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抗生素的发现是人类健康史的一大进步，但由于抗生素在医疗卫生领域和动物卫生领域的过度使用，导致耐药性的产生，临床效果减弱。伴随着抗生素耐药性的产生，很多人类赖以生存的药物正在迅速失效，治疗手段日益减少，人类的健康和生命受到严重威胁[1]。因此开发新的抗生素和建立新的治疗模式迫在眉睫。
群体感应（QS）是病原菌自发产生某些特定的小分子物质，随着浓度变化，调节自身特定基因的表达，从而改变群体行为的现象。群体感应抑制剂（QSI）作为一种新型抑菌方式，在治疗病原菌感染方面有重要作用，通过不同的方式干扰或阻断病原菌群体感应现象的产生[2]。其作用机制不同于目前抗生素以抑制或杀灭病原菌为目的，而是在不对病原菌生长产生压力的前提下，通过阻断病原菌群体感应通路来减少紫色色素、生物被膜、几丁质酶等毒力因子的产生或表达，达到降低病原菌致病性。由于不影响细菌正常生长，因此避免了细菌的生存选择压力，也就减少严重的耐药性问题[3]。
研究表明，很多中药活性成分具有群体感应抑制作用，如肉桂中的肉桂醛对荧光假单胞菌生物膜形成的抑制作用[4]，药用植物金丝雀花中提取的邻苯三酚及其类似物对群体感应信号分子呋喃硼酸二酯具有拮抗作用[5]，槲皮素和柚皮素能抑制哈维菌BB120和大肠杆菌O157∶H7的生物膜形成[6]。川白芷提取物对铜绿假单胞菌生物膜形成的具有抑制作用[7]，马齿苋、板蓝根等中药提取物能明显地抑制了铜绿假单胞菌的浮游迁移，这些研究为筛选新型抗感染药物提供新的思路，具有非常重要的研究意义和实用价值[8]。
黄酮类化合物因其抗氧化、抗菌和抗癌作用而成为研究的热点[9-11]。淫羊藿E. brevicornum为小檗科（Berbridacese）淫羊藿属植物，其主要有效成分中黄酮类化合物含量最高，如宝藿苷、淫羊藿苷、朝藿定A/B/C等黄酮苷类化合物。淫羊藿具有抗炎，提高人体免疫力，抗氧化等多种药理活性，而且黄酮类成分在抗感染以及抗菌防霉有良好的应用前景[12-13]。但淫羊藿在群体抑制方面的研究目前是鲜有报道。
因此，本实验拟测定淫羊藿提取物及5个主要的黄酮苷类化合物对常见条件病原菌（紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1）的群体感应抑制作用，为寻找高效的群体感应抑制剂奠定基础，为淫羊藿的进一步开发应用提供理论依据。
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超声细胞破碎仪（宁波新芝JY99-IIDN）；低温高速离心机（美国贝克曼Avanti J-26S XP）；高压灭菌锅（日本SANYO MLS-3020）；真空干燥箱（上海一恒科技有限公司DHG-9053A）；酶标仪（瑞士TECAN infinite M200 pro）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI Rotavator R-200）；光学显微镜（日本尼康80i）。
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化学试剂乙醇（批号：XW00641751）、二甲基亚砜DMSO（批号：XW00676851，购自国药集团化学试剂有限公司）；本实验中所用的抗生素包括妥布霉素（批号：014241281）、硫酸奈替米星（批号：014138073）、庆大霉素（批号：014321472）、环丙沙星（批号：014252858）、淫羊藿苷（批号：01230870）、宝藿苷（批号：014125028）、朝藿定A（批号：045930800）、朝藿定B（批号：045930801）、朝藿定C（批号：041603427）、对照品水杨酸（批号：013474062）均购自上海泰坦科技股份有限公司；几丁质酶活性检测试剂盒（批号：BC0825，购自北京索莱宝公司）；LB培养基（批号：041417503，购自上海泰坦科技股份有限公司）；淫羊藿（购自湖北十堰丹江口铜架山村毛家坪淫羊藿种植基地，由海军军医大学中药鉴定学教研室张成中副教授鉴定）；紫色杆菌CV026、铜绿假单胞菌 PAO1（购自广东省微生物菌种保藏中心，菌种均于−80℃冰箱冻存）。
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淫羊藿药材50℃烘干，粉碎，过40目筛，保存备用。称取5.0 g淫羊藿粉末，加入100 ml 75% 乙醇，超声破碎30 min，过夜静置，过滤取上清，上清液减压浓缩至浸膏。溶于1% DMSO溶液中，过滤，分装，−20℃保存备用。淫羊藿提取物的质量浓度为 0.5 mg/ml。
将淫羊藿苷、宝藿苷、朝藿定A/B/C、水杨酸分别称取2.00 mg 溶于1 ml DMSO溶液（1%）中，得到浓度为2 000 μg/ml的标准品母液，−20℃保存备用。将抗生素妥布霉素、硫酸奈替米星、庆大霉素、环丙沙星溶于1 ml DMSO溶液（1%）中，得到浓度为100 μg/ml的标准品母液，−20℃保存备用。
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菌株活化后按1%接种量接种于现配LB培养基，37℃，220 r/min震荡培养至OD600nm为0.4～0.6。加入上述制备的样品，采用2倍稀释法梯度稀释，DMSO为阴性对照，在2、4、6、8、10 h分别测定OD620nm值，实验进行3个重复，测定最小抑菌浓度。
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按1.4实验结果，本实验按200 μg/ml以下浓度进行，制备不同浓度样品（最终浓度分别为25、50、100 μg/ml）的CV026菌液，加入C6-HSL终浓度为5 μmol/L，28℃培养24 h。DMSO为阴性对照。取3 ml培养液，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 ml 酸化乙醇（4%，1 mol/L HCl），充分混匀，离心，取上清液，534 nm处测定吸光值[14]。按下式计算抑制率[15]：
$$ \text{抑制率}=\frac{\text{对照组}\mathrm{O}\mathrm{D}\text{值}-\text{实验组}\mathrm{O}\mathrm{D}\text{值}}{\text{对照组}\mathrm{O}\mathrm{D}\text{值}}\times 100\text{%} $$ -
将铜绿假单胞菌 PAO1培养物稀释至现配LB中，将样品（终浓度100 μg/ml）加入到实验组，并将DMSO作为阴性对照组，水杨酸作为阳性对照。将200 μl样品添加到96孔平板中，在37℃下温育24 h，除去悬浮培养物。利用光学显微镜观察后，用无菌磷酸盐缓冲盐水PBS（pH 7.2）洗涤，保持不破坏底部生物被膜。将200 μl的LB培养基和溶解有样品（终浓度100 μg/ml）或DMSO（阴性对照）或具有抗生素的LB培养基添加到96孔板中。适当摇动，将平板在37℃下再温育24 h。使用酶标仪在620 nm（OD620）处测量光密度[16]。
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将铜绿假单胞菌 PAO1培养物稀释至现配LB中，将样品（终浓度100 μg/ml）加入到实验组，并将DMSO作为阴性对照组，水杨酸作为阳性对照。使用几丁质酶活性检测试剂盒，将1 ml的提取液加入到1 ml培养物中，10 000 r/min，4℃离心20 min，取上清液，分别沸水浴反应 10 min，置于冰上暂存。在540 nm下测定每管的吸光度，对比标准曲线计算几丁质酶活性[17]。
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根据紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的生长情况，以及测定培养物的OD值，确定淫羊藿提取物及活性成分对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的最小抑菌浓度如下表1。淫羊藿提取物及五种黄酮苷的MIC都在500 μg/ml。因此，后续实验测定选择200 μg/ml以下的浓度对于紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌PAO1生长均无抑制作用。
表 1 样品对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1最小抑菌浓度
样品 MIC（μg/ml） CV026 PAO1 淫羊藿提取物 >2 000 >2 000 宝藿苷I 500 500 淫羊藿苷 500 500 朝藿定A 500 500 朝藿定B 500 500 朝藿定C 500 500 妥布霉素 0.25 0.5 奈替米星 2 1 庆大霉素 1 1 环丙沙星 2 2 -
紫色杆菌群体感应的特殊现象就是产生紫色色素，对6个样品进行浓度梯度实验，样品对于CV026群体感应的抑制作用可以通过检测紫色色素的产生量进行判定。实验结果显示，淫羊藿提取物、淫羊藿苷和朝藿定C对CV026紫色色素的产生有抑制作用，且随着样品浓度升高而增强，淫羊藿苷和朝藿定C浓度达到100 μg/ml时，其抑制率可达到42.9%和31.9%，与阴性对照组（DMSO）相比有显著差异（P<0.05，图1）。结果表明，淫羊藿苷和朝藿定C在不影响CV026生长的情况下，具有良好的群体感应抑制作用。
图 1 淫羊藿提取物及黄酮苷类化合物对紫色杆菌CV016紫色色素产生的抑制作用
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生物被膜的产生是导致抗生素耐药的主要原因之一。铜绿假单胞菌能生成高度结构化和致密的生物被膜，多与群体感应有关。本实验利用光学显微镜对细胞爬片上的生物膜进行观察，利用酶标仪对其定量测定，结果如图2所示。淫羊藿苷与朝藿定C（100 μg/ml）均表现出优于阳性对照水杨酸的抑制活性，与阴性对照组（DMSO）相比有显著差异（P<0.05, P<0.01）。
图 2 淫羊藿提取物及黄酮苷类化合物对铜绿假单胞菌 PAO1生物被膜形成的抑制作用
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几丁质酶是真菌和细菌生物被膜中的重要成分，是一种中药的毒力因子，能够帮助病原菌穿透组织侵袭宿主。本实验通过淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg/ml）对铜绿假单胞菌 PAO1培养物进行处理，结果表明淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg/ml）可大大降低几丁质酶活。几丁质酶活分别降低了41％、38％和45％（图3），与阴性对照组比较有显著差异（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。
图 3 淫羊藿提取物及黄酮苷类化合物对几丁质酶抑制作用
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本实验利用群体感应抑制研究的模式菌株CV026紫色杆菌、PAO1铜绿假单胞菌对淫羊藿提取物及其主要的黄酮苷类成分进行了最小抑菌浓度MIC的测定，发现其在500 μg/ml浓度下不影响病原菌的正常生长，随后，分别对紫色色素、生物被膜、几丁质酶等毒力因子进行测定，发现淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg /ml）对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的群体感应具有抑制作用。
随着常见致病菌的耐药性的增多，通过抑制或沉默致病菌群体感应的方法被认为是解决耐药性的途径之一，本实验中涉及到的作为研究群体感应的模式菌株得到了大量的应用，在此基础上挖掘出大量具有潜力的QSI，例如绿茶中的茶多酚、西柚中的香豆素、百里香中的香芹酚以及白藜芦醇、山奈酚、槲皮素等[9-11,18-19]。淫羊藿中的黄酮苷类成分与上述的潜力QSI有着结构上的相似性，因此我们推测可能是黄酮类的化合物结构与QS系统的信号分子相似，当其处于高浓度时可能会与QS系统中的某些信号分子受体产生竞争性结合，以此抢占活性受体靶标，阻断了QS系统传导，最终导致细菌毒力因子的表达下降。
黄酮苷类成分作为淫羊藿的主要活性成分，尤其是本实验中发现的淫羊藿苷和朝藿定C两个活性单体可以作为抗感染治疗的一种潜在前体，与上述潜力QSI有一定差异性，前者大多是以苷元的形式存在，其水溶性较差，而本文中提到的淫羊藿苷和朝藿定C分别带有二糖和三糖基修饰，其水溶性大大的增强，在进入生物体后，水解生成黄酮苷元发挥抑制作用，可能具有更高的生物利用度。
Quorum-sensing inhibition of flavonoid glycosides from Epimedium brevicornum
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摘要:
目的 从淫羊藿中发现具有群体感应抑制作用的黄酮苷类成分，并对其活性进行评价。 方法 首先测定淫羊藿中5个主要的黄酮苷类化合物（宝藿苷、淫羊藿苷、朝藿定A/B/C）及淫羊藿提取物的抑菌最小浓度MIC值，随后利用酶标仪测定对紫色杆菌CV026的紫色色素产生的抑制作用，再利用对铜绿假单胞菌 PAO1的生物被膜以及几丁质酶进行定量测定。 结果 淫羊藿提取物及其主要成分具有群体感应抑制活性作用，其中，淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg /ml）作用明显。 结论 中药淫羊藿具有对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的群体感应系统有抑制作用，其中，淫羊藿苷和朝藿定C有望发展成为一种群体感应抑制剂的潜在新药。 -
关键词:
- 淫羊藿 /
- 群体感应 /
- 紫色杆菌CV026 /
- 铜绿假单胞菌 PAO1
Abstract:Objective To identify flavonoid glycosides with quorum sensing inhibitory activity from Epimedium brevicornum and evaluate their bioactivity. Methods The minimum inhibitory concentrations （MICs） of five major flavonoid glycosides （baohuoside, icariin, epimedin A/B/C） and the extract of E. brevicornum were first determined. Subsequently, the inhibitory effects on the production of purple pigments in Chromobacterium violaceum CV026 were measured. Additionally, the biofilm formation and chitin quantification of Pseudomonas aeruginosa PAO1 were assessed. Results The extract of E. brevicornum and its primary components exhibited significant quorum sensing inhibitory activity. Particularly, icariin and epimedin C demonstrated superior inhibitory activity. Conclusion E. brevicornum demonstrates the ability to inhibit the quorum sensing system of Chromobacterium violaceum CV026 and Pseudomonas aeruginosa PAO1. Furthermore, icariin and epimedin C （100 μg/ml） show promise for development into novel drugs for quorum sensing inhibitor. -
盐酸普萘洛尔（propranolol hydrochloride，PPL）是治疗婴幼儿血管瘤的一线和首选药物[1]。口服盐酸普萘洛尔疗效确切，但其存在首过效应强、生物利用度低、半衰期短等问题，且不良反应发生率高[2]。普通盐酸普萘洛尔外用制剂只对浅表型血管瘤有效，对深部型和复合型血管瘤的治疗仍需结合口服给药。诸多研究表明，立方液晶（cubosomes，Cubs）可显著提高经皮给药制剂的皮肤渗透性，且能提高其在皮肤尤其是皮肤真皮层的药物滞留量，有望能提高盐酸普萘洛尔外用制剂对深部型和复合型血管瘤的疗效[3~5]。因此，课题组拟基于立方液晶载药技术将盐酸普萘洛尔制备成一种纳米经皮给药制剂，以期能降低或避免口服给药带来的高不良反应发生率，提高盐酸普萘洛尔的治疗效果和患者依从性。前期实验中，课题组筛选了盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒（PPL-Cubs）的制备方法，并通过单因素考察结合星点设计效应面法优化了其最佳处方和制备工艺，结果制得的PPL-Cubs包封率低（约50%），远低于药典规定的80%。立方液晶为多层囊泡结构，类似于多囊脂质体，其可能与脂质体同样存在对水溶性化合物包封率较低的问题。鉴于前期研究表明，盐酸普萘洛尔在不同pH磷酸盐缓冲液下的溶解度存在极大差异，因此，本研究拟在立方液晶常规制备的基础上，引入“pH梯度法”的载药思路，制备PPL-Cubs，以期提高其包封率。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DV215CD型分析天平（美国奥豪斯公司）；AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；高压均质机（意大利NIRO-SAVI S.P.A.公司）；NICOMP 380 ZLS激光粒度测定仪（美国PSS粒度仪公司）；超滤离心管（100KD，Millipore）。
1.2 试药
盐酸普萘洛尔（含量99.9%，常州亚邦制药有限公司）；单油酸甘油酯（法国GATTEFOSSé公司）；泊洛沙姆407（德国BASF公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 包封率的测定
取PPL-Cubs适量，装入超滤离心管中，于4000 r/min离心10 min，收集离心液，采用课题组前期建立的盐酸普萘洛尔含量测定方法测定离心液中游离药物浓度C游离；取未透析的PPL-Cubs，测定药物浓度C总；根据公式EE（%）=[(C总−C游离)/ C总]×100%计算PPL-Cubs的包封率。
2.2 PPL-Cubs的制备
2.2.1 注入法
精密称取单油酸甘油酯9 g和泊洛沙姆407 1.5 g，加入10 ml无水乙醇，20 ℃水浴下搅拌溶解，为A相；精密称取盐酸普萘洛尔3.5 g，加入86 g纯化水，20 ℃水浴下搅拌溶解，为B相。于20 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢地滴加至B相中，待磁力搅拌1 h后加入适量纯化水使总质量为100 g，再在800 bar压力下高压均质7次，得PPL-Cubs。
2.2.2 pH梯度法
精密称取单油酸甘油酯适量，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407适量，加入适量纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至酸性，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，得空白立方液晶纳米粒粗品；取空白立方液晶纳米粒粗品，高压均质数次，得空白立方液晶纳米粒（B-Cubs）。取盐酸普萘洛尔溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入一定比例的B-Cubs中，搅拌均匀，并用氢氧化钠溶液调节pH至一定值，于一定温度下持续搅拌一定时间，再放置至室温，即得PPL-Cubs。
2.3 B-Cubs的制备工艺优化
前期试验结果表明，磁力搅拌速度、时间、温度、内水相pH值对B-Cubs的粒径基本无影响，高压均质压力及均质次数是影响其粒径的主要因素，故拟进一步优化高压均质压力和均质次数。
2.3.1 高压均质压力的考察
按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在400、600、800、900、1000 bar下高压均质7次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表1）。结果表明，随高压均质压力的提高，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质压力≥900 bar时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质压力为900 bar。
表 1 高压均质压力的考察（n=3）压力（bar） 粒径（nm） 多分散指数 400 169.1±3.5 0.189±0.056 600 129.9±3.2 0.172±0.062 800 110.9±2.7 0.126±0.041 900 97.9±2.1 0.073±0.016 1000 96.4±1.9 0.057±0.009 2.3.2 高压均质次数的考察
按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在900 bar下高压均质3、5、7、9次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表2）。结果表明，随高压均质次数的增加，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质次数≥7次时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质次数为7次。
表 2 高压均质次数的考察（n=3）次数（次） 粒径（nm） 多分散指数 3 160.4±4.6 0.173±0.052 5 129.2±3.8 0.140±0.037 7 97.9±2.1 0.073±0.016 9 93.3±1.7 0.067±0.011 2.4 B-Cubs的处方优化
2.4.1 单油酸甘油酯用量的考察
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定泊洛沙姆407用量为5%，内水相pH为3.0，考察单油酸甘油酯用量（15%、20%、25%、30%、35%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表3）。结果表明，随单油酸甘油酯用量的增加，制得的B-Cubs粒径呈先减小后增大趋势，多分散指数则不断降低，当单油酸甘油酯用量为25%时，制得的B-Cubs具有最小的粒径和较适宜的多分散指数，故确定单油酸甘油酯用量为25%。
表 3 单油酸甘油酯用量的考察（n=3）用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 137.8±3.4 0.160±0.033 20 119.2±2.9 0.147±0.032 25 97.9±2.1 0.073±0.016 30 118.3±3.5 0.024±0.015 35 150.8±5.4 0.026±0.011 2.4.2 泊洛沙姆407用量的考察
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定单油酸甘油酯用量为25%，内水相pH为3.0，考察泊洛沙姆407用量（3%、4%、5%、6%、7%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表4）。结果表明，制得的B-Cubs粒径随泊洛沙姆407用量的增加逐渐降低，多分散指数变化无明显规律，但均较小（<0.1）；当泊洛沙姆407用量≥5%时，粒径变化幅度降低，故确定泊洛沙姆407用量为5%。
表 4 泊洛沙姆407用量的考察（n=3）用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 3 143.6±3.5 0.064±0.019 4 116.7±3.2 0.055±0.015 5 97.9±2.1 0.073±0.016 6 91.3±1.9 0.052±0.015 7 83.2±1.8 0.062±0.021 2.5 PPL-Cubs的包封率影响因素考察
2.5.1 外水相pH值的考察
根据前期盐酸普萘洛尔在不同pH的PBS中溶解度测定结果可知（见表5），盐酸普萘洛尔在pH≥8.5时溶解度显著下降。按照“2.2.2”项下方法，制备内水相pH为3.0的B-Cubs，并按载体/药物比（以单油酸甘油酯/盐酸普萘洛尔计）为6∶1的比例与B-Cubs和盐酸普萘洛尔水溶液进行混合，以10%氢氧化钠溶液分别调节外水相pH至7.5、8.0、8.5、9.0，于20 ℃水浴（载药温度）下600 r/min磁力搅拌15 min（载药时间），制得PPL-Cubs中药物浓度为1%，测定对包封率等参数影响（见表6）。结果表明，PPL-Cubs的包封率随外水相pH值的提高逐渐增加，当外水相pH值≥8.5时，包封率增加趋势渐小；外水相pH值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 5 盐酸普萘洛尔在不同pH PBS中的溶解度（n=3）pH 溶解度（mg/ml） 4.5 53.50±4.22 5.5 51.70±2.34 6.5 52.60±1.53 7.5 49.80±2.14 8.5 8.50±1.15 9.5 1.41±0.33 10.5 0.87±0.08 表 6 外水相pH值的考察（n=3）pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 7.5 71.29±2.58 96.8±2.6 0.063±0.012 8.0 86.24±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 8.5 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 9.0 94.58±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 2.5.2 内水相pH值的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察内水相pH（3.0、4.0、5.0、6.0）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表7）。结果表明，不同内水相pH的B-Cubs对制得的PPL-Cubs包封率无明显差异，对PPL-Cubs的粒径和多分散指数亦无明显影响。
表 7 内水相pH值的考察（n=3）pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 3.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 4.0 91.85±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 5.0 91.62±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 6.0 89.33±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 2.5.3 载体/药物的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载体/药物（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表8）。结果表明，当载体/药物≥6时，PPL-Cubs的包封率不再增加；载体/药物比值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 8 载体/药物的考察（n=3）载体/药物 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 5∶1 90.93±1.52 98.5±2.7 0.076±0.015 6∶1 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 7∶1 92.06±2.37 97.5±2.1 0.077±0.015 8∶1 92.41±2.58 98.1±2.4 0.102±0.025 2.5.4 载药温度的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药温度（20、30、40、50 ℃）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表9）。结果表明，载药温度对PPL-Cubs的包封率、粒径和多分散指数无明显影响。
表 9 载药温度的考察（n=3）载药温度（℃） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 20 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 91.05±1.95 96.9±2.3 0.068±0.021 40 91.38±2.08 97.1±2.6 0.066±0.012 50 90.55±1.75 97.2±2.1 0.053±0.018 2.5.5 载药时间的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药时间（15、30、45、60 min）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表10）。结果表明，载药时间对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 10 载药时间的考察（n=3）载药时间（min） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 92.09±1.54 97.2±2.4 0.071±0.013 45 92.01±2.01 97.5±1.6 0.065±0.024 60 91.86±1.86 98.1±1.9 0.075±0.026 2.5.6 B-Cubs粒径和多分散指数的考察
通过调整高压均质压力，制备不同粒径B-Cubs。按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察B-Cubs粒径和多分散指数对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表11）。结果表明，B-Cubs的粒径和多分散指数不影响所制得PPL-Cubs的包封率，但B-Cubs的粒径和多分散指数基本决定了制得PPL-Cubs的粒径和多分散指数。
表 11 B-Cubs粒径和多分散指数的考察（n=3）载体 EE（%） PPL-Cubs 粒径（nm） 多分散指数 粒径（nm） 多分散指数 97.9±2.1 0.073±0.016 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 129.2±3.8 0.140±0.037 91.87±1.96 128.5±2.1 0.123±0.021 160.4±4.6 0.173±0.052 91.85±2.13 158.2±2.8 0.152±0.037 210.5±5.9 0.182±0.057 91.25±2.53 209.2±2.9 0.174±0.045 2.5.7 PPL-Cubs药物浓度的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察药物浓度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表12）。结果表明，随着PPL-Cubs中药物浓度的提高，包封率呈逐渐增加趋势，当药物浓度≥1%时，包封率增加趋势变慢。
表 12 PPL-Cubs中药物浓度的考察（n=3）浓度 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 0.1 51.83±3.17 97.2±2.4 0.057±0.013 0.5 81.87±2.12 96.3±2.1 0.062±0.012 1.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 2.0 94.42±1.37 96.3±1.9 0.045±0.005 3.0 95.87±1.28 97.8±2.5 0.042±0.007 2.6 pH梯度法制备PPL-Cubs的最优处方及制备工艺
精密称取单油酸甘油酯25.0 g，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407 5.0 g，加入70 g纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至3.0，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，再在900 bar下高压均质7次，得B-Cubs。取盐酸普萘洛尔1 g，溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入24 g B-Cubs中，搅拌均匀，用10%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，于20 ℃水浴持续搅拌15 min，再放置至室温，即得PPL-Cubs
3. 讨论
立方液晶纳米粒常用的制备方法包括注入法、熔融-分散法、热处理法、喷雾干燥法等[6]。试验前期以粒径、包封率等为评价指标筛选了最佳制备方法为注入法，并优化了其最佳处方制备工艺，结果制得的载药立方液晶纳米粒包封率较低（约50%）[7]。立方液晶是两亲性脂质分子分散在过量水中形成的含双连续水区和闭合脂质双分子层的蜂窝状液晶结构；水溶性分子被包封于立方液晶水道中，脂溶性分子被包封于脂质双层膜中，两亲性分子则贯穿其中。盐酸普萘洛尔在酸性环境下具有较高的溶解性，常规方法制得的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒pH约为3.5，如何让其具有进入立方液晶载体内相的“动力”是提高载药立方液晶纳米粒包封率的关键。因此，本研究引入“pH梯度法”，通过创造高溶解度内环境（低pH值内水相）和低溶解度外环境（高pH值外水相），给盐酸普萘洛尔提供进入立方液晶载体内相的“动力”。离子化的盐酸普萘洛尔在调节pH的过程中逐渐变为分子形态的普萘洛尔而进入脂质区，脂质区的普萘洛尔分子接触内水相酸性环境而被离子化，内水相中离子化的盐酸普萘洛尔无法再通过脂质区而被捕获于内水相。结果表明，pH梯度法显著提高了PPL-Cubs的包封率，包封率达到90%。
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表 1 样品对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1最小抑菌浓度
样品 MIC（μg/ml） CV026 PAO1 淫羊藿提取物 >2 000 >2 000 宝藿苷I 500 500 淫羊藿苷 500 500 朝藿定A 500 500 朝藿定B 500 500 朝藿定C 500 500 妥布霉素 0.25 0.5 奈替米星 2 1 庆大霉素 1 1 环丙沙星 2 2 
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