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围绝经期综合征（PMS）是指妇女从性成熟期步入老年期这一过渡阶段出现的一系列植物神经系统功能紊乱所导致的症状，又称“更年期综合征”。西医通常采用激素替代治疗，但临床禁忌证较多[1]，且获益-风险仍存在一定争议[2]。中药复方具有多靶点、不良反应少、疗效肯定、不易复发等特点，是PMS防治的理想选择之一[3]。复方滋阴颗粒根据上海市浦东新区公利医院中医科临床经验方滋肾养阴汤（滋阴补肾方）改制而成，具有便于服用、携带、储藏和运输的优点，患者耐受性更好[4]。经20余年临床应用和对该方先后进行的一系列临床研究证实，滋肾养阴方在改善PMS症候、调节雌激素受体及其相关蛋白的表达方面均有效验[5-7]。本课题组前期已顺利建立该颗粒的制备工艺和质控方法[8-9]。现以去卵巢大鼠为模型，研究复方滋阴颗粒对其性激素和氧化应激水平的影响，为该颗粒剂的临床应用提供实验依据。
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HH-4型水浴锅（江苏杰瑞尔电器有限公司）；TGL-16G-A型冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；JA5003AL型天平（上海景天电子仪器有限公司）；Biotek Synergy HT型酶标仪（香港基因有限公司）。
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复方滋阴颗粒、滋肾养阴汤剂均为上海市浦东新区公利医院药剂科自制，颗粒批号：171202，常温干燥避光保存，1.00 g浸膏粉相当于4.21 g生药；汤剂浓度为167 g生药/150 ml剂。六味地黄丸（兰州佛慈制药股份有限公司，批号：17C204），戊酸雌二醇片（拜耳广州分公司，批号：383A）分别临用前研磨后定容至所需浓度。注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号：F7112104），临用前加入注射用水现配现用。
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T-SOD测试盒（羟胺法，批号：20180726）、MDA测试盒（批号：20180730）、GSH-Px测定试剂盒（比色法，批号：20180731）均购于南京建成生物工程研究所；大鼠FSH ELISA试剂盒（批号：201807）、E2 ELISA试剂盒（批号：201807）、LH ELISA试剂盒（批号：201807）均购于上海哈灵生物科技有限公司。
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雌性SD大鼠，72只，清洁级，体重200~220 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2012 - 0002。饲养于上海中医药大学动物实验中心，温度22~24 ℃，湿度（40±5）%，每天12 h光照。适应性饲养1周后用于实验。
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除正常组外，其他雌性大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，假手术组大鼠切除两侧卵巢下方的部分脂肪组织后缝合，其他大鼠均切除两侧卵巢。术后3 d，每日1次肌内注射青霉素20万U，从第4天开始连续5 d阴道涂片观察动情周期，以动情周期无变化确定去除卵巢彻底[10]。
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除正常组和假手术组，将造模成功的大鼠随机分为模型组、六味地黄丸组（0.9 g生药/kg）、戊酸雌二醇组（0.2 mg/kg）、滋肾养阴汤剂组（16.7 g生药/kg）和复方滋阴颗粒低、中、高剂量组（5.0、10.0、20.0 g生药/kg）。手术后第7天开始，各药物组动物给予相应药液灌胃，正常组、假手术组和模型组大鼠给予等容积的蒸馏水灌胃，每日1次，每5 d称体重1次，随体重调整给药量，连续灌胃给药8周。
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将灌胃8周的大鼠禁食不禁水12 h，依据体重灌胃给药后，用25%乌来糖（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，室温静置1.0 h后离心10 min，转速4 000 r/min，取上层血清用于测定指标。采用ELISA法检测血清中E2、FSH、LH浓度；分别采用羟胺法和DTNB法检测血清中T-SOD 和GSH-Px 活性，采用TBA 法检测血清MDA 含量。所有操作均按试剂盒说明书进行。
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实验数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析。结果采用（
$\bar x$ ±s）形式表示。采用单因素方差分析方法，LSD法用于组间的两两比较，对于方差不齐者，采用Dunnett's T3法分析，对于正态不齐者，采用秩和检验法分析。以P<0.05为有统计学差异。 -
与假手术组相比，模型组大鼠血清E2显著降低，FSH水平显著升高（P<0.05或P<0.01）。与模型组相比，六味地黄丸组、戊酸雌二醇组、滋肾养阴汤剂组、复方滋阴颗粒中、高剂量组大鼠血清E2水平显著增加（P<0.05或P<0.01），所有给药组大鼠血清FSH水平显著降低（P<0.05或P<0.01），六味地黄丸组、汤剂组、颗粒中剂量组大鼠LH水平显著降低（P<0.05或P<0.01）。与戊酸雌二醇组相比，颗粒高剂量对E2水平的影响弱于戊酸雌二醇（P<0.05），而颗粒中剂量组的FSH水平明显高于戊酸雌二醇组（P<0.05）；而与六味地黄丸组、汤剂组相比，颗粒低、中、高剂量组则均无明显差异。具体见表1。
表 1 复方滋阴颗粒对围绝经期模型大鼠性激素水平的影响（
$\bar x$ ±s，n=8）组别 剂量（g生药/kg） E2（ng/L） FSH（IU/L） LH（ng/L） 正常组 — 6.36±0.06 2.57±0.02 438.03±3.89 假手术组 — 6.86±0.13 2.63±0.04 437.49±2.92 模型组 — 4.56±0.11## 2.94±0.02# 428.50±1.55 六味地黄丸组 0.9 6.76±0.13** 2.60±0.03** 393.35±2.38* 戊酸雌二醇组 0.2 mg/kg 6.94±0.11** 2.62±0.02** 408.66±2.66 滋肾养阴汤组 16.7 6.10±0.12** 2.60±0.02** 383.42±3.05* 复方滋阴颗粒组 低剂量 5.0 6.03±0.18 2.56±0.03** 382.25±6.30 中剂量 10.0 6.73±0.10** 2.71±0.03*▲ 367.96±2.13** 高剂量 2 0.0 5.80±0.14*▲ 2.70±0.02** 370.22±4.91 注：“—”表示不给药。
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；#P<0.05，##P<0.01，与假手术组比较；▲P<0.05，与戊酸雌二醇组比较。 -
与正常组相比，假手术组大鼠血清的T-SOD活性没有显著降低。与假手术组相比，模型组大鼠血清的T-SOD和GSH-Px活性显著降低（P<0.05），MDA含量没有显著变化。与模型组相比，各给药组大鼠血清T-SOD活性显著升高，MDA含量显著降低（P<0.05或P<0.01）；戊酸雌二醇组与复方滋阴颗粒中、高剂量组大鼠血清GSH-Px活性显著升高（P<0.05或P<0.01）。与六味地黄丸组相比，颗粒低、中、高剂量组在T-SOD、MDA和GSH-Px水平均无明显差异；与戊酸雌二醇组相比，颗粒低剂量升高T-SOD活性的作用强于戊酸雌二醇、使GSH-Px活性升高的作用弱于戊酸雌二醇（P<0.05），而颗粒中、高剂量组则无明显差异；与滋肾养阴汤剂组相比，颗粒中、高剂量升高GSH-Px水平作用更明显（P<0.05），而颗粒低剂量与汤剂比则无明显差异。具体见表2。
表 2 复方滋阴颗粒对围绝经期模型大鼠血清氧化应激水平的影响（
$\bar x$ ±s，n=8）组别 剂量（g生药/kg） MDA（nmol/ml） T-SOD（U/ml） GSH-Px（酶活力单位） 正常组 — 5.60±0.10 26.53±0.77 689.19±1.91 假手术组 — 5.78±0.09 24.03±0.25 669.60±7.95 模型组 — 6.59±0.20 21.12±0.36# 608.79±3.33# 六味地黄丸组 0.9 5.28±0.10** 26.84±0.38** 629.77±3.67 戊酸雌二醇组 0.2 mg/kg 4.69±0.10** 24.39±0.20* 668.24±4.15** 滋肾养阴汤组 16.7 4.40±0.07** 25.62±0.56* 621.89±3.44 复方滋阴颗粒组 低剂量 5.0 4.72±0.10** 28.30±0.54**▲ 627.04±2.79▲ 中剂量 10.0 5.28±0.07* 26.50±0.37** 670.17±5.78*△ 高剂量 20.0 4.93±0.12** 25.09±0.22** 674.04±6.10**△ 注：“—”表示不给药。
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；#P<0.05，与假手术组比较；▲P<0.05，与戊酸雌二醇组比较；△P<0.05，与滋肾养阴汤组比较。 -
目前学术界较为认可的PMS的发病机制是围绝经期性器官逐渐萎缩，卵巢停止排卵，以E2为主的雌激素和孕激素水平不断降低，对下丘脑-垂体反馈抑制作用减弱，进而LH和FSH浓度升高；同时卵泡产生抑制素减少，使LH和FSH浓度升高，下丘脑-垂体对雌激素敏感性降低，最终导致内分泌和植物神经系统紊乱，引起一系列临床症状[11]。从中医诊治角度，本病属阴虚证，病因多为肾精亏损，天葵衰竭，精血两虚，冲任不调，其中肾精亏损是其根本所在。因此治疗当以补肾虚为主[12-13]。方中生地、菟丝子共为君药，奏填精益髓，滋补肾阴之效；女贞子、墨旱莲、黄精、山茱萸共为臣药，助君药共行滋阴养血，益肝肾而补精之效；佐药茯苓、泽泻、淮山药利水渗湿，健脾宁心；牡丹皮清热凉血，制诸药温涩之性。现代药理学研究证明，女贞子、墨旱莲、菟丝子黄酮提取物具有雌激素样活性[14]。本实验中模型组大鼠血清E2明显降低，FSH水平明显升高，与临床PMS的激素变化吻合；复方滋阴颗粒、汤剂组均能显著升高血清E2水平，降低FSH和LH水平，作用与六味地黄丸、戊酸雌二醇相当。
衰老的机体存在着一定的抗氧化能力下降趋势，围绝经期阴虚火旺的症状与代谢过程中氧化还原反应增强有关[15]。体内MDA含量升高，SOD、GSH-Px等抗氧化酶活性降低，使过多的自由基聚集，线粒体内膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，导致新陈代谢紊乱，调节功能失调，加速衰老。SOD是需氧生物体内唯一可以消耗超氧化物自由基的酶蛋白，可阻断超氧化物自由基引发的一级反应，较高的SOD浓度对清除内环境代谢及药物等外环境引入的氧离子起积极作用；GSH-Px是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，可阻断脂质过氧化物引发的二级反应，减少对机体的损害；MDA则是脂质过氧化重要产物之一，具有细胞毒性[16]。三者均为反映机体自由基水平和清除自由基能力的主要指标。大量药理学研究结果表明，方中女贞子、墨旱莲、菟丝子、山茱萸、黄精等药味均具有抗氧化、抗衰老的作用。本研究结果表明，复方滋阴颗粒较其他组可显著升高血清T-SOD和GSH-Px活性，具有一定优势。
本研究证实复方滋阴颗粒可逆转去卵巢围绝经期模型大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴性激素分泌功能的异常情况，提高雌激素水平，并可提高机体抗氧化能力。与传统汤剂比较，该颗粒药效一致，且在剂型上有一定优势。本课题组将进一步进行复方滋阴颗粒的毒理学等研究，为其安全性提供依据。
Effects of compound Ziyin granule on sex hormones and oxidative stress levels of ovariectomized rats
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摘要:
目的 研究复方滋阴颗粒对去卵巢大鼠性激素和氧化应激水平的影响。 方法 实验分为模型组、六味地黄丸组、戊酸雌二醇组、滋肾养阴汤剂组和复方滋阴颗粒（低、中、高剂量）组、正常组和假手术组，给药8周，检测血清雌二醇（E2）、促卵泡素（FSH）、促黄体生成素（LH）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平。 结果 与模型组比较，复方滋阴颗粒（简称“颗粒”）中、高剂量可显著升高E2水平，中剂量可降低LH水平，低、中、高剂量均可降低FSH水平；颗粒中、高剂量可显著升高T-SOD、GSH-Px活性，降低MDA水平，低剂量则可升高T-SOD活性并降低MDA水平（P<0.05或P<0.01）。与戊酸雌二醇组比较，低剂量可明显升高T-SOD活性（P<0.05）；与汤剂组比较，颗粒中、高剂量可明显升高GSH-Px活性（P<0.05）。 结论 复方滋阴颗粒对去卵巢围绝经期模型大鼠垂体-卵巢轴的性激素分泌功能的异常有逆转作用，并提高其抗氧化能力。 Abstract:Objective To investigate the effect of compound Ziyin granule (CZG) on sex hormones and oxidative stress levels of ovariectomized rats. Methods The experiment was divided into model group, Liuwei Dihuang pill group, estradiol valerate group, Zishen Yangyin Decoction group, CZG (low, medium, high dose) group, ormal group and sham operation group. After administration for 8 weeks, serum estradiol (E2), follicle stimulation hormone (FSH), luteotropic hormone (LH), total-superoxide dismutase (T-SOD), malonaldehyde (MDA) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were measured. Results Compared with the model group, E2 was significantly raised at medium and high doses of CZG, LH was decreased at medium dose, and FSH was reduced at low, medium and high dose; medium and high dose of CZG were capable of remarkably increasing T-SOD, GSH-Px and decreasing MDA, and low dose raised T-SOD and reduced MDA (P<0.05 or P<0.01). Compared with estradiol valerate group, low dose of CZG significantly increased T-SOD (P<0.05). Compared with decoction group, GSH-Px was remarkably raised at medium and high dose (P<0.05). Conclusion The CZG could reverse the abnormal function of sex hormone secretion in the pituitary-ovary axis of the ovariectomy perimenopausal model rat and improve its antioxidant capacity. -
Key words:
- compound Ziyin granule /
- perimenopause /
- sex hormones /
- antioxidation capacity /
- rats
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类风湿关节炎(RA) 是一种以滑膜关节病变为主的慢性全身性、进行性自身免疫性疾病。疾病最早开始表现是滑膜炎，继而引发骨损伤及侵蚀，直至骨关节畸形及功能障碍[1-2]，RA动物模型中广泛使用的是佐剂性关节炎模型和胶原诱导的关节炎模型。佐剂性关节炎又称弗氏佐剂性关节炎，是建立免疫性关节炎动物模型的基本方法[3]。RA发病机制还不明确，目前缺乏理想的治疗方案。临床上治疗RA主要是非甾体类抗炎药、抗风湿药物及糖皮质激素等[4]，但往往因为药物的不良反应、价格等因素，难以坚持长期服药。
茵连痛风颗粒是上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院院内制剂，由菌陈、连钱草、伸筋草组成，具有清热利湿、通络的功效。其处方是依据沪上著名夏氏外科传人夏涵教授数年临床经验方制成，用于治疗痛风性关节炎，临床具有显著疗效[5]。本实验通过弗氏完全佐剂诱导大鼠关节炎模型，观察茵连痛风颗粒对佐剂性关节炎的影响，为茵连痛风颗粒的临床应用提供科学依据。
1. 材料
1.1 药物与试剂
茵连痛风颗粒（上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科自制，沪药制字：Z05050342，批号：1811001）；塞来昔布胶囊（辉瑞制药有限公司，批号：AN8171）；弗氏完全佐剂（Sigma 公司）； IL-10、IL-4、前动力蛋白（PK1、2）酶联免疫分析试剂盒均购自上海威奥生物科技有限公司。
1.2 动物
SD 大鼠，雄性，体重(160±10)g，[上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]。
1.3 仪器
酶标仪(型号:DENLEY DRAGON Wellscan MK3，公司：Thermo)；离心机(型号：TGL-168，公司：上海安亭科学仪器厂)；数字显示隔水式电热恒温培养箱（型号：PYX-DHS，公司：上海跃进医疗器械厂）；自制刻度软尺。
2. 方法
2.1 分组给药和模型建立
将48只SD雄性大鼠适应性饲养1周后，随机分为6组，每组8只。分别为正常组，模型组，塞来昔布阳性组（0.017 g/kg），茵连痛风颗粒高剂量组（15.4 g/kg），茵连痛风颗粒中剂量组（7.7 g/kg），茵连痛风颗粒低剂量组（3.8 g/kg）。除正常组外，其余各组大鼠右后足皮内注射弗氏完全佐剂 0.1 ml/足。注射弗氏完全佐剂后第8天，按照如上剂量灌胃给予相应浓度的受试药品，正常组和模型组给予等体积蒸馏水，每天给药1次，连续给药28 d。
模型鉴定：造模后各组大鼠的皮肤肿胀，皮肤温度及踝关节肿胀度与正常组之间是否有统计学差异，是模型成功与否的判定标准。
2.2 实验方法
2.2.1 大鼠一般情况和关节炎症状评分
分别在大鼠给药后7、14、28 d记录大鼠四肢关节病变程度，采用关节炎指数（AI）评分分级法评价大鼠病变程度。关节炎指数分为 5级（0～4分）：0分，关节无红肿；l分，单个趾关节明显红肿；2分，发红并（或）肿胀关节>l个；3分，整个足及跖关节明显红肿；4分，严重的关节肿胀或畸形。根据未注射佐剂的余下肢体的病变程度累计积分，计算出AI（各个关节的积分累计起来，即为每只大鼠的 AI）。
2.2.2 茵连痛风颗粒对大鼠踝关节肿胀度影响
分别于造模前、给药后1 d、以及每间隔8 d，用刻度软尺测量大鼠右后踝关节周长，并观察各组动物关节病变情况。按照下列公式计算踝关节肿胀率：踝关节肿胀率=(致炎后踝关节周长－致炎前踝关节周长) /致炎前踝关节周长×100% 。
2.2.3 对大鼠甲醛致痛的影响[6]
末次给药后2 h，于大鼠左足趾皮下注射50 μl 2.5%甲醛，观察1～10 min（第I时相）和10～30 min（第II时相）的行为反应。评分标准：第I时相抬足1次，计1分；第II时相舔足、咬足或抖足1次，计2分。计算30 min内的总得分。
2.2.4 血清炎症指标检测和病理组织观察
末次给药后禁食、禁水12 h，大鼠注射10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）进行麻醉，腹主动脉取血，离心取血清，用ELISA 法检测血清中IL-10、IL-4、PK1、PK2含量； 各组大鼠取左侧足掌肉垫，福马林固定，乙醇梯度脱水，石蜡包埋、切片和HE染色，病理组织学观察。
2.3 统计学分析
采用 SPSS 21.0 统计软件进行分析，实验数据以(
$ \bar x \pm s $ )表示，组间比较采用单因素方差分析。3. 结果
3.1 茵连痛风颗粒对大鼠一般情况及关节炎指数的影响
造模前各组大鼠毛色光亮，动作敏捷，精神状态和饮食均良好。模型组大鼠在造模后，自主活动减少、足底局部出现红肿，后期整只爪和关节均有不同程度肿胀，最初表现为足部肿胀，而后肿胀向上到达踝关节，肿胀部位皮肤发红，温度升高。随着时间延长，大鼠食欲减退，毛色暗黄，且运动功能逐渐减退。给予茵连痛风颗粒高、中、低剂量组及塞来昔布阳性组大鼠精神状态有所好转，关节肿胀度、食欲等有不同程度的缓解。表1结果表明，与模型组比较，给药7、14、28 d后，茵连痛风颗粒高、中剂量组和阳性组大鼠关节炎指数显著降低（P<0.01）。
表 1 茵连痛风颗粒对大鼠关节炎指数的影响 ($ \bar x \pm s $ ，n=8)组别 剂量(g/kg) 给药后关节炎指数 第7天 第14天 第28天 正常组 — 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 模型组 — 6.37±0.52## 9.63±0.74## 8.38±0.92## 阳性组 0.017 5.63±0.51** 6.50±0.93** 4.38±0.52** 高剂量组 15.4 5.50±0.53** 7.13±0.0.83** 4.13±0.64** 中剂量组 7.7 5.75±0.46** 8.13±0.0.83** 5.63±0.52** 低剂量组 3.8 5.88±0.35* 9.13±0.81 8.13±0.74 *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；##P<0.01，与正常组比较。 3.2 茵连痛风颗粒对大鼠踝关节肿胀度影响
表2结果显示，与同期正常组比较，模型组在给药第9天时肿胀率达峰值， 17d开始，肿胀逐日减轻，给药第9天开始，阳性组和茵连痛风颗粒高剂量组足肿胀与模型组比较，肿胀明显减轻，有显著统计学差异（P<0.01）；在给药第25、28天，茵连痛风颗粒中剂组与模型组有显著性差异（P<0.05），茵连痛风颗粒低剂组无明显差异。结果显示了茵连痛风颗粒对佐剂性关节炎大鼠原发足踝关节肿胀有剂量依赖性抑制作用。
表 2 茵连痛风颗粒对大鼠踝关节肿胀率的影响 ($ \bar x \pm s $ ，n=8)组 别
踝关节周长(l/cm)给药后踝关节肿胀率（%） 第1天 第9天 第17天 第25天 第28天 正常组 2.24±0.05 2.77±0.71 3.36±1.87 3.56±4.70 3.94±6.89 4.31±7.95 模型组 2.26±0.06 28.75±6.36## 30.09±8.24## 26.51±10.43## 25.44±12.90## 23.31±13.26## 阳性组 2.27±0.08 27.00 ±0.00 22.63±1.77** 20.61±1.45** 19.33±4.31** 18.45±4.67** 高剂量 2.22±0.05 27.54 ±1.03 23.85±1.56** 20.01±0.04** 18.14±1.52** 17.85±2.40** 中剂量 2.24±0.06 28.24 ±0.67 28.68±0.92 25.19±0.88 22.26±1.52* 21.85±2.40* 低剂量 2.28±0.07 29.48 ±0.21 29.49±2.23 26.05±0.99 25.01±0.32 24.10±0.28 *P<0.05，**P<0.01，与模型组比较； ##P<0.01，与正常组比较。 3.3 茵连痛风颗粒对大鼠甲醛致痛的影响
与模型组比较，在I时相和II时相，阳性组和茵连痛风颗粒高、中、低剂量组可显著降低甲醛致痛分值（P<0.01），表明茵连痛风颗粒具有很好的镇痛作用（表3）。
表 3 茵连痛风颗粒对大鼠甲醛致痛的影响 ($ \bar x \pm s $ ，n=8)组 别 剂量 (g/kg) 甲醛致痛分值 1~10 min（Ⅰ时相） 10~30 min（Ⅱ时相） 正常组 — 2.38±0.52 1.38±0.52 模型组 — 33.63±1.41## 14.88±1.64## 阳性组 0.017 11.38±1.06** 3.50±0.93** 高剂量组 15.4 12.13±0.99** 3.25±1.04** 中剂量组 7.7 16.00±1.60** 5.25±0.89** 低剂量组 3.8 19.38±1.19** 6.50±1.20** **P<0.01；与模型组比较； ##P<0.01，与正常组比较。 3.4 茵连痛风颗粒对IL-4、IL-10、PK1、PK2的影响
模型组大鼠IL-10，IL-4与正常组相比显著降低（P<0.01），炎性反应较明显；茵连痛风颗粒各组和阳性组均能升高IL-10，IL-4水平。同时，模型组大鼠 PK1、PK2水平与正常组相比显著升高（P<0.01），阳性组和茵连痛风颗粒各组均能降低两者水平，与模型组比较有显著差异 （P<0.01），其中，茵连痛风颗粒高剂量组更明显（表4）。
表 4 茵连痛风颗粒对大鼠血清IL-4、IL-10、PK1、PK2的影响 ($ \bar x \pm s $ ，n=8)组别 剂量 (g/kg)
IL-4
IL-10
PK1
PK2正常组 — 79.49±4.38 97.07±2.97 491.76±8.56 926.24±25.38 模型组 — 59.89±3.45## 20.99±2.78## 706.31±67.83## 1455.40±147.81## 阳性组 0.017 139.69±13.78** 98.94±6.72** 567.10±20.58** 1099.60±63.63** 高剂量组 15.4 101.45±7.05** 90.36±5.43** 365.49±27.65** 656.07±194.68** 中剂量组 7.7 95.60±4.52** 82.75±8.49** 433.91±22.29** 866.73±21.57** 低剂量组 3.8 72.50±3.09** 78.15±5.47** 529.20±12.79** 1015.51±18.36** **P<0.01，与模型组比较； ##P<0.01，与正常组比较。 3.5 病理观察
由图1可见，正常对照组足趾肉垫无炎症细胞浸润，而模型组可见大量淋巴细胞浸润。塞来昔布组可见淋巴细胞浸润程度的大幅度降低，而茵连痛风颗粒高、中、低剂量组均可降低淋巴细胞浸润，而以茵连痛风颗粒高剂量组最为显著。
4. 讨论
类风湿关节炎在中医归属“痹症”范畴，治疗以祛风除湿、散寒通络、扶正固本、清热解毒为主[7]。茵连痛风颗粒有茵陈、连钱草、伸筋草三味药材组成。茵陈作为君药，具有清利湿热、芳香舒脾、透表畅气之效；臣药连钱草，取其消石之功，防止痛风性尿路结石的产生，具有利湿通淋、清热解毒、散瘀消肿之功效；佐药伸筋草具有祛风除湿、舒筋活血之效，为治痹痛拘挛及伤损瘀肿之要药，配伍茵陈可以增强该复方利湿通络的作用。该方配伍符合中医理论对类风湿性关节炎的认识[8]。
弗氏佐剂关节炎动物模型是经典的类风湿关节炎模型，与类风湿性关节炎模型的病因、病症更接近。它能较为真实地反映类风湿关节炎的病理进程，与痛风性关节炎同属中医 “痹证”“白虎历节风”范畴，而且制备方法简便、易重复。常用于关节炎药物的药效评估[9]。IL-4、IL-10细胞因子在类风湿性关节炎患者中，起到十分重要的作用。这类细胞因子与滑膜炎性反应、增生及关节变形有着密切的关系。PK信号通路是近年新发现的调节通路，包括两种结构上关联的小分子肽PK1和PK2及相应的G蛋白偶联受体PK（PKR1和PKR2），PKs及其受体PKRs广泛分布在许多人体组织中。在免疫细胞中参与炎症发生和疼痛传递的重要环节，如PK2参与免疫调节，诱导骨髓细胞分化为单核细胞系和巨噬细胞系，并通过激活单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上的 PKRs，释放IL-1、IL-6、TNF-a等炎性细胞因子，触发和维持炎性疼痛，调节免疫炎症反应[10-11]。研究发现在前动力蛋白信号通路中加入PKRs激动剂可以显著降低IL-10和IL-4生成[12]。损伤组织中释放的PKs是免疫-炎症反应的一种自分泌或旁分泌的调节剂，能够刺激神经元中PKRs而增强伤害性感受器的敏感性，说明PKs信号通路在调节伤害性感受阈方面发挥重要功能，因此阻断PKs信号通路是目前治疗炎性疼痛的新策略[11]。然而，关于PK信号通路在中药镇痛方面的研究报道较少，其干预中药镇痛的具体机制有待进一步研究证实。本实验结果显示，茵连痛风颗粒可明显减轻RA大鼠足踝关节肿胀，按照人和大鼠之间的体表面积换算成大鼠的给药中剂量，并设置高、中、低3个剂量组。以高剂量组改善最为明显，并呈现剂量依赖性。同时，病理结果显示，茵连痛风颗粒高中低剂量组均可降低淋巴细胞浸润，以茵连痛风颗粒高剂量组最为显著。其作用机制可能是通过PK信号通路抑制PK1、PK2分泌，以及促进细胞因子IL-4、IL-10等分泌达到抗类风湿性关节炎的作用。为茵连痛风颗粒作用机制的阐明打下了基础。这些研究结果表明，茵连痛风颗粒对佐剂关节炎具有明显抑制作用，暗示其对类风湿关节炎的治疗前景，作用机制有待进一步研究。
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表 1 复方滋阴颗粒对围绝经期模型大鼠性激素水平的影响（
$\bar x$ ±s，n=8）组别 剂量（g生药/kg） E2（ng/L） FSH（IU/L） LH（ng/L） 正常组 — 6.36±0.06 2.57±0.02 438.03±3.89 假手术组 — 6.86±0.13 2.63±0.04 437.49±2.92 模型组 — 4.56±0.11## 2.94±0.02# 428.50±1.55 六味地黄丸组 0.9 6.76±0.13** 2.60±0.03** 393.35±2.38* 戊酸雌二醇组 0.2 mg/kg 6.94±0.11** 2.62±0.02** 408.66±2.66 滋肾养阴汤组 16.7 6.10±0.12** 2.60±0.02** 383.42±3.05* 复方滋阴颗粒组 低剂量 5.0 6.03±0.18 2.56±0.03** 382.25±6.30 中剂量 10.0 6.73±0.10** 2.71±0.03*▲ 367.96±2.13** 高剂量 2 0.0 5.80±0.14*▲ 2.70±0.02** 370.22±4.91 注：“—”表示不给药。
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；#P<0.05，##P<0.01，与假手术组比较；▲P<0.05，与戊酸雌二醇组比较。
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表 2 复方滋阴颗粒对围绝经期模型大鼠血清氧化应激水平的影响（
$\bar x$ ±s，n=8）组别 剂量（g生药/kg） MDA（nmol/ml） T-SOD（U/ml） GSH-Px（酶活力单位） 正常组 — 5.60±0.10 26.53±0.77 689.19±1.91 假手术组 — 5.78±0.09 24.03±0.25 669.60±7.95 模型组 — 6.59±0.20 21.12±0.36# 608.79±3.33# 六味地黄丸组 0.9 5.28±0.10** 26.84±0.38** 629.77±3.67 戊酸雌二醇组 0.2 mg/kg 4.69±0.10** 24.39±0.20* 668.24±4.15** 滋肾养阴汤组 16.7 4.40±0.07** 25.62±0.56* 621.89±3.44 复方滋阴颗粒组 低剂量 5.0 4.72±0.10** 28.30±0.54**▲ 627.04±2.79▲ 中剂量 10.0 5.28±0.07* 26.50±0.37** 670.17±5.78*△ 高剂量 20.0 4.93±0.12** 25.09±0.22** 674.04±6.10**△ 注：“—”表示不给药。
*P<0.05，**P<0.01，与模型组比较；#P<0.05，与假手术组比较；▲P<0.05，与戊酸雌二醇组比较；△P<0.05，与滋肾养阴汤组比较。
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