啤酒花（PJH-01），产地新疆，购自河北安国中药材市场，经海军军医大学药学院生药学教研室辛海量副教授鉴定，密封存放于干燥阴凉处。称取啤酒花药材粉末70 g，加入料液比为1∶15的75%乙醇，回流提取3次，减压浓缩干燥成浸膏，HPLC测定得浸膏中黄腐酚含量为0.55%^[5]。使用前配制成相应浓度的提取液。

其他试剂及购买厂家：黄腐酚（纯度≥98%，上海历鼎）；地塞米松（大连美仑）；阿仑膦酸钠（上海国药）；I型胶原C端肽（CTX-I）及骨钙素（BGP）Elisa试剂盒（南京建成）；碱性磷酸酶（ALP）及抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）试剂盒（南京建成）；胎牛血清（Gibco，美国）；α-MEM培养基等细胞培养试剂（天津灏洋）；骨形成蛋白2（BMP-2）及成骨特异性转录因子（Runx-2）抗体（Abcam，英国）；Micro-CT（eXplore Locus SP，GE，美国）。

3月龄ICR小鼠，体重（20 ± 2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物质量合格证号：2013001831722；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2017-0004]。小鼠饲养于海军军医大学药学院实验动物中心清洁级动物房，室温（24 ± 0.5）℃，每日12 h光照/12 h黑暗，自由饮食饮水，适应1周后开始动物实验。

取自新生24 h Wistar大鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。

将56只大鼠按体重以随机区组设计分为7组（n=8）：空白对照组（CON），DEX模型组（MOD, 2.5 mg/kg），阿仑膦酸钠阳性对照组（ALN, 1 mg/kg），啤酒花提取物低剂量组（HLE-L, 1 g/kg），啤酒花提取物高剂量组（HLE-H, 3 g/kg），黄腐酚低剂量组（XN-L, 30 mg/kg），黄腐酚高剂量组（XN-H, 90 mg/kg）。除空白组外，所有组别小鼠腹腔注射DEX注射液，空白对照组小鼠注射同体积的生理盐水，每周3次；与此同时，予相应药物灌胃，空白对照组和模型组小鼠灌胃相同体积生理盐水。每周灌胃给药6次，连续给药12周。每周称量体重，按体重0.1 ml/10 g调整给药体积。末次给药后，小鼠禁食、不禁水过夜，摘除眼球取血，静置离心取血清，储存于−80 ℃冰箱中用于生化指标检测，剥离小鼠后肢右侧股骨用于Mirco-CT测定。

取组织固定液中的小鼠右侧股骨，剔除其表面附着的结缔组织，用高分辨率Micro-CT对股骨远端进行扫描。计算骨密度（BMD）、骨表面积/骨体积（BS/BV）、相对骨体积（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N.）及骨小梁分离度（Tb.Sp.）。

按照试剂盒说明书步骤，对小鼠血清中ALP、TRAP及CTX-I水平进行检测。

采用二次消化法从新生大鼠颅盖骨分离得到原代成骨细胞^[7]，用含10%胎牛血清的α-MEM培养液进行培养，取3～4代成骨细胞进行增殖、分化以及Western blot分析。

取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为1×10⁴ 个/ml细胞悬液接种于96孔板。24 h后分别更换为含药培养液（DEX: 10 μmol/L；HLE: 100、20 μg/ml；XN: 5、1 μmol/L），除空白组外均给予DEX损伤。给药48 h后采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况。

取3～4代成骨细胞计算其数目，配制成细胞浓度为5×10⁴ 个/ml细胞悬液接种于24孔板。24 h后分别更换为含药培养液（给药浓度同上）。培养过程中每3 d更换1次含药培养液。第8天裂解细胞，收集细胞裂解液，于4 ℃、13 800×g 离心5 min。用对硝基苯磷酸二钠法测定细胞 ALP活性^[8]。

将3～4代的成骨细胞裂解，提取细胞总蛋白，根据BCA试剂盒进行蛋白定量。采用ELISA试剂盒对成骨细胞BGP含量进行检测，采用Westernblot技术^[9]对BMP-2及Runx-2水平进行检测。

实验结果以（$\bar x \pm s$）表示。采用SPSS 22.0软件进行数据分析，选用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行组间变量的比较分析。检验水准（α）为 0.05。

模型组小鼠股骨的骨组织形态与空白组相比，出现明显空洞，见图1；药物治疗后，HLE及XN显著改善DEX小鼠的骨组织形态及骨微结构，防止骨质空洞。

图  1  小鼠股骨Micro-CT扫描图

模型组小鼠BMD、BS/TV、BV/TV及Tb.N.水平较空白组显著降低，Tb.Sp.水平显著升高（图2）。药物治疗后，HLE及XN显著逆转了DEX小鼠BMD及骨小梁参数的异常，防治骨质疏松。

图  2  小鼠股骨骨密度（A）及骨小梁参数（B-E）（$n=8\text{，}\bar{x}\pm s$）

小鼠注射DEX后，其血清ALP水平显著降低，TRAP及CTX-I水平显著升高。药物治疗后，HLE及XN可显著提高小鼠血清ALP水平，并降低TRAP及CTX-I的高表达，调节骨代谢，且药物高剂量组治疗效果更佳（图3）。

图  3  小鼠血清生化指标（$n=8\text{，}\bar{x}\pm s$）

如图4A-B所示，DEX损伤成骨细胞后，其增殖能力及ALP活性显著降低。药物治疗后，HLE及XN可显著促进DEX损伤成骨细胞的增殖，提高ALP活性，促进成骨细胞的分化。

图  4  成骨细胞的增殖（A）、分化（B）水平及骨形成相关蛋白（C-E）的表达（$n=4\text{，}\bar{x}\pm s$）

在骨形成相关蛋白的表达方面，HLE及XN可显著促进DEX损伤成骨细胞中BGP及BMP-2的表达，XN还可显著促进成骨细胞Runx-2的表达（图4C-E），促进成骨细胞骨形成。

DEX作为临床上常用的一种合成糖皮质激素，在抗炎抗免疫反应方面均具有良好的疗效。与其他糖皮质激素类似，长期使用DEX会引起严重的不良反应，尤其是对骨骼的影响，可大大增加骨质疏松及生理性骨折的发病风险^[10]。本研究中，小鼠注射DEX后，其股骨的骨微结构显著破坏，骨质明显空洞，骨密度及骨小梁参数显著降低，且血清骨生化指标异常，提示小鼠处于典型的骨质疏松状态。药物治疗后，啤酒花提取物及黄腐酚均可显著改善GIOP小鼠的骨微结构破坏，增强骨密度，改善骨小梁参数，防治骨质疏松。ALP和TRAP分别为评价骨形成与骨吸收的常用指标，而CTX-I为成熟胶原降解的标志物，其活性水平与骨密度呈显著的负相关^[11]。本研究中，啤酒花提取物及黄腐酚可显著提高ALP含量，抑制TRAP及CTX-I的高表达，表明两者可通过调节骨代谢的平衡防治骨丢失。

在GIOP细胞层面的发病机制中，GC对成骨细胞的影响占主导地位^[12]。在成骨细胞活性检测中，MTT值及ALP活性分别代表成骨细胞的增殖及分化水平。其中，ALP合成于骨基质成熟阶段，利于骨基质矿化^[13]。本研究中，DEX损伤成骨细胞后，其MTT值及ALP活性均显著下降，表示糖皮质激素抑制了成骨细胞的增殖及分化。药物治疗后，啤酒花提取物及黄腐酚可显著提高损伤成骨细胞的MTT值及ALP活性，有效促进了细胞的增殖与分化，提高成骨细胞活性。BGP、BMP-2及Runx-2均为典型的骨形成相关蛋白，其中BGP是由非增殖期的成骨细胞特异合成并分泌的非胶原蛋白^[14]，BMP-2是参与成骨细胞分化阶段的主要蛋白^[15]，而Runx-2是早期成骨细胞分化的调节因子，三者在骨骼形态发生阶段均起着关键作用^[16]。本研究发现，啤酒花提取物及黄腐酚可显著促进DEX损伤成骨细胞中BGP、BMP-2及Runx-2的表达，进一步证实了其可通过促进成骨细胞的骨形成对抗GIOP。以上研究为深入探讨啤酒花及其活性成分黄腐酚抗骨质疏松的作用机制以及相关药物的研发奠定了基础。