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维生素K对成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的影响

蒋益忠 夏天爽 辛海量 金玉娥 蒋益萍 薛黎明

石志群, 高迎春, 张冬梅, 陈克明, 景临林, 马慧萍. 7-羟乙基白杨素对高原脑水肿的作用机制初探[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(5): 399-402, 415. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202205090
引用本文: 蒋益忠, 夏天爽, 辛海量, 金玉娥, 蒋益萍, 薛黎明. 维生素K对成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的影响[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 340-345. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001077
SHI Zhiqun, GAO Yingchun, ZHANG Dongmei, CHEN Keming, JING Linlin, MA Huiping. A preliminary study on the mechanism of 7-HEC on high altitude cerebral edema[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(5): 399-402, 415. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202205090
Citation: JIANG Yizhong, XIA Tianshuang, XIN Hailiang, JIN Yu'e, JIANG Yiping, XUE Liming. Effects of vitamin K on osteoblastic bone formation and osteoclastic bone absorption[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 340-345. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001077

维生素K对成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001077
基金项目: 上海市卫生和计划生育委员会面上项目(201740068)
详细信息
    作者简介:

    蒋益忠,本科,主治中医师,Email:msjyz@163.com

    通讯作者: 蒋益萍,实验师,研究方向:中药抗骨质疏松药理,Tel:(021)81871305,Email:msjyp@163.com薛黎明,副主任技师,研究方向:骨质疏松症与组织蛋白酶K研究,Email:lm.xue@hotmail.com
  • 中图分类号: R15

Effects of vitamin K on osteoblastic bone formation and osteoclastic bone absorption

  • 摘要:   目的  比较维生素K1(VK1)、维生素K2(MK4)、维生素K2(MK7)和维生素K3(VK3)促进骨形成和抑制骨吸收的作用。  方法  采用新生大鼠颅盖骨分离成骨细胞和以核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导骨髓单核细胞的破骨细胞为模型,用磷酸苯二钠法检测成骨碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性;用CellTilter试剂盒检测破骨细胞代谢活力;用Z-FR-MCA荧光底物和胶原底物降解检测组织蛋白酶K(CTSK)抑制作用。  结果  MK4和MK7在0.1~1 μmol/L时显著促进成骨细胞增殖(P<0.05),1 μmol/L时显著提高ALP活性和骨结节形成面积,VK3抑制了骨结节形成(P<0.05)。VK1、VK3、MK4和MK7在1 μmol/L时对破骨细胞代谢活力均无影响,MK4和MK7在0.1~1 μmol/L时显著抑制TRAP活性(P<0.05),而VK1和VK3无抑制作用。MK4在25 μmol/L可对CTSK与Z-FR-MCA底物结合的抑制率达58.9%,在100 μmol/L对CTSK胶原降解的抑制率达73.2%。  结论  相较于VK1和VK3,MK7和MK4有显著促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞骨吸收的作用,MK4能显著抑制破骨细胞CTSK酶活性。
  • 随着我国经济的发展以及居民生活水平的提高,越来越多的人来到高原生活、工作和旅游,但由于高原地区氧分压较低,高原病的发病率呈现逐年上升的趋势[1]。高原脑水肿(HACE)是高原病发生发展过程中最为严重的阶段,其临床表现为头痛、协调丧失、虚弱、意识水平降低[2],并对机体造成不可逆的损伤。7-羟乙基白杨素(7-hydroxyethyl chrysin,7-HEC)是课题组前期筛选发现并合成的具有自主知识产权的抗高原缺氧化合物[3],研究发现[4-5],其对脑缺血再灌注大鼠和模拟高原低压性缺氧致脑组织损伤大鼠均具有明显的保护作用,并能够减轻低压低氧诱导的认知功能损伤[6],在抗高原缺氧方面表现出优异的活性与前景。因此,本文主要从7-HEC对高原脑水肿的可能作用机制出发,探究其与自噬、周期、凋亡等通路之间的关系,为防治高原脑水肿的可能作用机制奠定基础。

    27只SPF级雄性Wistar大鼠(体重180~200 g),购自联勤保障部队第九四〇医院动物实验科,合格证号:SCXX(军)2012-0029,动物伦理委员会编号:2021KYLL173。

    7-HEC由实验室景林临副教授自行合成;MDA、SOD试剂盒(南京建成生物工程研究所);CDK2、CDK6、CyclinD1、CyclinE2、PARP、Bax、Bcl-2、P62、LC3B抗体(英国Abcom公司);BCA蛋白试剂盒(Solarbio公司);脱脂奶粉(美国BD公司);Western Bright TM ECL(美国Advansta)。

    IEC-Micromax高速离心机(美国ThermoElectron公司);Tissuelyser快速研磨仪(上海净信科技公司);BP210S电子天平(赛多利斯有限公司);HP-8453紫外分光光度计(美国惠普公司);SpectraMax i3全自动荧光酶标仪(美国Molecular Devices公司);FLYDWC20-ⅡA大型低压低氧动物实验舱(中航贵州风雷航空军械有限责任公司)。

    将27只SPF级雄性Wistar大鼠适应性饲喂3 d后,随机分为3组,正常对照组、缺氧模型组、7-HEC给药组。给药组连续灌胃7-HEC(350 mg/kg)7 d,对照组和模型组给予等量灭菌注射用水。第四天,模型组和给药组放入大型低压低氧动物实验舱中,以10 m/s速度减压上升至相当于海拔6000 m处,缺氧处理3 d后处死,取脑组织。缺氧处理期间,氧舱温度:8:00~20:00,12 ℃,20:00~次日8:00,2 ℃;动物自由摄食及饮水;给药组继续灌胃给药。

    每组分别取6只大鼠脑组织标本,准确称重后,按质量(g)∶体积(ml)=1∶9 加入生理盐水制成10 %组织匀浆,采用WST-1法检测SOD活性、采用硫代巴比妥酸法检测MDA含量,以上操作均按试剂盒说明书进行。

    每组选取3只大鼠脑组织,称重后加入9倍量高效裂解液,使用组织研磨仪进行组织匀浆,于冰上裂解30 min,低温离心后吸取上清匀浆液10 μl,BCA法测蛋白含量,剩余上清与4×上样缓冲液按体积3∶1比例混匀,封口膜封口,95 ℃煮沸10 min进行蛋白变性,取等量蛋白样品上样,采用 SDS-PAGE 进行分离,电泳完成后将蛋白转至PVDF膜上,含5 %脱脂牛奶室温封闭2 h,一抗4 ℃孵育过夜。用TBST缓冲液漂洗4次,每次10 min。加入二抗,室温孵育2 h,TBST缓冲液洗涤PVDF膜4次,每次10 min。配制ECL发光液,按照A液和B液1∶1进行配制,涂抹发光液,放入ChemiDoc MP Imaging System全能型成像系统进行曝光。用Image J软件对蛋白条带进行灰度值分析。

    实验结果以($ \bar x \pm s $)表示,采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析,选用单因素方差分析法进行组间变量分析,LSD-t 法比较组间差异。以P<0.05表示有显著性差异,以P<0.01表示有极显著性差异。

    大鼠脑组织中氧化应激相关指标MDA与SOD的测定结果如图1所示,与对照组相比,缺氧组大鼠脑组织中MDA含量显著性升高,SOD活力显著性下调(P<0.05),当给予7-HEC时,缺氧组大鼠脑组织中MDA含量下调,SOD活力上调,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结果提示,7-HEC可能参与机体氧化应激的调节,起到防护高原脑水肿的效果。

    图  1  各组脑组织中MDA含量及SOD活力比较($ \bar x \pm s $n=6)
    #P<0.05,与对照组比较;*P<0.05,与模型组比较

    图2所示,大鼠脑组织中PARP与Bcl-2的蛋白表达在缺氧组下调,给药后显著上调(P<0.01),大鼠脑组织中Bax的蛋白表达在缺氧组上调,给药组显著下调(P<0.01),为进一步探讨Bcl-2与Bax对凋亡的易感性,对Bax/Bcl-2的比例进行比较,结果显示,与对照组相比,缺氧组显著下降,与缺氧组相比,给药组极显著上调(P<0.01)。结果提示,7-HEC可能参与细胞凋亡从而防治高原脑水肿。

    图  2  大鼠脑组织中凋亡相关蛋白电泳图及蛋白表达量($ \bar x \pm s $n=3)
    #P<0.05,##P<0.01,与对照组比较;*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较

    图3所示,与对照组相比,大鼠脑组织中周期相关蛋白CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2的表达在缺氧组均下调(P<0.05);与缺氧组相比,在给药组中,CyclinE2、CyclinD1、CDK6、CDK2蛋白的表达显著上调(P<0.05)。结果提示,7-HEC可能参与细胞周期调控从而防治高原脑水肿。

    图  3  大鼠脑组织中周期相关蛋白电泳图及蛋白表达量($ \bar x \pm s $n=3)
    #P<0.05,##P<0.01,与对照组比较;*P<0.05,**P<0.01,与模型组比较

    图4所示,大鼠脑组织中P62的蛋白表达在缺氧组极显著上调,给药后显著下调(P<0.01);与对照组相比,大鼠脑组织中LC3-B的蛋白表达在缺氧组显著下降,与缺氧组相比,给药组极显著上调(P<0.01)。结果提示,7-HEC可能参与细胞自噬过程从而防治高原脑水肿。

    图  4  大鼠脑组织中自噬相关蛋白电泳图及蛋白表达量($ \bar x \pm s $n=3)
    #P<0.05,##P<0.01,与对照组比较; **P<0.01,与模型组比较

    氧化应激是一种有害事件,可导致活性氧大量产生或抗氧化防御功能不足,损害神经血管单元的完整性,造成神经元不可逆死亡,进而血脑屏障破坏形成脑水肿[8]。MDA是脂质过氧化的产物,其含量可以间接反映组织氧化应激的水平,SODs是一类具有催化超氧化物生成过氧化氢的抗氧化酶[9],可以直接或间接地反映氧化应激的水平。本研究发现,经给药干预后,大鼠脑组织MDA含量显著降低,SOD活力显著提高,表明7-HEC可改善脑水肿大鼠的氧化损伤,从而对脑水肿起到一定的预防作用。

    研究表明,缺氧与细胞周期、凋亡、自噬密切相关,细胞周期蛋白表达异常会引发细胞凋亡[10]。细胞周期失调的细胞有机会通过DNA损伤反应的各种机制来阻止DNA修复、细胞周期调节和DDR基因转录。目前研究认为,自噬是另一种DDR机制,它通过促进或防止细胞死亡来应对DNA损伤,从而发挥作用[11]。细胞周期从G1期到S期的调节因子是CDK2蛋白,自噬主要影响细胞周期的G1期和S期,因此自噬与周期也存在密不可分的关系。

    细胞凋亡是一种受基因调控的细胞程序性死亡方式,是一种正常的生理变化。缺氧是细胞凋亡的诱导因子之一,细胞凋亡加剧是低氧环境诱发机体机能损伤的重要途径[12]。其受Bax和Bcl-2控制。Bcl-2蛋白的过表达在动物模型中被证明可以减轻肝和肾的损伤,而Bax的过度表达则可诱导细胞凋亡[13]。本实验的结果表明,缺氧组大鼠脑组织中Bax/Bcl2比值降低,诱导细胞凋亡,加重脑水肿,7-HEC可上调Bax/Bcl2比值,进而抑制细胞凋亡,起到抗高原脑水肿的作用。

    细胞周期在细胞增殖和分裂中起着关键作用,其由两类蛋白精确调控,CDKs、cyclin作为关键的周期蛋白。这两类蛋白决定了细胞维持在停滞状态或继续进行细胞周期。细胞周期抑制已被证明可以提供神经保护,减少星形胶质细胞瘢痕形成和微胶质激活,并改善创伤性脑损伤后的运动和认知恢复[14]。在本实验中,缺氧环境可下调周期蛋白的表达,而7-HEC可上调周期蛋白的表达,对高原脑水肿起到一定的预防作用。

    缺氧与自噬密切相关。缺氧条件下,会诱导自噬的发生。自噬是一种高度调控的连续过程,它是一种重要的程序性细胞死亡[15]。LC3蛋白与P62蛋白相互作用,是自噬的标志物。P62蛋白通常存在于自噬体中,并在自溶酶体形成时被降解[16]。LC3蛋白是哺乳动物自噬蛋白和自噬小体标记物,LC3B是自噬体标记的四种不同亚型中使用最广泛的一种。自噬受体包括P62等一系列连接泛素化底物和LC3的适配器,自噬体一旦形成,就会经历成熟阶段,然后与溶酶体融合,发生自噬。此外,P62还可调节细胞凋亡,主要通过选择性减少胞质中促凋亡蛋白来减轻细胞死亡,保护机体免受伤害[17]。在本实验中7-HEC可下调P62、上调LC3B的表达,从而促进自噬,保护机体免遭高原脑水肿损害。

    凋亡、自噬、周期三种生物过程相互联系,相互影响,作用于机体,保障机体的正常运行。凋亡、自噬、周期相关因子的变化又会影响氧化应激通路的发生发展。在本实验中,7-HEC降低大鼠脑组织中MDA含量,上调SOD含量,从而抑制HACE引发的氧化应激;其还可上调周期和自噬蛋白的表达,从而增强大鼠脑神经元细胞的增殖活性,加速损伤细胞的自噬,保护机体免受HACE的损害。综上,7-HEC可抑制细胞凋亡和周期,增强自噬,进而抑制机体氧化应激,从而达到防护高原脑水肿的作用。

  • 图  1  维生素K对成骨细胞活性的影响

    A.细胞增殖;B.ALP活性;C.骨结节面积(×200) * P<0.05,**P<0.01,与对照组比较。

    图  2  维生素K对破骨细胞活性的影响

    A.细胞代谢活性;B.TRAP活性 *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,与对照组比较。

    图  3  维生素K抑制CTSK活性

    A.Z-FR-MCA活性;B.SDS-PAGE胶原降解图;C.相对胶原降解抑制率

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出版历程
  • 收稿日期:  2020-01-17
  • 修回日期:  2020-04-13
  • 网络出版日期:  2020-07-27
  • 刊出日期:  2020-07-25

维生素K对成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的影响

doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001077
    基金项目:  上海市卫生和计划生育委员会面上项目(201740068)
    作者简介:

    蒋益忠,本科,主治中医师,Email:msjyz@163.com

    通讯作者: 蒋益萍,实验师,研究方向:中药抗骨质疏松药理,Tel:(021)81871305,Email:msjyp@163.com薛黎明,副主任技师,研究方向:骨质疏松症与组织蛋白酶K研究,Email:lm.xue@hotmail.com
  • 中图分类号: R15

摘要:   目的  比较维生素K1(VK1)、维生素K2(MK4)、维生素K2(MK7)和维生素K3(VK3)促进骨形成和抑制骨吸收的作用。  方法  采用新生大鼠颅盖骨分离成骨细胞和以核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导骨髓单核细胞的破骨细胞为模型,用磷酸苯二钠法检测成骨碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)活性;用CellTilter试剂盒检测破骨细胞代谢活力;用Z-FR-MCA荧光底物和胶原底物降解检测组织蛋白酶K(CTSK)抑制作用。  结果  MK4和MK7在0.1~1 μmol/L时显著促进成骨细胞增殖(P<0.05),1 μmol/L时显著提高ALP活性和骨结节形成面积,VK3抑制了骨结节形成(P<0.05)。VK1、VK3、MK4和MK7在1 μmol/L时对破骨细胞代谢活力均无影响,MK4和MK7在0.1~1 μmol/L时显著抑制TRAP活性(P<0.05),而VK1和VK3无抑制作用。MK4在25 μmol/L可对CTSK与Z-FR-MCA底物结合的抑制率达58.9%,在100 μmol/L对CTSK胶原降解的抑制率达73.2%。  结论  相较于VK1和VK3,MK7和MK4有显著促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞骨吸收的作用,MK4能显著抑制破骨细胞CTSK酶活性。

English Abstract

石志群, 高迎春, 张冬梅, 陈克明, 景临林, 马慧萍. 7-羟乙基白杨素对高原脑水肿的作用机制初探[J]. 药学实践与服务, 2022, 40(5): 399-402, 415. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202205090
引用本文: 蒋益忠, 夏天爽, 辛海量, 金玉娥, 蒋益萍, 薛黎明. 维生素K对成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收的影响[J]. 药学实践与服务, 2020, 38(4): 340-345. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001077
SHI Zhiqun, GAO Yingchun, ZHANG Dongmei, CHEN Keming, JING Linlin, MA Huiping. A preliminary study on the mechanism of 7-HEC on high altitude cerebral edema[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2022, 40(5): 399-402, 415. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202205090
Citation: JIANG Yizhong, XIA Tianshuang, XIN Hailiang, JIN Yu'e, JIANG Yiping, XUE Liming. Effects of vitamin K on osteoblastic bone formation and osteoclastic bone absorption[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service, 2020, 38(4): 340-345. doi: 10.12206/j.issn.1006-0111.202001077
  • 维生素K(VK),又称凝血维生素,是一类具有叶绿醌生物活性的脂溶性维生素。除具有凝血功能外,维生素K还能促进骨代谢,防治骨质疏松症,天然VK1和VK2(主要活性体为MK4和MK7)可单独或协同其他抗骨质疏松药物治疗骨质疏松症[1-4],人工合成的VK3也有少量抗骨质疏松研究报道[5-6],然而,不同维生素K的抗骨质疏松作用的比较研究非常有限。有研究发现维生素K具有促进骨形成和抑制骨吸收的双向调节机制[7],药理研究发现VK1、MK4和MK7能显著促进小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖和碱性磷酸酶(ALP)活性[8],同时报道VK1、MK4和MK7也能显著抑制RANKL诱导骨髓单核细胞分化的破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)基因和组织蛋白酶K(CTSK) mRNA表达[9]。临床报道发现VK2能显著降低绝经后骨质疏松的TRAP和CTSK表达[10]。CTSK是骨吸收过程中的关键溶骨活性酶[11],与粘多糖(glycosaminoglycan, GAG),如硫酸软骨素(CSA),形成一种高分子量的复合物,可将胶原蛋白降解。目前尚未有VK对CTSK骨胶原降解的研究报道。本研究以新生大鼠颅盖骨分离成骨细胞和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)诱导骨髓单核细胞的破骨细胞为模型[12],系统比较VK1、MK4、MK7和VK3对成骨细胞增殖和ALP活性、破骨细胞分化、TRAP活性和CTSK降解胶原活性的影响。通过比较不同VK抗骨质疏松作用,对临床选用合适的VK营养补充剂、指导人群VK膳食补充,以满足我国人群骨健康需求具有重要意义。

    • 新生3 d的SD大鼠,雌雄不限,购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2012-0002];II型胶原酶、胰蛋白酶、特级胎牛血清、α-MEM培养基(美国Gibco公司);CellTriter-blue试剂(美国Promega™),核刺激因子受体的配体(receptor for activation of nuclear factor kappa B ligand, RANKL,400-30)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF,400-28)购自PEPROTECH公司,淋巴细胞分离液Ficoll-Paque密度梯度液(GE)购自上海生工生物工程技术服务有限公司;TRACP染色试剂盒、Benzyloxycarbonyl-Phe-Arg-7-amido-4-methylcoumarin (Z-FR-MCA)购自日本WAKO公司;L-3-carboxy-trans-2-3-epoxypropionyl-leucylamido-(4guanidino)-butane(E-64)、硫酸软骨素A (CSA)胃蛋白酶、组织蛋白酶K抑制剂奥当卡替(odanacatib, ODN)、VK1、MK4、MK7和VK3,购自Sigma公司;I型胶原(美国Affymetrix公司);牛血清白蛋白、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、多聚甲醛等试剂均为国产分析纯。

    • 实验室自建原代成骨细胞培养方法[12]。取新生3 d的SD大鼠5只,在无菌条件下取其颅顶盖骨,去除骨膜、血管及结缔组织,用D-Hanks液冲洗干净,用0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化30 min,再用0.05%胰蛋白酶及3 mg/ml的II型胶原酶37 ℃消化1 h,经100目滤网过滤,1 000 r/min离心10 min,即为新鲜的成骨细胞,加入10%胎牛血清的α-MEM培养基,置37 ℃,5% CO2培养箱。取第四代大鼠颅盖骨成骨细胞,消化分离出来,以α-MEM培养基配制成浓度为2×104/ml的细胞悬液,以100 μl/孔接种于96孔培养板,设12个药物组,分别为1、0.1和0.01 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3,每组选取1个药物浓度加入1、0.1和0.01 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3,培养48 h,用MTT法检测细胞增殖活性。ALP活性需要连续培养6 d后,用100 μl 50 mmol/L的二乙醇胺,50 μl 2.5 mmol/L的对硝基苯酚磷酸二钠,37 ℃反应30 min后,用0.3 mol/L的NaOH终止反应,于波长405 nm处测得吸光度值[12-13]

    • 取成骨细胞第三代细胞,按每孔5×104的细胞数接种于12孔板内,α-MEM培养基培养24 h,换骨结节诱导培养基(0.1%BSA,10 nmol/L地塞米松,10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 μg/ml抗坏血酸以及10%胎牛血清的α-MEM培养基),加入1 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3后,每3 d换药1次,连续培养观察14 d后,用0.1%茜素红-Tris-Hcl染液(pH 8.3)染色。染色前,用预冷的10%中性甲醛缓冲液固定10 min,PBS冲洗3次。加入0.1%茜素红-Tris-Hcl染液(pH 8.3),37 ℃下染色30 min。蒸馏水冲洗,干燥,封片。倒置相差显微镜(Leica DMI 3000)下进行观察并随机拍照10张,用image-Pro Plus (IPP 6.0)分析图片,得出每张图片骨结节面积[13]

    • 取新生3 d的SD大鼠胫骨,用α-MEM培养基冲洗骨髓腔以收集骨髓细胞,加入等量Ficoll试剂分离骨髓单核细胞,用含有25 ng/ml M-CSF、25 ng/ml RANKL的细胞因子和10%胎牛血清的α-MEM培养基进行培养,每3 d换液1次,6 d后破骨细胞分化成熟。细胞成熟后,以1×105/ml接种于96孔板,加入1、0.1和0.01 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3。继续培养48 h后,取100 μl培养基,加入20 μl CellTriter-blue试剂,轻轻晃10 s混匀,37 ℃孵育30 min后,将96孔板置于荧光分光光度计,检测细胞悬液荧光强度(发散光波长560 nm,吸收光波长590 nm)。

    • 成熟破骨细胞以1×105/ml接种于96孔板内,加入1、0.1和0.01 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3,培养48 h后,弃上清液,PBS冲洗2次,20 µl 0.1%Triton X-100室温破碎细胞15 min,加入100 µl反应液(0.4 g对硝基苯基磷酸二钠,去离子水溶解后加入2.0 g酒石酸钾钠,加水溶解至150 ml,HCl调节pH至3.5,再加水定容至200 ml),于37 ℃反应30 min,迅速加入100 µl 1 mol/L的NaOH终止反应,于波长405 nm处测定其吸光度值[14]

    • 25 μmol/L的VK1、MK4、MK7、VK3和1 μmol/L阳性药Odanacatib用100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5,包含2.5 mmol/L DTT,和2.5 mmol/L EDTA)稀释至浓度为25 μmol/L加入96孔板,最终反应容量为0.2 ml,加入终浓度为5 nmol/L的CTSK孵育5 min,加入5 μl底物1 mmol/L的Z-FR-MCA溶液开始反应,检测5 min荧光信号(发散光波长460 nm,吸收光波长355 nm)。实验设阴性对照,阳性对照(1 μmol/L E-64)。

      计算公式:抑制率(%)=100-(1-Vi/V0)。

      Vi和V0分别表示存在和不存在VK情况下,记录荧光信号强度随时间变化斜率slope值[11]

    • 可溶性I型胶原溶解在100 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH5.5,包含2.5 mmol/L DTT和2.5 mmol/L EDTA),最终I型胶原浓度为0.6 mg/ml,加入终浓度100 μmol/L的VK1、MK4、MK7和VK3及10 μmol/L阳性对照药Odanacatib,依次将CTSK和CSA(终浓度分别为400和200 nmol/L)加入含有I型胶原蛋白的反应液中,使总反应液容量为50 μl。混匀,28 ℃孵育4 h,取出后加入1 μl的100 μmol/L E64终止反应。采用10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离,卡马斯亮蓝染色20 min,用乙酸-甲醇(4∶1)脱色。I型胶原的α1条带的灰度用Gene Snap(Syngene Inc.Frederick,MD)软件进行定量分析[14]

    • 每组实验重复3次。采用SPSS软件经ANOVA方差分析检验(α=0.05),再用SNK对每两组进行两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。

    • VK1和VK3在0.01~1 μmol/L浓度范围内对成骨细胞增殖和ALP活性均未有影响(图1A1B)。MK4在0.01和0.1 μmol/L浓度显著促进了成骨细胞增殖活性,分别提高了15.5%和23.0%(P<0.05),而MK7分别提高了25.1%和18.4%。MK4和MK7在1 μmol/L显著提高了ALP活性(P<0.05),促进率分别为30.2%和25.7%。成骨细胞在骨结节诱导培养基培养14 d后,经茜素红染色液染色,骨结节处形成红色钙化晶体,骨结节的面积代表了成骨细胞的钙化程度(图1C),结果显示MK4和MK7在1 μmol/L浓度时显著提高了骨结节形成面积(P<0.05),分别增加25.2%和34.0%,VK3显著抑制了骨结节的形成。

      图  1  维生素K对成骨细胞活性的影响

    • 图2A可得,VK1、VK3、MK4和MK7在0.01~1 μmol/L浓度对破骨细胞代谢活力均无影响,对破骨细胞无毒性。VK1、MK4和MK7在1 μmol/L表现出抑制TRAP活性,抑制率分别为27.4%、54.0%和35.0%,MK4在0.01和0.11 μmol/L浓度显著降低了破骨细胞TRAP活性(P<0.01),分别降低了50%和41%,MK7在0.1 μmol/L浓度时,TRAP活性显著降低26.8%(图2B)。

      图  2  维生素K对破骨细胞活性的影响

    • 本研究考察VK1、VK3、MK4和MK7抑制CTSK与Z-FR-MCA底物结合活性。图3A结果显示,1 μmol/L的ODN抑制了CTSK与Z-FR-MCA底物结合效率达98.3%,而25 μmol/L的VK3、MK4、MK7和VK1抑制率分别为0.3%、58.9%、16.6%和9.4%。与空白胶原相比,VK3、MK4、MK7和VK1在100 μmol/L抑制胶原降解效率达30.8%、73.8%、18.4%和19.2% (图3B3C),仅有MK4和ODN超过60%的抑制率,与未加CSA的CTSK阴性对比,抑制率达38.8%、93.0%、23.1%和24.2%。与空白胶原组对比,阳性抑制剂ODN在1 μmol/L的抑制率达77.3%,与未加CSA的CTSK阴性对比,抑制率达到99.0%。

      图  3  维生素K抑制CTSK活性

    • 研究报道VK1、MK4和MK7能显著促进成骨细胞活性和抑制破骨细胞活性[9-10]。临床报道服用高含量维生素K1能够降低髋部骨折风险和提高髋部及腰椎部骨密度,可延缓50~60岁绝经后女性的骨丢失[2]。同时药理研究发现VK3显著促进去卵巢大鼠的骨密度和改善骨质疏松相关指标[5]。而本研究并未发现VK1和VK3具有促进成骨细胞和抑制破骨细胞的作用,可能原因是选择的筛选浓度过低所致。MK4和MK7在1 μmol/L能促进成骨细胞增殖和矿化作用,二者并没有显著差异。但在抑制骨吸收作用方面,MK4相较于MK7在相同浓度,有更显著的抑制TRAP活性的作用。

      CTSK是破骨细胞发挥骨吸收作用的关键靶标酶,选择性地大量表达于破骨细胞,其生理作用底物正是在有机骨基质中含量达95%的I型胶原[11]。我们研究发现,在相同浓度,只有MK4能显著抑制其底物骨胶原降解和人工合成底物Z-FR-MCA的活性。

      日本早在1995年首次将MK4作为治疗骨质疏松的药物应用[15],2011年MK4录入我国《原发性骨质疏松症诊疗指南》[16]。因此,我们认为MK4是人体内源性营养物质,安全性高,适用于各年龄人群作为营养补充剂使用。MK7具有促进骨形成作用,在体内也可以分解成MK4发挥作用,适合作为营养食品补充剂。

参考文献 (16)

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