下载:
-
嘧啶类化疗药物在肿瘤治疗中的地位越来越重要，其代表药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨更受到了广泛关注，体内二氢尿嘧啶脱氢酶(DPD)是此类药物代谢的限速酶之一[1]，前瞻性评价DPD的总体活性有利于提高药物疗效及减少患者的毒副反应，对临床具有重要意义。内源性物质尿嘧啶(U)是体内DPD的天然底物，在此酶的催化下生成二氢尿嘧啶(UH2)，并最终通过尿液排出体外。测定血浆中U和UH2的含量，并通过(UH2)/(U)比值计算，可从代谢物的角度评价DPD的活性[2]。临床上常用评价DPD酶活性的方法是测定患者的基因表型，DPD的编码基因DPYD序列中包含了多达7 600个多态位点，使得DPD酶的活性在人群中是高度可变的[3]。不同的突变位点及不同位点的组合给临床检测带来了极大的困难。到目前为止，也只有DPYD*2A的多态性被用于临床实践，用来筛选出5-氟尿嘧啶代谢严重不良的患者，避免严重的毒副反应[4]。单一应用基因的多态性来评价DPD酶的活性在临床上存在一定的困难，基因的多态性并不能直接同下游的酶的活性联系起来，两者并没有完全对等的关系。基因需通过转录、翻译和蛋白的修饰之后才能发挥作用。基因多态联合下游代谢物的含量测定更能准确的评价DPD酶的活性[5]。目前常应用液相色谱-串联质谱联用法对人血浆或干燥唾液中U和UH2浓度进行检测[6-11]，但所报道的方法均有一些复杂或难以重现。本研究成功的建立了一种灵敏、高效、准确、重现性好，且能同时测定人血浆中U和UH2浓度的UHPLC-MS/MS方法，为体内DPD总体活性提供更客观有效的评价途径。
-
1290-6460A超高效液相色谱-串联质谱仪，包含G4220A二元泵、G4226A自动进样器、G1316C柱温箱、MassHunter数据处理工作站（美国Agilent）；调速涡旋混合器（美国Labnet）；SK7200H超声仪（上海科导超声仪器有限公司）；BSA124S-CW分析天平（德国赛多利斯）；5810R型低温高速离心机、移液器（德国Eppendorf公司）。
-
尿嘧啶、二氢尿嘧啶和氯尿嘧啶（内标）对照品（纯度>99%,大连美仑生物有限公司）；乙酸铵（美国赛默飞世尔科技）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、异丙醇（色谱纯，德国默克公司）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；牛血清白蛋白（BSA）(上海博光生物科技有限公司)；生理盐水（长征医院药学部自制）。
-
色谱柱为Agilent poroshell 120 SB-Aq-柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），流动相为5 mmol/L乙酸铵水溶液(A)和乙腈(B)，流速为0.3 ml/min，梯度洗脱：0～0.3 min，100% A；0.3～1.0 min，100%～10% A；1.0～2.5 min，10% A；柱温为30 ℃，洗脱时间2.5 min，进样量5 μl。
-
采用ESI离子源，多重反应监测（MRM）进行一/二级质谱分析，用于定量分析的检测离子为：U[M+H]+ m/z 113.0→40.1，检测模式为正离子模式；UH2[M+H]+ m/z 115.0→55.1，检测模式为正离子模式；氯尿嘧啶（IS）[M-H]- m/z 145.0→42.1，检测模式为负离子模式。雾化温度为300 ℃，雾化气压力为40 psi，干燥气流速为10 L/min，鞘气温度300 ℃，鞘气流速12 L/min，解离电压为4 000 V。
-
选取8名血浆样品指标正常的成年人，于当日清晨8时空腹状态下静脉采血3 ml, EDTA-3K管抗凝，离心后分离上层血浆, 于−80 ℃冰箱冻存。
-
取100 μl样本，加10 μg/ml氯尿嘧啶（IS）10 μl，加乙酸乙酯3 ml，涡旋5 min，1710×g离心10 min，取上层有机相2.7 ml，45 ℃氮气挥干仪挥干，用10%甲醇溶液100 μl复溶，涡旋1 min，取上清液进样分析。
-
用含有3 %牛血清白蛋白作为空白基质代替血浆配置标准曲线样品。取100 μg/ml的尿嘧啶和二氢尿嘧啶各100 μl，加800 μl水，制成10 μg/ml标准混合液，置于−20 ℃备用。取10 μg/ml标准混合液适量，用3 %牛血清白蛋白稀释制成10、20、50、100、200、500、1000、1500 ng/ml系列浓度样品, 然后按照上述“1.6”项下样品的处理方法配制。
-
U和UH2的出峰时间以及峰型良好，代替血浆经过前处理后，对待测组分的测定没有干扰，内标对分析物的测定也没有干扰，且能很好分离，结果见图1。
图 1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶及内标质谱多反应监测色谱图
-
U和UH2的线性范围是10.0～1 500.0 ng/ml，以空白BAS中U和UH2的浓度为横坐标（X），U和UH2与内标化合物氯尿嘧啶的峰面积比为纵坐标（Y），进行最小二乘法加权（权重系数为1/χ2），U和UH2的线性回归方程分别是Y=0.27X+0.0022、Y=0.58X+0.0380，r均>0.990，表明线性关系良好。
-
取定量下限、低、中、高标准添加血浆样本按照前处理方法进行处理，每个浓度样品平行制备5份进行分析，连续3 d重复操作，根据当天的标准曲线计算当天实测样本浓度，计算样本在低、中和高浓度下的日内、日间精密度和准确度，结果显示，精密度和准确度的偏差均在15%左右。准确度相对偏差在20%范围内时，最低定量下限精密度偏差不大于20%，结果见表1。
表 1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的精密度 (n=5)
分析物 标示浓度 (ng/ml) 日内 日间 测定浓度 (ng/ml) 精密度(CV%) 准确性(RE%) 测定浓度 (ng/ml) 精密度(CV%) 准确性(RE%) 尿嘧啶 10 10.2±0.38 3.74 2.58 10.12±0.78 7.70 1.18 20 20.63±1.21 5.87 3.15 19.97±1.35 6.74 −0.16 500 529.73±4.64 0.88 5.95 484.32±35.72 7.37 −3.12 1000 1093.33±25.10 2.30 9.33 1098.25±25.16 2.29 9.82 二氢尿嘧啶 10 10.32±0.71 6.86 3.18 10.28±0.65 6.37 2.77 20 19.98±2.19 10.95 −0.12 19.86±1.85 9.31 −0.72 500 517.51±10.69 2.07 3.50 515.66±10.36 2.01 3.13 1000 1079.83±17.91 1.66 7.98 1080.11±24.50 2.27 8.01 -
取低、高2个浓度的样本进行基质效应和提取回收率考察，结果显示，U、UH2及内标氯尿嘧啶的基质效应和提取回收率良好，结果均较稳定，结果见表2。
表 2 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的基质效应和提取回收率
分析物 标识浓度(ng/ml) 基质效应 提取回收率 平均基质效应 CV(%) 平均回收率 CV(%) 尿嘧啶 1000 101.00 6.15 94.98 9.01 20 99.99 3.63 100.01 7.64 二氢尿嘧啶 1000 85.72 2.07 106.47 1.58 20 93.58 4.53 99.54 9.77 -
考察低、高2个浓度的血浆样品经历3次冷冻与解冻循环的稳定性、血浆样品在室温（25 ºC）放置6 h后经样品处理后稳定性和血浆样品经样品处理后室温放置24 h的稳定性，结果显示，3次冻融、6 h室温（25 ºC）条件下和24 h放置自动进样器中的稳定性均符合要求，结果见表3。
表 3 样品的稳定性(RE%)
分析物 冻融3次 室温放置6 h 置自动进样器24 h 低 高 低 高 低 高 尿嘧啶 100.71 98.34 93.49 106.60 108.20 107.99 二氢尿嘧啶 92.67 92.64 93.61 107.26 106.97 107.15 -
应用本研究所建立的方法，对8名健康成人的血浆样本测定分析，在样本实测过程中, 同时插入已知浓度的随行质控样本(QC样本), 随时监控样本测定的准确度。U和 UH2 浓度测定结果见图2。
图 2 实测8名健康成人内源性U和UH2浓度值
-
U和UH2是人体内常见的两种物质，且同核酸的代谢密切相关，由于U和UH2均为人体内源性物质，故不能采用人源的基质进行方法学的开发及验证，通过查阅资料，选择了不含U和UH2的3%牛血清蛋白作为基质进行方法学的开发[12]。也有文献报道采用去除U和UH2的人源血浆基质进行方法学实验[9]，但基质的来源较珍贵，不适合方法的普及，所以选用3%牛血清蛋白作为替代基质。
-
U因其特殊的化学性质，在大部分的色谱柱上均没有保留。U和UH2的LogP值分别为−0.707和−0.840，有较强的亲水性，决定了其不保留的性质。在定量方法的开发过程中，先后采用了Agilent Zorbax SB-C18色谱柱，Agilent Zorbax Eclipse-C18色谱柱，Waters Atlantis T3色谱柱，Waters Xselect色谱柱，Waters Xbridge等色谱柱来进行条件摸索，但上述色谱柱对U和UH2均没有保留。最后，采用Agilent Zorbax SB-Aq对U和UH2进行定量分析，该色谱柱对强极性的化合物有较好的保留效果，同时，兼容100%的起始流动相也对保留产生了良好的结果。
-
本研究还分别考察了几种常见的处理方法，包括甲醇和乙腈的蛋白沉淀、Waters Oasis HLB萃取板的固相萃取以及乙酸乙酯，甲基叔丁基醚，二氯甲烷/三氯甲烷，环己烷进行的液液萃取，结果发现乙酸乙酯对U和UH2的萃取效果较好，同时，还分别考察了5%、10%、20%、30%、40%、50%的异丙醇、乙酸乙酯溶液对U和UH2的萃取效果，结果发现，单纯的乙酸乙酯对待测化合物具有较好的提取效率。提取回收率均高于90%，且RSD<10%。另外对3%牛血清蛋白的基质效应进行了考察，结果发现平均基质效应在85%～101%之间，RSD<7%，说明该前处理方法对于基质的清除较为彻底，测定结果稳定，没有明显的基质干扰。
本研究虽重在方法开发，收集的样本数量较少，但从测定的U和UH2浓度分布来看DPD对内源性U的代谢存在个体差异，建议临床应用5-氟尿嘧啶及其卡培他滨筛查DPD总体活性[12-13]，后续可进一步扩大样本数量进行深入研究。
-
本实验建立了一种快速，稳定，高灵敏度的UHPLC-MS/MS方法，可用于测定人体内源性物质U和UH2的含量，从代谢物的角度评价DPD酶的活性，从而协助临床医生制定化疗药物5-氟尿嘧啶及其口服前药卡培他滨合理的用量，以较低的毒副反应获得最大的临床疗效。
UHPLC-MS/MS determination of uracil and dihydrouracil in human plasma
-
摘要:
目的 建立同时测定人血浆中尿嘧啶(U)和二氢尿嘧啶(UH2)含量的超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）方法。 方法 在Agilent 6460A串联质谱仪上采用正离子检测模式，以氯尿嘧啶为内标，3%牛血清蛋白为代血浆基质，样本经乙酸乙酯液液萃取后在Agilent poroshell 120 SB-Aq (2.1 mm×100 mm，2.7 μm)色谱柱上采用梯度洗脱进行色谱分离。流动相为5 mmol/L醋酸铵水溶液和乙腈溶液；流速0.3 ml/min；柱温为30 ℃；进样量为5 μl。 结果 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的线性范围为10.0~1500.0 ng/ml，线性关系良好，其相关系数r>0.990，日内与日间精密度偏差均<15%。 结论 该方法操作简单、选择性好，可用于测定人血浆中尿嘧啶和二氢尿嘧啶的含量。 -
关键词:
- 超高效液相串联质谱法 /
- 尿嘧啶 /
- 二氢尿嘧啶 /
- 含量测定
Abstract:Objective To establish an UHPLC-MS/MS method for the determination of uracil (U) and dihydrouracil (UH2) in human plasma. Methods A positive ion detection mode was adopted on the Agilent 6460A mass spectrometer. Chlorouracil was used as the internal standard. 3% bovine serum albumin was used as surrogate plasma matrix. The pretreatment of plasma sample was completed based on liquid-liquid extraction with ethyl acetate. The chromatographic separation was achieved on an Agilent Poroshell 120 SB-Aq (2.1 mm×100 mm, 2.7 μm) column with gradient elution. The mobile phase was 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution and acetonitrile solution. The flow rate was 0.3 ml/min. The column temperature was 30°C. The injection volume was 5 μl. Results The linear range of uracil and dihydrouracil was 10.0-1500.0 ng/ml. Both of uracil and dihydrouracil had good linear relationship with correlation coefficient (r)>0.990. Both of inter- and intra-day precision was <15%. Conclusion The established method is simple, selective, and suitable for the determination of U and UH2 in human plasma. -
Key words:
- UHPLC-MS/MS /
- uracil /
- dihydrouracil /
- content determination
-
表 1 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的精密度 (n=5)
分析物 标示浓度 (ng/ml) 日内 日间 测定浓度 (ng/ml) 精密度(CV%) 准确性(RE%) 测定浓度 (ng/ml) 精密度(CV%) 准确性(RE%) 尿嘧啶 10 10.2±0.38 3.74 2.58 10.12±0.78 7.70 1.18 20 20.63±1.21 5.87 3.15 19.97±1.35 6.74 −0.16 500 529.73±4.64 0.88 5.95 484.32±35.72 7.37 −3.12 1000 1093.33±25.10 2.30 9.33 1098.25±25.16 2.29 9.82 二氢尿嘧啶 10 10.32±0.71 6.86 3.18 10.28±0.65 6.37 2.77 20 19.98±2.19 10.95 −0.12 19.86±1.85 9.31 −0.72 500 517.51±10.69 2.07 3.50 515.66±10.36 2.01 3.13 1000 1079.83±17.91 1.66 7.98 1080.11±24.50 2.27 8.01 
下载: 导出CSV
表 2 尿嘧啶和二氢尿嘧啶的基质效应和提取回收率
分析物 标识浓度(ng/ml) 基质效应 提取回收率 平均基质效应 CV(%) 平均回收率 CV(%) 尿嘧啶 1000 101.00 6.15 94.98 9.01 20 99.99 3.63 100.01 7.64 二氢尿嘧啶 1000 85.72 2.07 106.47 1.58 20 93.58 4.53 99.54 9.77
下载: 导出CSV
表 3 样品的稳定性(RE%)
分析物 冻融3次 室温放置6 h 置自动进样器24 h 低 高 低 高 低 高 尿嘧啶 100.71 98.34 93.49 106.60 108.20 107.99 二氢尿嘧啶 92.67 92.64 93.61 107.26 106.97 107.15
下载: 导出CSV
-
[1] SHARMA V, GUPTA S K, VERMA M. Dihydropyrimidine dehydrogenase in the metabolism of the anticancer drugs[J]. Cancer Chemother Pharmacol,2019,84(6):1157-1166. doi: 10.1007/s00280-019-03936-w [2] KOBUCHI S, AKUTAGAWA M, ITO Y, et al. Association between the pharmacokinetics of capecitabine and the plasma dihydrouracil to uracil ratio in rat: a surrogate biomarker for dihydropyrimidine dehydrogenase activity[J]. Biopharm Drug Dispos,2019,40(1):44-48. doi: 10.1002/bdd.2168 [3] AMSTUTZ U, FROEHLICH T K, LARGIADÈR C R. Dihydropyrimidine dehydrogenase gene as a major predictor of severe 5-fluorouracil toxicity[J]. Pharmacogenomics,2011,12(9):1321-1336. doi: 10.2217/pgs.11.72 [4] DEENEN M J, TOL J, BURYLO A M, et al. Relationship between single nucleotide polymorphisms and haplotypes in DPYD and toxicity and efficacy of capecitabine in advanced colorectal cancer[J]. Clin Cancer Res,2011,17(10):3455-3468. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-10-2209 [5] SISTONEN J, BÜCHEL B, FROEHLICH T K, et al. Predicting 5-fluorouracil toxicity: DPD genotype and 5, 6-dihydrouracil: uracil ratio[J]. Pharmacogenomics,2014,15(13):1653-1666. doi: 10.2217/pgs.14.126 [6] ROBIN T, SAINT-MARCOUX F, TOINON D, et al. Automatic quantification of uracil and dihydrouracil in plasma[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2020,1142:122038. doi: 10.1016/j.jchromb.2020.122038 [7] ANTUNES M V, RAYMUNDO S, CEZIMBRA DA SILVA A C, et al. Determination of endogenous concentrations of uracil and dihydrouracil in dried saliva spots by LC-MS/MS: method development, validation, and clinical application[J]. Ther Drug Monit,2019,41(3):383-390. doi: 10.1097/FTD.0000000000000615 [8] CHAVANI O, JENSEN B P, STROTHER R M, et al. Development, validation and application of a novel liquid chromatography tandem mass spectrometry assay measuring uracil, 5, 6-dihydrouracil, 5-fluorouracil, 5, 6-dihydro-5-fluorouracil, α-fluoro-β-ureidopropionic acid and α-fluoro-β-alanine in human plasma[J]. J Pharm Biomed Anal,2017,142:125-135. doi: 10.1016/j.jpba.2017.04.055 [9] JACOBS B A, ROSING H, DE VRIES N, et al. Development and validation of a rapid and sensitive UPLC-MS/MS method for determination of uracil and dihydrouracil in human plasma[J]. J Pharm Biomed Anal,2016,126:75-82. doi: 10.1016/j.jpba.2016.04.039 [10] ZHENG N Y, ZENG J N, JI Q C, et al. Bioanalysis of dried saliva spot (DSS) samples using detergent-assisted sample extraction with UHPLC-MS/MS detection[J]. Anal Chim Acta,2016,934:170-179. doi: 10.1016/j.aca.2016.05.057 [11] 肖力, 任斌, 陈小陆, 等. 高效液相色谱法测定人血浆中内源性尿嘧啶和二氢尿嘧啶含量[J]. 中国医院药学杂志, 2008, 28(2):112-114. doi: 10.3321/j.issn:1001-5213.2008.02.010 [12] CASNEUF V, BORBATH I, VAN DEN EYNDE M, et al. Joint Belgian recommendation on screening for DPD-deficiency in patients treated with 5-FU, capecitabine (and tegafur)[J]. Acta Clin Belg,2021:1-7. [13] DOLAT M, MACAIRE P, GOIRAND F, et al. Association of 5-FU therapeutic drug monitoring to DPD phenotype assessment may reduce 5-FU under-exposure[J]. Pharmaceuticals (Basel),2020,13(11):E416. doi: 10.3390/ph13110416 -
点击查看大图
图(2) / 表(3)
计量
- 文章访问数: 4310
- HTML全文浏览量: 1845
- PDF下载量: 59
- 被引次数: 0
