量的活性氧，使机体处于高氧化应激状态，反过来又刺激Aβ产生和聚集，形成Aβ与氧化损伤相偶联[15]。该机制在老年性骨质疏松症发病中处于特别重要的位置，并受到学界关注[16]。本研究中，啤酒花提取物可显著逆转Aβ损伤所致的成骨细胞增殖水平下降、ALP活性降低，以及COL-I和OPN的低表达，表明其可显著促进成骨细胞的成熟分化；并抑制Aβ损伤成骨细胞的凋亡，表明其可显著改善Aβ沉积所致成骨细胞的活性损伤，促进骨形成，在维持骨稳态中发挥重要作用。
Nrf-2信号通路是典型的抗氧化通路，能够拮抗各种原因引起的氧化应激。激活Nrf2信号通路不仅能够抑制氧化损伤成骨细胞的凋亡，促进骨形成[17]，而且能够拮抗Aβ诱导的细胞损伤[18-19]。应激状态下，Nrf-2转移入核内，与基因中的抗氧化反应元件结合，启动下游Ⅱ相代谢酶基因的表达和转录，以增加细胞对氧化应激的抵抗作用，使细胞免于凋亡[20]。FoxO1为调节成骨细胞氧化还原平衡和成骨功能的主要转录因子，其入核可激活下游SOD-2抗氧化酶，调控细胞内的氧化还原平衡，并促进成骨细胞的增殖与分化，在骨代谢中同样发挥着重要作用[20]。本研究结果表明，啤酒花可激活Aβ损伤成骨细胞的Nrf-2和FoxO1信号通路，促进该氧化应激信号通路中相关蛋白的表达，增加成骨细胞对氧化应激的抵抗作用，使其免于凋亡，进而促进成骨细胞增殖与分化。提示啤酒花具有通过抗氧化而调控骨代谢、维持骨稳态之应用潜力。
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