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藤茶即显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata (Hand.-Mazz.) W. T. Wang，是葡萄科蛇葡萄属的一种野生木质落叶藤本植物，俗称藤茶、白茶等。其产地主要分布于湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地[1]。我国壮族和瑶族百姓，以及产地居民将其幼嫩茎叶经揉制、干燥制成保健茶，用于感冒、发热、咽喉肿痛、疮疖等症，至今已有数百年的历史[2-3]。二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY）为藤茶中主要的二氢黄酮醇类化合物，既往研究证实二氢杨梅素具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、解酒保肝、抗病原微生物及调血脂等多方面的药理作用[4-5]。牛蒡子（Fructus arctii）又名大力子、鼠粘子、恶实等，为菊科二年生草本植物牛蒡（Arctium lappa L.）的干燥成熟果实。具有疏散风热、宣肺祛痰、利咽透疹和解毒消肿的功效[6-7]。笔者通过研究藤茶不同产地、部位、加工工艺的二氢杨梅素含量，进一步完善藤茶的质量标准。评价优选藤茶与牛蒡子配伍的清咽功效，为进一步开发清咽功能保健食品提供实验依据。
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藤茶植物原料于2018年6～8月采自湖南、湖北、福建、贵州不同乡镇，所有采集的原植物均经药学高级工程师雷雨博士鉴定为葡萄科蛇葡萄属植物显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的茎叶部位。不同植株采收间隔不小于300 m，单株不同采收方式及部位分为人工采收（芽尖、嫩叶、粗老叶、茶梗）、机器采收；藤茶（批号：20180620，贵州江口梵净山云峰野生植物开发有限公司）；牛蒡子（批号：171101，安国市深豪药业有限公司）；藤茶牛蒡子浓缩液：取采收地为贵州江口县的芽尖部位优选藤茶及牛蒡子的复配样品105.0 g（藤茶63.0 g，牛蒡子42.0 g），常压、温度80 ℃，提取2次，每次各用1 050 ml无菌水浸泡30 min，将提取液合并浓缩至70 ml，以下简称“复配样品”；二氢杨梅素对照品（99.57 %，MMST-18031501，中国科学院成都生物研究所成都曼思特生物科技有限公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Chemical）；纯水（MLMP-1-20T，四川优普超纯科技有限公司优普系列超纯水器）；磷酸（90 %，BCBD9465，Fluka）；乙醚（国药集团化学试剂北京有限公司）；碘伏（山东利尔康牌医疗科技股份有限公司）。
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安捷伦高效液相色谱仪（Agilent 1290，DAD检测器）；超声波仪器（上海睿祺电子设备有限公司）；QHAMS型精密十万分之一天平；FW100型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；XR-YLS-25A型电动耳肿打孔器（上海欣软信息科技有限公司）；电热鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司）；微量加样器（Hamilton）。
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SPF级SD大鼠，雄性，体重（185 ± 15）g，10周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司 [许可证号：SCXK（京）2019-0008]。SPF级BALB/c小鼠，雄性，体重（20 ± 2）g，6周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司 [许可证号：SCXK（京）2019-0008]。实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室 [许可证号：SYXK（京）2017-0038]。分笼饲养，控制室温（25 ± 2）℃，自由摄食、饮水。维持饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司 [许可证号：SCXK（京）2019-0008] 生产。
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色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 µm）；甲醇−0.05 %磷酸水溶液（30∶70）为流动相；流动相流速：1 ml/min；检测波长291 nm；柱温25 ℃；进样量10 µl；运行时间20 min；理论塔板数按二氢杨梅素计算不低于3 000。二氢杨梅素保留时间为8.37 min，如图1所示获得样品色谱图。
图 1 二氢杨梅素对照品（A）及贵州江口梵净山藤茶样品（B）的HPLC图
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精密称定二氢杨梅素对照品12.72 mg，置于10 ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45 µm滤膜过滤，制得1.272 mg/ml储备液。
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样品拆袋，混合均匀，粉碎。精密称定样品约0.05 g于100 ml容量瓶中，加70 %乙醇，超声提取30 min。取出后冷却至室温，加入70 %乙醇定容至刻度，摇匀，静置。经0.45 µm微孔滤膜过滤后，供液相色谱分析用。
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采用逐级稀释法，量取适量二氢杨梅素储备液，至于10 ml容量瓶中，加70 %乙醇定容，制得浓度分别为0.019 9、0.039 8、0.079 5、0.159、0.318 mg/ml。以进样浓度（mg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），固定进样量为10 µl，绘制标准曲线，回归方程为：Y = 165 202 X + 482.04（r = 0.999），表明二氢杨梅素对照品在0.019 9～0.318 mg/ml范围内线性关系良好。
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精密吸取二氢杨梅素系列对照品溶液0.079 5 mg/ml，按规定色谱条件重复进样6次，每次进样10 µl，记录二氢杨梅素的峰面积值，重复6次进样峰面积的RSD为0.60 %，表明该方法的仪器精密度良好。
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称取同一样品6份，按照“2.2.2”项制备供试品溶液进行重复性试验，二氢杨梅素平均含量为14.23%，RSD为1.24 %，表明该方法重现性良好。
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取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进行测定，二氢杨梅素峰面积RSD为1.41 %，表明供试品溶液在12 h内基本稳定，该方法稳定性良好。
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按9份样品中二氢杨梅素含量的1.2倍，1.0倍，0.8倍，分别准确加入二氢杨梅素对照品。按照“2.2.2”供试品制备方法制备供试液，HPLC进样检测，计算加样回收率。该样品二氢杨梅素的加样回收率在95.04 %～100.4 %之间，平均回收率为97.53 %，RSD为2.00 %，表明本方法的准确度良好，具体结果见表1。
表 1 藤茶中二氢杨梅素加样回收率的试样结果（
$n=9 $ ）样品
（m/mg）原有量
（m/mg）加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）50.48 6.977 5.010 11.77 95.67 97.53 2.000 50.00 6.902 5.560 12.39 98.71 50.97 6.980 5.460 12.46 100.4 49.64 6.816 6.670 13.38 98.41 49.81 6.935 6.830 13.61 97.74 50.09 6.918 6.810 13.39 95.04 49.59 6.834 8.120 14.94 99.83 50.61 6.854 8.250 14.78 96.07 50.05 6.961 8.300 14.92 95.89 综上，方法学考察结果表明本研究建立的提取和分析方法能够满足藤茶中二氢杨梅素定量分析的要求。
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计量资料以（
$\bar{x}\pm s$ ）表示，采用SPSS 16.0软件统计分析。统计学意义水平设定为P < 0.05表示显著性差异，P < 0.01表示极显著性差异，均证明该数据具有统计学意义。 -
供试品溶液进样10 µl，通过回归方程计算不同采收点藤茶芽尖部位的二氢杨梅素含量。结果17批样品中二氢杨梅素含量介于18.60 %～37.69 %之间，含量较高的采样点在湖南省八大公山、贵州省江口县、贵州省罗场乡，较低的采样点多为湖北及福建一带。具体见表2。
表 2 不同采收点芽尖部位藤茶中二氢杨梅素的含量（
$\bar{x}\pm s$ ，$ n=6 $ ）采样点 含量（%） 不同地区含量（%） 湖北恩施 20.80±1.2 24.33±8.1 湖北来凤1 18.60±1.1 湖北来凤2 33.60±1.0 福建将乐1 30.30±0.6 29.47±1.2 福建将乐2 28.63±0.9 湖南八大公 37.69±0.5 31.66±5.0 湖南张家界1 33.67±0.3 湖南张家界2 29.83±0.9 湖南张家界3 30.39±1.2 湖南张家界4 30.43±0.6 湖南武陵山1 22.83±0.5 湖南武陵山2 36.81±0.8 贵州江口1 35.50±0.6 32.26±2.9 贵州江口2 31.40±0.8 贵州江口3 30.60±0.7 贵州罗场1 35.11±1.0 贵州罗场2 28.69±0.5 相对于湖南省张家界各采收点差异范围（29.83 %～33.67 %），贵州省江口县（30.60 %～35.50 %）、贵州省罗场乡（28.69 %～35.11 %）、湖北省来凤县（18.60 %～33.60 %）、湖南省武陵山地区（22.83 %～36.81 %），藤茶芽尖部位中DMY含量出现较大浮动。贵州省总体采收藤茶芽尖含量水平最高，其次为湖南省。
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自然晒干法指将新鲜采集的样品摊开，于阳光下晒至全干；自然阴干法指新鲜采集的样品摊开，于阴凉干燥通风处晾至全干。选择总体含量较高且含量趋于平稳的贵州省江口县2号采收地样品，利用人工采收手法收集同一植株的芽尖、嫩叶、粗老叶及茶梗样品，同时利用机器采收同一植株样本。而后利用不同干燥方式进行加工处理，含测结果如表3所示。
表 3 同一采收地点不同部位及加工方式二氢杨梅素含量（
$\bar{x}\pm s$ ，$ n=6 $ ）采收部位 自然晒干含量（%） 自然阴干含量（%） 芽尖 35.85±0.4 32.22±0.8 嫩叶 26.22±0.5 28.32±0.6 粗老叶 15.84±0.5 16.02±0.5 茶梗 15.32±0.2 15.47±0.2 机器采收 20.40±1.0 20.77±0.9 注：1.采收地点为贵州省江口县2号点。2.芽尖部位用自然晒干加工方式其二氢杨梅素含量最高，平均含量为35.85 %。 -
受试动物精神状态、行为活动、摄食摄水等均未见明显异常。给予复配样品前后，各剂量组大鼠、小鼠的体重与空白对照组比较均无显著性差异。
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大鼠低、中、高剂量组分别给予0.38、0.75、2.25 g/kg复配样品原药材折算浓缩液灌胃，同时设空白对照组0 g/kg。经口给予大鼠复配样品36 d，实验结束前8 d，用脱毛器脱去大鼠两侧腹股沟处的毛，乙醚麻醉大鼠，碘伏消毒，在无菌条件下切开大鼠两侧腹股沟皮肤，植入经高压灭菌并烘干、称重的棉球，缝合切口，继续给予复配样品。实验结束当天，给予复配样品1 h后，断颈处死大鼠，在原缝合处剪开皮肤，剥离并取出棉球肉芽组织，置于已称重的洁净平皿中，恒温干燥箱60 ℃开盖干燥1 h后称重，计算肉芽肿净重量。
由表4可见，经口给予大鼠复配样品36 d后，与空白对照组比较，中剂量组（0.75 g/kg）和高剂量组（2.25 g/kg）大鼠肉芽肿净量降低，其中，中剂量组具有显著性差异，高剂量组具有极显著性差异，说明该剂量下的复配样品可显著改善大鼠棉球植入致炎率。
表 4 大鼠棉球植入实验肉芽肿净量（
$\bar{x}\pm s$ ，$n=12 $ ）组别 给药剂量（g/kg） 肉芽肿（m/mg） 空白对照组 0.00 428.2±65.4 低剂量组 0.38 392.3±45.3 中剂量组 0.75 372.6±58.9* 高剂量组 2.25 347.3±20.9** *P < 0.05，**P < 0.01，与空白对照组比较。 -
小鼠低、中、高剂量组分别给予0.75、1.50、4.50 g/kg复配样品原药材折算浓缩液灌胃，同时设空白对照组0 g/kg。经口给予大鼠复配样品36 d，实验结束当天，吸取二甲苯20 µl，滴加在小鼠右耳外侧面耳郭的中央，让其自由扩散，30 min后，将小鼠脱颈椎处死，剪下双耳，用9 mm直径打孔器在两耳相同部位打下耳片并称重，以两耳重量之差为耳郭肿胀值，计算耳郭肿胀率。
由表5可见，经口给予小鼠复配样品36 d后，各剂量组小鼠耳郭肿胀率与空白对照组比较均有降低，且差异具有统计学意义。
表 5 小鼠耳肿胀实验耳郭肿胀率（
$\bar{x}\pm s$ ，$n=15 $ ）组别 给药剂量（g/kg） 耳郭肿胀率（%） 空白对照组 0.00 74.8±24.3 低剂量组 0.75 64.2±11.9 中剂量组 1.50 59.8±13.8* 高剂量组 4.50 53.7±7.8** *P < 0.05，**P < 0.01，与空白对照组比较。 -
本研究考察了湖北、湖南、贵州、福建等不同产地藤茶有效成分二氢杨梅素的含量，采样点所在地为显齿蛇葡萄主产区[8-9]，其中种植于贵州省江口县的藤茶无论在不同产地功效成分含量还是同一产地不同植株含量稳定性上都相对较好。藤茶以芽尖嫩叶多为佳，粗老叶、茶梗较多会影响藤茶整体品质和功效。该研究数据可作为企业收购原料参考指标，用于判定藤茶产品中二氢杨梅素的含量情况，为生产及研发提供依据。
经口给予本配伍样品36 d后，高剂量组大鼠肉芽肿净量及小鼠耳郭肿胀率均显著低于空白对照组。该复配样品对大、小鼠体重增长均无不良影响。据结果判定大鼠棉球植入结果及小鼠耳肿胀治疗效果均呈阳性，可认定该配伍样品具有清咽功能。综上所述，该藤茶及牛蒡子配伍样品在动物致炎模型中发挥了消炎作用。
吸烟、饮酒等不良习惯加大群众患急慢性咽炎的概率，具有清咽功能保健食品的开发需求迫在眉睫[10]，本着中医药主张未病先治的理论，笔者将继续对本配伍药效及安全性进行深入研究。
Therapeutic effects study on the contents of dihydromyricetin in ampelopsis grossedentata from different places and their compatibility with fructus arctiine
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摘要:
目的 探究不同产地、部位及加工工艺藤茶中二氢杨梅素含量的差异，及优选藤茶与牛蒡子配伍药效学研究。 方法 二氢杨梅素高效液相方法学验证采用Agilent ZORBAX SB-C18柱，流动相为甲醇−0.05 % 磷酸（30∶70），流速为1 ml/min，检测波长为291 nm，柱温25 ℃。配伍药效验证方法采用大鼠棉球植入致炎及小鼠耳肿胀致炎模型，对大鼠棉球植入实验肉芽肿净量及小鼠耳肿胀率进行观察。 结果 方法学验证二氢杨梅素在0.019 9～0.318 mg/ml范围内线性关系良好（r=0.999），回收率在95.04 %～100.4 %之间，样品在24 h内稳定，该方法重复性较好。配伍药效学验证高剂量优选藤茶与牛蒡子配伍可致大鼠肉芽肿净量及小鼠耳肿胀率均显著低于空白对照组。 结论 方法简便准确，二氢杨梅素在不同产地、部位及加工工艺中含量差异较大，其中以贵州省江口县自然晒干的芽尖部位藤茶含量最高。藤茶与牛蒡子配伍可显著改善咽部症状，减轻致炎程度，共同协同达到清咽效果。 Abstract:Objective To study the content differences of Dihydromyricetin in Ampelopsis grossedentata from different origins, parts and processing techniques, and improve the therapeutic effects by optimizing the compatibility of Ampelopsis grossedentata with Fructus arctiine. Methods The HPLC separation of Dihydromyricetin was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column with methanol, 0.05 % phosphoric acid (30∶70) as the mobile phase. The flow rate was 1 ml/min, the detection wavelength was 291 nm, and the column temperature was 25 °C. Compatibility efficacy verification was performed with the inflammation model caused by cotton ball implantation in rats and ear swelling in mice. The net granulomatosis in the rats with cotton ball implantation and the swelling rate of mouse ears were recorded. Results Dihydromyricetin had a good liner recovery between 0.019 9-0.318 mg/ml (r=0.999). The extracted recovery was in the range of 95.04 %-100.4 %. The sample was stable within 24 h. This method had good repeatability. The combination of optimized high-dose Ampelopsis grossedentata with Fructus arctiine resulted in significantly lower net granuloma in rats and ear swelling rate in mice compared to the blank control group. Conclusion This method is simple and accurate. The content of dihydromyricetin varies greatly with different origins, parts, and processing techniques. Among them, the natural sun-dried vine tea in Jiangkou County, Guizhou Province has the highest content. The combination use of Ampelopsis grossedentata and Fructus Arctiine can significantly alleviate the pharyngeal symptoms, reduce the degree of inflammation, and achieve the therapeutic effect of clearing pharynx. -
Key words:
- throat clearing /
- Ampelopsis grossedentata /
- Fructus arctiine /
- Dihydromyricetin /
- HPLC
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随着经济的发展和人民生活水平的提高，糖尿病的患病率仍在逐年上升，血管并发症是导致患者残疾和死亡的主要原因，并给社会和经济的发展带来了沉重负担。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)在各种因素刺激下，从骨髓动员到外周血，参与损伤内皮的修复，在血管新生中具有重要作用[1-3]。但是高血糖会导致EPCs数量减少及功能受损[4-5]。研究表明，雌激素降低是心血管疾病发病的危险因素。因此，本实验通过研究雌激素对糖尿病大鼠EPCs功能的改善作用并探讨可能的作用机制，为探讨糖尿病血管并发症提供理论依据。
1. 材料
1.1 实验动物
SPF 级 Wistar大鼠，雄性，体重（180±10）g（上海斯莱克实验动物有限公司）。实验期间，保持动物房室温在22 ℃左右，相对湿度70%左右，早8点至晚8点自动照明。动物自由进食，自由饮水，所有实验动物均符合实验动物伦理学要求。
1.2 药物与主要试剂
雌激素（Abcam公司）；链脲佐菌素（Sigma aldrich公司）；FITC标记的荆豆凝集素I(FITC-UAE-I)（美国Sigma公司）；Dil 标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-ac-LDL)（Molecular Probe公司）；甲醛溶液（国药集团化学试剂有限公司）；基质胶（matrigel）（Thermo Fisher公司）；EGM-2 培养基（LON-ZA 公司）；CCK-8试剂盒（日本Dojindo公司）；NO检测试剂盒（美国Abcam公司）。
2. 方法
2.1 动物模型的制备
Wistar雄性大鼠，10~12周，适应性地喂养1周后，连续7 d空腹腹腔注射新鲜配制的链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）55 mg/（kg·d），对照组大鼠腹腔注射等体积枸橼酸钠缓冲液。7 d后测空腹血糖(禁食12 h)，将血糖值为13.5～25 mmol/L的大鼠作为糖尿病大鼠进行实验。注射STZ后，每周称体重，观察体重变化。大鼠给药、饲养过程中勤换垫料，勤补水。
2.2 大鼠骨髓来源EPCs的分离培养
大鼠麻醉后处死，将大鼠整体置于75%乙醇浸泡10 min。取出大鼠，使用吸水纸吸干动物身上水分后转移至超净工作台，剥离胫骨，使用无菌剪刀减去骨头两端，使用1ml PBS通过注射器冲洗骨髓并将冲洗液转移至15 ml无菌离心管，冲洗过程重复操作3次。用密度梯度离心法获取单核细胞，将单核细胞重悬于培养基EGM-2并调整细胞浓度至1×106个/ml，接种于预先包被好纤维连接蛋白的细胞培养皿，置于细胞培养箱37 ℃和5%CO2条件下培养。培养3 d后洗去未贴壁细胞，以后每3 d换培养液培养至7 d。PBS洗去未贴壁细胞，贴壁细胞供实验用。
2.3 大鼠骨髓来源EPCs的鉴定
培养7 d的EPCs用0.25%胰蛋白酶消化后收集于15 ml离心管中，将细胞用PBS 1000r/min离心5 min，清洗3次。用PBS 100 μl重悬细胞，每管加入CD34和CD133抗体各2 μl，4 ℃避光孵育30 min后用PBS清洗离心，将细胞重悬于300 μl PBS中避光保存待上机检测；同时将消化的细胞采用DiI-Ac-LDL 和FITC-UAE-I双染，倒置荧光显微镜观察染色结果，双染色阳性细胞为正在分化的EPCs。
2.4 实验分组
实验分3组：①对照组；②糖尿病组：M199培养基；③雌激素组：含雌激素10 nmol/L的M199培养基。在37 ℃，5% CO2培养箱中孵育24 h 后进行实验。
2.5 大鼠骨髓来源EPCs功能测定[6-7]
2.5.1 细胞迁移实验
3组EPCs用0.25%胰酶消化，将细胞重悬于EBM-2 培养基中，调整细胞密度为5×105个/ml，并取100 μl接种于Transwell 上室，在下室中加入600 μl含50 ng/ml 血管内皮生长因子的EGM-2 培养基。37 ℃、5% CO2孵育24 h 后，取出上室，用棉球轻轻擦拭上室底部膜内上表面的细胞，下室上表面用甲醛室温固定20 min，于37 ℃用0.1%结晶紫染色30 min，用PBS多次冲洗晾干后在160倍光学显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野计算迁移细胞数并计算平均值。
2.5.2 EPCs小管形成实验
在冰上将48 孔板预冷，然后加入150 μl的基质胶Matrigel，放置于37 ℃孵育30 min。3组EPCs用0.25%胰酶消化，将5×104个细胞接种于Matrigel上，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育24 h 后，于160倍光学显微镜下观察并拍照，随机选取5个视野计算形成小管的数目并计算平均值。
2.6 骨髓来源EPCs中NO水平的测定
3组EPCs用0.25%胰酶消化，经PBS清洗2次，制成细胞悬液，采用NO检测试剂盒测定EPCs中NO的水平。按照说明书的操作方法，完成后置于酶标仪在540 nm波长处测定吸光度（A）。
2.7 EPCs增殖能力的测定
3组EPCs用0.25%胰酶消化，将100 μl细胞悬液接种于96孔培养板中并置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。每孔加入CCK-8溶液10 μl培养4 h，置于酶标仪于450 nm处测A值。
2.8 Western blotting测定EPCs中MnSOD水平
收集3组EPCs并提取蛋白，应用BCA法进行蛋白质定量。蛋白样本经煮沸变性、SDS-PAGE电泳后加入兔抗人锰超氧化物歧化酶（MnSOD）和肌动蛋白（β-actin）多克隆抗体(1∶1500稀释)，蛋白质湿法转移至硝基纤维素膜，羊抗兔二抗(1∶2000稀释)室温孵育2 h，用ECL化学发光法显色，Image J凝胶成像分析系统扫描成像，测定目标条带的A值，以β-actin为内参比较同一条带与β-actin的灰度值进行分析。
2.9 ELISA检测EPCs上清液中TSP-1蛋白水平
收集3组EPCs上清液，按照说明书步骤进行操作。取各组细胞上清液各100 μl加入酶标板中37 ℃孵育90 min，然后加入100 μl生物素标记抗体工作液37 ℃孵育60 min。洗涤3次，加入100 μl酶结合物工作液在37 ℃孵育30 min后，洗涤5次。加入90 μl底物溶液37 ℃孵育15 min，最后加入终止液50 μl后，立即在450 nm波长处测量A值。
2.10 统计学处理
实验数据以（
$ \overline{\text{x}}\text{±}\text{s} $ ）表示，采用GraghPad Prism软件进行统计处理，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验差异的显著性。以P<0.05为差异有统计学意义。3. 实验结果
3.1 各组大鼠体重和血糖的变化
正常组大鼠，精神状态良好，动作自如，反应灵敏，毛发平伏有光泽。而糖尿病大鼠体重变轻，精神萎靡，反应迟钝，毛杂乱无光泽，动作迟缓，弓背捲体，尿量显著增加。在建模4周后，糖尿病模型组空腹血糖值（23.33±3.61）mmol/L明显高于对照组（16.91±2.30）mmol/L，组间差异有统计学意义(P<0.01) (图1A) 。对照组动物体重随时间增加而增加，模型组在前3周随时间缓慢增加，但最后1周出现体重下降趋势。在第3、4周，两组动物体重有显著差异(P<0.01) (图1B) 。
图 1 STZ诱导后Wistar大鼠血糖及体重变化A.STZ造模4周后两组大鼠空腹血糖比较；B.STZ造模4周两组大鼠体重随时间变化曲线(n=12)**P<0.01，与对照组比较。3.2 大鼠骨髓来源EPCs的分离培养和鉴定
以EGM-2培养基定向诱导培养5 d后，镜下观察可见贴壁细胞形态由圆形逐渐向梭形转化（图2A）。流式细胞仪检测结果显示，CD34与CD133双阳性细胞占比不小于总细胞数的85.63%（图2B）。采用Dil-Ac-LDL和TITC-UEA-1双染细胞，显示红绿荧光双阳性细胞占视野中细胞的绝大多数（图2C）。上述结果表明，我们成功地制备了大鼠骨髓来源EPCs细胞，且细胞具有较高纯度。
图 2 大鼠骨髓来源的EPCs分离培养和鉴定A.细胞形态学; B.流式细胞仪鉴定：用CD34和CD133两种抗体标记，双标阳性的细胞为EPCs; C.荧光染色鉴定：Dil-Ac-LDL与TITC-UEA-1双染色阳性的细胞为EPCs。3.3 雌激素孵育改善糖尿病大鼠EPCs的增殖和功能
与对照组比较，糖尿病大鼠EPCs的对数期增殖活性明显降低(P<0.01)，而雌激素孵育后其增殖活性明显改善（P<0.01）（图3A）。与对照组比较，糖尿病大鼠EPCs的小管形成功能明显下降（P<0.01），而雌激素能够明显改善其小管形成功能（P<0.01）（图3B）。细胞迁移实验表明，与对照组比较，糖尿病大鼠EPCs细胞迁移能力明显受损（P<0.01），而雌激素孵育能够明显改善受损的细胞迁移能力（P<0.01）（图3C）。
图 3 雌激素对糖尿病大鼠EPCs增殖、小管形成功能及迁移能力的改善A.细胞增殖能力；B.EPCs小管形成功能：左为成管数量组间比较，右为常规视野成像；C.EPCs迁移能力：左为穿膜细胞的荧光计数组间比较，右为Transwell底部穿膜细胞染色；EPCs: 对照组大鼠EPCs; EPCs(DM): 糖尿病大鼠EPCs; EPCs(DM)+ estrogen:雌激素体外孵育的糖尿病大鼠EPCs (n=12)；**P<0.01，与EPCs组比较；##P<0.01，与EPCs(DM)组比较。3.4 雌激素孵育上调糖尿病EPCs细胞内NO含量
糖尿病大鼠EPCs细胞中NO含量较对照组明显降低(P<0.05)，而雌激素孵育能够明显上调NO的含量(P<0.01)（图4A）。
图 4 雌激素孵育增加EPCs中NO水平并下调EPCs上清液中TSP-1表达及上调MnSOD的表达A.EPCs中NO水平；B.EPCs上清液中TSP-1水平；C.EPCs中MnSOD蛋白表达。EPCs: 对照组大鼠EPCs; EPCs(DM): 糖尿病大鼠EPCs; EPCs(DM)+ estrogen:雌激素体外孵育的糖尿病大鼠EPCs (n=12)；**P<0.01，与EPCs组比较；##P<0.01，与EPCs(DM)组比较。3.5 雌激素孵育上调EPCs细胞中MnSOD的表达并下调上清液中TSP-1的表达
糖尿病组大鼠EPCs细胞上清液中TSP-1含量明显高于对照组(P<0.01)，而给与雌激素孵育后细胞上清液中TSP-1含量明显降低(P<0.05，图4C）。Western blotting检测显示，糖尿病组大鼠EPCs中MnSOD蛋白表达较对照组明显降低(P<0.01)，而雌激素孵育能够明显上调细胞中MnSOD蛋白表达(P<0.01)（图4D）。
4. 讨论
EPCs主要来源于骨髓，在血管新生中具有重要作用。1997年Asahara等[1]首次将其命名为内皮祖细胞，而后其在心血管方面的研究越来越多。EPCs与心血管疾病存在密不可分的联系。研究表明，EPCs的数量和功能与高血压、糖尿病、血脂等呈负相关[8-11]。此外，EPCs在脑缺血、阿尔茨海默症治疗中表现出较好的疗效[12-13]。故改善EPCs功能及增加其数量可作为改善糖尿病血管并发症的新靶点。并将能表达CD34、CD133 等干细胞特征或血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)等细胞标志物定义为EPCs[14]。用密度梯度离心法获取骨髓单核细胞，经培养并采用流式细胞术和荧光显微镜法对细胞进行鉴定，结果表明本实验成功制备大鼠骨髓来源EPCs细胞，且细胞具有较高纯度。
流行病学提示雌激素为心脑血管疾病的保护因素。绝经后女性卒中发生风险明显高于绝经前女性[15]。美国的调查数据显示，年龄在18～39岁的成年男性发生高血压的风险高于同龄女性，但是在年龄大于60岁成人中男性风险低于女性[16]。不同性别发生高血压及靶器官损伤的差异与雌激素相关[17]。此外，杨莹莹[18]等的研究表明雌激素对急性期高血压脑出血患者的EPCs功能有改善作用且与雌激素浓度呈正相关。但是雌激素对糖尿病EPCs功能改善作用及相关机制的研究较少。
本实验采用腹腔注射链脲佐菌素制作大鼠糖尿病模型，提取其骨髓来源的EPCs进行实验，结果发现糖尿病大鼠骨髓EPC的增殖能力较正常EPCs明显下降，而雌激素体外孵育能明显促进其增殖活力；除增殖活力受到抑制外，糖尿病大鼠EPCs的迁移能力和小管形成功能也明显受损，而在体外给予雌激素10 nmol/L孵育后细胞功能得到明显改善。说明雌激素能促进糖尿病大鼠EPCs的增殖并改善其功能。
研究表明氧化应激可导致血管内皮损伤。MnSOD是一种存在于线粒体并能清除机体新陈代谢中产生的过多的氧自由基（O2·−）等有害物质的一种酶[19,]。MnSOD在一定程度上能抵抗高糖所增加线粒体中的活性氧（ROS）细胞的伤害[20]。本实验采用Western blotting检测EPCs细胞中MnSOD蛋白表达，糖尿病组大鼠EPCs细胞中MnSOD蛋白表达明显低于对照组，而给与雌激素体外孵育后能明显上调细胞中MnSOD蛋白表达，说明雌激素通过上调EPCs中MnSOD水平而改善细胞功能。
一氧化氮(NO)与血管健康密切相关。NO通过促进EPCs向内皮细胞分化进而修复受伤的内皮，而抑制内源性NO的合成对EPCs的迁移能力有不良影响[21]。有文献报道，高血糖通过增加活性氧积聚、降低一氧化氮生物利用度及抑制内皮依赖性血管舒张功能，导致严重的血管内皮功能障碍[22-23]。凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）属细胞外基质糖蛋白，其过表达能抑制EPCs的功能[24]，而NO含量降低能诱导TSP-1的表达[25]。本实验发现，糖尿病组大鼠EPCs中NO含量明显降低而细胞上清中TSP-1含量明显升高，雌激素处理能够逆转上述改变，说明雌激素通过增加EPC内NO水平并降低TSP-1含量进而改善糖尿病EPCs功能。
综上所述，本研究证实雌激素能改善受损的糖尿病大鼠EPCs功能并促进其增殖，作用机制可能与其降低细胞内的氧化应激及下调TSP-1的表达相关。本研究为将来进一步进行雌激素在糖尿病血管并发症方面的研究提供了深入的实验与理论依据。
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表 1 藤茶中二氢杨梅素加样回收率的试样结果（
$n=9 $ ）样品
（m/mg）原有量
（m/mg）加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）50.48 6.977 5.010 11.77 95.67 97.53 2.000 50.00 6.902 5.560 12.39 98.71 50.97 6.980 5.460 12.46 100.4 49.64 6.816 6.670 13.38 98.41 49.81 6.935 6.830 13.61 97.74 50.09 6.918 6.810 13.39 95.04 49.59 6.834 8.120 14.94 99.83 50.61 6.854 8.250 14.78 96.07 50.05 6.961 8.300 14.92 95.89 
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表 2 不同采收点芽尖部位藤茶中二氢杨梅素的含量（
$\bar{x}\pm s$ ，$ n=6 $ ）采样点 含量（%） 不同地区含量（%） 湖北恩施 20.80±1.2 24.33±8.1 湖北来凤1 18.60±1.1 湖北来凤2 33.60±1.0 福建将乐1 30.30±0.6 29.47±1.2 福建将乐2 28.63±0.9 湖南八大公 37.69±0.5 31.66±5.0 湖南张家界1 33.67±0.3 湖南张家界2 29.83±0.9 湖南张家界3 30.39±1.2 湖南张家界4 30.43±0.6 湖南武陵山1 22.83±0.5 湖南武陵山2 36.81±0.8 贵州江口1 35.50±0.6 32.26±2.9 贵州江口2 31.40±0.8 贵州江口3 30.60±0.7 贵州罗场1 35.11±1.0 贵州罗场2 28.69±0.5
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表 3 同一采收地点不同部位及加工方式二氢杨梅素含量（
$\bar{x}\pm s$ ，$ n=6 $ ）采收部位 自然晒干含量（%） 自然阴干含量（%） 芽尖 35.85±0.4 32.22±0.8 嫩叶 26.22±0.5 28.32±0.6 粗老叶 15.84±0.5 16.02±0.5 茶梗 15.32±0.2 15.47±0.2 机器采收 20.40±1.0 20.77±0.9 注：1.采收地点为贵州省江口县2号点。2.芽尖部位用自然晒干加工方式其二氢杨梅素含量最高，平均含量为35.85 %。
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表 4 大鼠棉球植入实验肉芽肿净量（
$\bar{x}\pm s$ ，$n=12 $ ）组别 给药剂量（g/kg） 肉芽肿（m/mg） 空白对照组 0.00 428.2±65.4 低剂量组 0.38 392.3±45.3 中剂量组 0.75 372.6±58.9* 高剂量组 2.25 347.3±20.9** *P < 0.05，**P < 0.01，与空白对照组比较。
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表 5 小鼠耳肿胀实验耳郭肿胀率（
$\bar{x}\pm s$ ，$n=15 $ ）组别 给药剂量（g/kg） 耳郭肿胀率（%） 空白对照组 0.00 74.8±24.3 低剂量组 0.75 64.2±11.9 中剂量组 1.50 59.8±13.8* 高剂量组 4.50 53.7±7.8** *P < 0.05，**P < 0.01，与空白对照组比较。
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