据国际癌症研究机构（IARC，https://www.iarc.who.int/）提供的数据显示，2020年女性乳腺癌现已成为全球最常见的癌症之一^[1]。其中有15%～25%的乳腺肿瘤存在人类表皮生长因子受体2（HER2）过表达。HER2阳性的乳腺癌浸润性强、无病生存期短、预后差，对化疗敏感性差，且易复发^[2]。曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。虽然曲妥珠单抗单药对乳腺癌治疗起到了很好的改善的效果, 但其疗效还有所不足，如对HER2过表达的乳腺癌患者初次治疗有效率仅在30%左右^[3]。EGCG是绿茶中主要的多酚^[4]，有抑制肿瘤细胞生长、增殖、转移和血管生成，诱导细胞凋亡和增强抗肿瘤免疫等多种抗肿瘤作用^[5-9]。据报道，EGCG在乳腺癌、胃癌、白血病、膀胱癌治疗中均显示有抗肿瘤作用^[10-13]。本实验旨在探讨曲妥珠单抗与EGCG对HER2过表达细胞株是否具有协同增殖抑制作用，为HER2高表达乳腺癌的治疗提供新的思路。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器

1.1.1   材料

EGCG（MedChemExpress公司），CCK-8检测试剂盒（美国bimake生物科技有限公司）；GAPDH一抗、AKT一抗、p-AKT一抗、MAPK一抗、p-MAPK一抗、EGFR一抗、p-EGFR一抗、HER2一抗、p-HER2一抗、抗兔IgG一抗、抗鼠IgG一抗、HRP抗体二抗（美国Cell Signaling Technology公司），凝胶过滤层析标准品（美国BIO-RAD公司），二抗Goat pAb to Human IgG（英国Abcam公司）。

1.1.2   细胞株

人乳腺癌细胞系BT474、SK-BR-3（购自中国科学院细胞库并保存于本实验室）。

1.1.3   仪器

AKTA Avant 25蛋白纯化仪、Imager 600超灵敏多功能成像仪（美国Cytiva公司）； Agilent 1200 series高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Spark多功能酶标仪（瑞士TECAN）； Intellicyt® iQue3 高通量流式细胞仪（德国赛多利斯）。

1.2   方法

1.2.1   曲妥珠单抗的表达与纯化

用含有曲妥珠单抗重链和轻链表达载体的质粒共转染Expi293F细胞7 d后收集培养上清液，用Protein A亲和层析法进行纯化。SEC-HPLC对抗体的纯度进行检测，并用流式细胞术检测曲妥珠单抗抗体与HER2过表达细胞株SK-BR-3、BT474的结合活性。

1.2.2   流式细胞术

细胞按3×10⁴个细胞/孔铺于V型底96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗按100 nmol/L的起始浓度，3倍比稀释，分成11个浓度梯度，末孔为PBS作为阴性对照，加入铺有细胞的96孔板中，每孔30 μl。曲妥珠单抗与细胞4℃共孵育1～2 h，用含0.1% BSA的PBS洗1遍，加入二抗Goat pAb to Human IgG，1∶200稀释，每孔30 μl，4℃孵育30 min。二抗孵育结束，用含0.1% BSA的PBS洗2遍，每孔加入30 μl 含0.1% BSA的PBS，用 Intellicyt^® iQue3 高通量流式细胞仪进行检测。

1.2.3   细胞培养

采用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养SK-BR-3细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养BT474细胞，培养条件为5% CO₂，37℃。当细胞密度达到80%～90%时进行传代，每周2～3次。取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.4   CCK8检测细胞增殖

将细胞按1×10⁴个细胞/孔的数量接种于96孔板中，在37℃、5% CO₂条件下培养24 h。每孔加入100 μl含设定浓度药物的培养基，培养48 h后，弃去孔内培养基，每孔加入100 μl含10%CCK8试剂的培养基，继续培养1～3 h，用酶标仪在450 nm测定光密度值（A），并计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（A_对照−A_实验）/（A_对照−A_背景）。联合给药组用CompuSyn软件计算CI值（药物联合指数），通过CI值的数值可以定量判断药物间相互作用的强度以及性质（CI>1为拮抗作用；CI=1为相加作用；CI<1为协同作用）。

1.2.5   Western blot检测

根据分组将细胞按5×10⁵个细胞/孔的数量接种于6孔板培养24 h。弃去原培养基，加入含设定浓度药物的培养基继续培养24 h。采用细胞裂解液试剂盒提取各组细胞总蛋白，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。按每泳道30 μg蛋白样品的上样量进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF膜。用5%脱脂奶粉在摇床上室温封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育1 h。一抗、二抗均按照抗体使用说明书稀释。洗膜后，加ECL发光液，用超灵敏多功能成像仪进行显影，并用ImageJ软件对条带进行灰度值分析。目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值 。

1.2.6   统计学方法

采用 GraphPad prism 8.0软件（Version X，USA）进行统计学分析和作图，用compuSyn软件计算联合指数。两组数据之间比较采用t检验，多组数据之间比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度

将表达纯化后的曲妥珠单抗用SEC-HPLC进行检测，结果显示曲妥珠单抗的纯度为100%，且分子量大小在150 kDa（1kDa=1×10³）左右（图1）。

图  1  SEC-HPLC检测曲妥珠单抗的纯度

注：A.曲妥珠单抗；B.凝胶过滤层析标准品

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2.2   流式细胞术验证曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474的结合活性

采用流式细胞术测定曲妥珠单抗与HER2过表达乳腺癌细胞株SK-BR-3和BT474的结合活性。结果显示，曲妥珠单抗以浓度依赖性的方式结合SK-BR-3和BT474细胞，其中，曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞株结合的EC₅₀值为1.128 nmol/L，与BT474细胞株结合的EC₅₀值为1.203 nmol/L，两者EC₅₀值大约一致（图2）。

图  2  流式细胞术检测曲妥珠单抗与SK-BR-3、BT474细胞的结合活性

注：A.曲妥珠单抗与SK-BR-3细胞的结合活性；B.曲妥珠单抗与BT474细胞的结合活性

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2.3   用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对BT474的增殖抑制作用

采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对BT474的增殖抑制作用。图3A和图3B结果显示， EGCG和曲妥珠单抗对BT474细胞均显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图3C结果显示EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图3D结果显示EGCG在一定浓度范围内（45～200 μmol/L）与16.67 nmol/L 曲妥珠单抗联用时显示有协同抗肿瘤作用（CI<1）。

图  3  EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞增殖的影响

注：A.EGCG对BT474细胞增殖的影响；B.曲妥珠单抗对BT474细胞增殖的影响；C.16.67 nmol/L曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、45 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与45 μmol/L EGCG联用对BT474细胞增殖的影响；D.16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对BT474细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；^*P<0.05，^****P<0.0001，与空白组比较；^△△△△P<0.0001，与IgG组比较；^####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较

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2.4   用CCK8法测定 EGCG 、曲妥珠单抗单独及联合对SK-BR-3细胞的增殖抑制作用

采用CCK8法测定EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联合对SK-BR-3的增殖抑制作用。图4A和图4B结果显示，EGCG和曲妥珠单抗均对SK-BR-3细胞显示出浓度依赖性的增殖抑制作用。图4C结果显示，EGCG和曲妥珠单抗联合给药组的增殖抑制作用显著强于单药组。图4D结果显示，EGCG在一定浓度范围内（7.5～120 μmol/L）与16.67 nmol/L曲妥珠单抗联用时有协同抗肿瘤作用（CI<1）。

图  4  EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对SK-BR-3细胞增殖的影响

注：A.EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响；B. 曲妥珠单抗对SK-BR-3细胞增殖的影响；C. 16.67 nmol/L 曲妥珠单抗、16.67 nmol/L IgG 曲妥珠单抗同型对照、15 μmol/L EGCG、16.67 nmol/L曲妥珠单抗与15 μmol/L EGCG联用对SK-BR-3细胞增殖的影响；D. 16.67 nmol/L曲妥珠单抗联合不同浓度EGCG对SK-BR-3细胞增殖的影响，计算联合指数（CI），Fa表示效应值；^**P<0.01，^***P<0.001，与空白组比较；^△△△P<0.001，与IgG组比较；^####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较

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2.5   Western blot法检测EGCG、曲妥珠单抗单用及二者联用对BT474细胞中EGFR、HER2、Akt、MAPK及其磷酸化蛋白表达的影响

图5A-F结果显示，EGCG单药、曲妥珠单抗单药及两者联用组均能显著降低BT474细胞中p-Akt、p-MAPK、p-EGFR的表达。图5G-H结果显示，曲妥珠单抗单药组能显著降低BT474细胞p-HER2的表达，EGCG单药组虽然无显著性差异（P>0.05），但对p-HER2的表达有一定抑制作用。与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞p-Akt、p-MAPK、p-EGFR、p-HER2蛋白的表达。

图  5  EGCG单药组、曲妥珠单抗单药组及两者联用组对BT474细胞中MAPK、Akt、EGFR、HER2及其磷酸化蛋白的表达的影响

注：A. p-Akt、Akt的蛋白表达水平；B. p-Akt、Akt的相对蛋白表达量；C. p-MAPK、MAPK的蛋白表达水平；D. p-MAPK、MAPK的相对蛋白表达量；E. p-EGFR、EGFR的蛋白表达水平；F. p-EGFR、EGFR的相对蛋白表达量；G. p-HER2、HER2的蛋白表达水平；H. p-HER2、HER2的相对蛋白表达量；^****P<0.0001，与对照组比较；^##P<0.01、^###P<0.001、 ^####P<0.0001，与曲妥珠单抗组比较

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3.   讨论

ErbB-2(HER-2/neu)是一种分子量为1.85×10⁵的穿膜受体络氨酸激酶，属于表皮生长因子受体家族^[14]。该家族由4个紧密相关的络氨酸激酶（TK）受体组成：HER1(EGFR)、HER2、HER3和HER4。HER2主要是通过与家族中的其他成员形成同源或异源二聚体，激活下游的RAS/MAPK和磷脂酰肌醇-3/激酶（PI3K）/ATK信号通路，进而促进细胞增殖、迁移、血管生成以及抑制细胞的凋亡^[15-16]。ERK/MAPK通路是参与细胞增殖控制的主要细胞内信号通路之一。 PI3K/ATK信号通路在控制Her-2/neu过表达细胞的生长和转化表型中起重要作用^[17-18]。HER2过表达的癌症表现出较强的转移能力和浸润能力，对化疗敏感性差，且易复发。

曲妥珠单抗是一株靶向HER2的人源化单克隆抗体。1998年，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准应用于治疗HER2阳性的转移性乳腺癌^[19]。曲妥珠单抗可能通过下调HER2受体在细胞膜上的表达，阻断HER2和HER3形成异源二聚体从而抑制下游通路，导致细胞周期阻滞，以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性活性^[20]等。虽然曲妥珠单抗单药治疗起到了一定的效果, 但大部分HER2过表达的乳腺癌患者对曲妥珠单抗治疗不产生反应，初次治疗有效率大约在30%, 即使对曲妥珠单抗产生反应的患者也有约50%会在1年内发生耐药。

茶多酚可以抑制多种与细胞增殖和肿瘤进展相关的酶活性。EGCG是茶多酚中的主要成分之一。研究显示，在人A431表皮样癌细胞中，EGCG可能通过阻断EGF与其受体的结合进而抑制EGFR活性^[21]。EGCG能抑制结肠癌细胞中EGFR、HER2、HER3的激活，并抑制细胞生长^[22]。

为了进一步提高HER2靶向治疗疗效，在本研究中我们探讨了曲妥珠单抗和EGCG在乳腺癌细胞的联合抗肿瘤作用。实验结果发现EGCG与曲妥珠单抗在一定浓度范围内可以协同抑制HER2过表达乳腺癌细胞的生长，提示临床治疗中如果利用EGCG和曲妥珠单抗联合治疗则需重点关注两者各自的剂量。可以先利用乳腺癌荷瘤小鼠模型对不同剂量的EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用进行评价，并参考动物体内药效实验的结果进行EGCG和曲妥珠单抗联合用药临床试验的设计，通过临床试验的结果确定临床治疗时最佳的联合用药剂量。

本研究还对EGCG和曲妥珠单抗的联合抗肿瘤作用机制进行了阐明：与EGCG和曲妥珠单抗单药组相比，EGCG与曲妥珠单抗联用可进一步显著降低BT474细胞中p-EGFR、p-HER2和p-Akt、p-MAPK的表达，提示EGCG和曲妥珠单抗联用对HER2过表达乳腺癌细胞的协同增殖抑制活性可能与其显著增强的对Akt和MAPK信号通路的抑制作用有关。本研究为EGCG与曲妥珠单抗的联合应用提供了理论支持，并为HER2过表达乳腺癌的治疗提供新的思路。