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在我国成人死因中,脑卒中位列第一,全球第二[1-2]。在所有的脑卒中患者中,有78%的患者是缺血性脑卒中,其他为出血性脑卒中[3]。脑卒中的治疗药物很少,目前FDA唯一批准的药物只有组织纤溶酶原激活剂。但是,由于其治疗窗口狭窄、有禁忌证和并发症风险,组织纤溶酶原激活剂仅适用于3%~5%的脑卒中患者[2]。因而,寻求新的治疗靶点和手段显得十分重要。
烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nampt)又被称作内脏脂肪素,也是一种脂肪因子。它还有一个名称是PBEF,是合成哺乳动物细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的关键限速酶[4]。最近的研究证明了Nampt可以作为缺血性脑卒中治疗新靶点[2-3,5-7]。Nampt治疗缺血性脑卒中的作用机制包括急性期的脑保护以及慢性期的促血管修复和神经再生作用。这些作用机制通过体内体外试验在神经细胞、内皮祖细胞和神经干细胞得到证实。NAD+在细胞能量维持中起着关键作用[8],而Nampt可以通过补救合成途径促进哺乳动物中NAD+生物合成,影响ATP的产生,对抗缺血性脑卒中后的供能不足,维持细胞内能量稳态,抑制神经细胞死亡[3]。
Nampt既可存在于细胞内,也可以分泌到细胞外[9]。从细胞分泌出来后可以存在于血液中,与高血压、糖尿病等多种疾病相关[10,11]。在缺血性脑卒中发生后,外周血液的Nampt会显著性升高[12-13]。局部脑组织内Nampt对缺血性脑卒中的保护作用已经十分明确,而脑外组织来源的Nampt对缺血性脑卒中的作用研究较少。已知肝脏细胞可以分泌Nampt,并且肝脏被认为是血液Nampt的主要组织来源之一[3,14-15]。本研究主要通过Cre/loxP重组酶系统特异性敲除肝脏Nampt基因的表达,利用大脑中动脉阻塞(MCAO)缺血性脑卒中模型,研究肝脏来源的Nampt是否参与缺血性脑卒中的保护,为进一步明确Nampt作为缺血性脑卒中治疗新靶点的重要意义,为探究外周器官参与缺血性脑卒中损伤及修复的新机制打下基础。
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NamptloxP/loxP小鼠(南京医科大学王强教授实验室赠予)和Albumin-Cre小鼠(上海南方模式生物科技发展有限公司)。动物自由饮水、进食;环境温度控制在(25±1) ℃,相对湿度40%~60%,昼夜均为12 h。所有动物实验均符合实验动物伦理学要求。
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PCR仪(TaKaRa),M200 PRO多功能酶标仪(瑞士Tecan公司),SC12型水平电泳槽(北京凯元信瑞仪器有限公司),FR-980A生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司),红外激光扫描成像系统(LI-COR),蛋白电泳、转膜系统(上海天能科技有限公司),高通量组织研磨仪(上海万柏生物科技有限公司),颅骨钻(广州坤图生物科技有限公司),CHR多功能手术仪(武汉春光医疗美容仪器有限公司)。
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小鼠鉴定引物(上海生工生物工程股份有限公司)序列如表1所示。
表 1 基因型鉴定引物
序号 引物序列(5’-3’) 鉴定基因型 条带位置 引物1 野生型上游引物:
TGCAAACATCACATGCACAC
通用型下游引物:
TTGGCCCCTTACCATAACTG
突变型上游引物:
GAAGCAGAAGCTTAGGAAGATGGNamptloxP/loxPAlb-Cre 150 bp
351 bp
390 bpNamptloxP/loxP 351 bp 引物2 下游引物:
TTCCAGGCTATTCTGTTCCAG
上游引物:
TCTGGCTCTGTGTACTGCTGANamptloxP/loxP 300 bp 鼠尾基因组DNA提取试剂盒(康为世纪生物科技有限公司),多聚甲醛(博光生物科技有限公司),GAPDH抗体和BCA蛋白浓度试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),PBEF抗体(F-8)(Santa Cruz Biotechnology),Premix TaqTM (TaKaRa),硝酸纤维素转移膜(Whatman),IRDye®800CW Donkey anti-Mouse IgG二抗(LI-COR),血浆Visfatin 检测试剂盒(Phoenix Pharmaceuticals, Inc),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(BBI Life Science),异戊巴比妥(BIOSZUNE LIFE SCIENCES DEP),水合氯醛(国药集团化学试剂有限公司)。
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核酸电泳条带为150 bp+351 bp+390 bp的为NamptloxP/loxPAlb-Cre,即LNKO小鼠,核酸电泳条带为351 bp的为NamptloxP/loxP,即WT小鼠。小鼠基因型鉴定结果如图3所示,从左到右,泳道1为DNA Maker,泳道2和3为WT小鼠(351 bp),泳道4和5为LNKO小鼠(150 bp+351 bp+390 bp)。
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比较各组小鼠12周龄的体重。如图4所示,WT雄性小鼠的体重为(25.31±1.91) g,LNKO雄性小鼠的体重为(25.19±1.17) g,WT雌性小鼠的体重为(19.79±1.19) g,LNKO雌性小鼠的体重为(20.36±1.79) g。同一性别中,LNKO和WT小鼠体重比较没有显著性差异。WT小鼠中,雄鼠比雌鼠平均重5.52 g(P<0.001)。LNKO小鼠中,雄鼠比雌鼠平均重4.83 g (P<0.001)。以上结果说明特异性敲除肝脏Nampt基因表达,对小鼠的体重无影响。
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为进一步验证成功培育肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠,提取各组小鼠的肝脏和脑组织蛋白,通过蛋白免疫印迹验证两种组织中Nampt蛋白的表达。如图5A所示,同一性别肝脏组织中,LNKO小鼠Nampt蛋白表达水平都显著性低于其对照WT小鼠,其中LNKO雄性小鼠Nampt蛋白表达水平比WT雄性小鼠降低了67.1%;LNKO雌性小鼠Nampt蛋白表达水平比WT雌性小鼠降低了81.3%。如图5B所示,在脑组织中,LNKO小鼠Nampt蛋白表达水平与其对照小鼠相比无显著性差异。蛋白免疫印迹结果进一步证明,肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠被成功构建。
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根据血浆Visfatin检测试剂盒的数据处理方法,测量Nampt蛋白的标准品(浓度依次为0.1、1、10、100、1000 ng/ml)在450 nm处的吸光度(A)值,对数据进行四参数Logistic曲线拟合得到图6A,R2=1,曲线拟合效果很好。
根据拟合曲线方程和样品的吸光度值,计算各组小鼠血浆Nampt蛋白浓度。如图6B所示,同一性别对应的LNKO与WT小鼠血浆Nampt蛋白浓度无显著性差异,LNKO与WT小鼠的血浆Nampt蛋白浓度也无显著性差异。只有LNKO雄性组的血浆Nampt蛋白平均浓度比LNKO雌性组略升高0.91 ng/ml(P<0.05)。
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MCAO造模43只小鼠,成功造模38只,其中WT雄性小鼠11只,LNKO雄性小鼠8只,WT雌性小鼠11只,LNKO雌性小鼠8只,造模成功率为88.37%。
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图7A显示各组典型脑片TTC染色,白色是梗死区。图7B代表统计后各组相对脑梗死体积。MCAO造模24 h后,相对脑梗死体积数据如下:WT雄性组为(16.14±1.78)%,LNKO雄性组为(17.71±2.08)%,WT雌性组为(16.85±3.36)%,LNKO雌性组为(18.68±4.50)%。各组在MCAO 造模24 h后的相对脑梗死体积无显著性差异。
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神经行为学损伤评分数据如表2所示。造模24 h后,各组小鼠以轻度神经功能损伤为主,瘫痪侧前肢不能完全伸展;每组都存在部分发生中度神经功能损伤,行走时向瘫痪侧转圈。各组在MCAO造模24 h后神经行为学评分无显著性差异,而且各组神经行为学评分高低与相对脑梗死体积一致。
表 2 各组小鼠MCAO造模24 h后神经行为学损伤评分 (n≥8)
组别 神经行为学损伤评分(分) WT雄性组 1.20±0.42 LNKO雄性组 1.50±0.71 WT雌性组 1.32±0.56 LNKO雌性组 1.63±0.69 WT组 1.26±0.49 LNKO组 1.56±0.68 WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照;LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。 -
MCAO造模24 h后,各组血浆Nampt蛋白平均浓度:WT雄性组为(6.26±0.98) ng/ml,LNKO雄性组为(6.44±1.03) ng/ml,WT雌性组为(5.28±0.86) ng/ml,LNKO雌性组为(5.70±0.80) ng/ml。如图8所示,LNKO及其同窝对照WT小鼠在MCAO造模24 h后血浆Nampt蛋白表达无显著性差异。
Effects of liver-specific Nampt knockout on ischemic stroke
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摘要:
目的 烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase,Nampt)是缺血性脑卒中的治疗新靶点。本研究旨在阐明肝脏来源的Nampt是否对缺血性脑卒中具有保护作用。 方法 运用Cre/loxP系统制备肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。将NamptloxP/loxP小鼠与肝脏特异性表达Cre重组酶小鼠(Alb-Cre)进行杂交,采用聚合酶链反应方法鉴定子代基因型。测定基因敲除小鼠和同窝对照小鼠的体重。蛋白免疫印迹法检测小鼠肝脏和脑中Nampt蛋白的表达。采用电凝法对肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠和对照小鼠制备大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)脑卒中模型,造模24 h后对各组小鼠进行神经功能损伤评分,TTC染色测定脑梗死体积,ELISA法检测各组小鼠血浆Nampt水平。 结果 成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠,其基因型为NamptloxP/loxP Alb-Cre。肝脏特异性Nampt基因敲除组肝脏Nampt蛋白表达与对照组相比下降74.2%。脑Nampt蛋白的表达在敲除组与对照组之间无显著性差异。肝脏特异性Nampt基因敲除对小鼠的体重无影响。正常生理条件下,同性别肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠与对照小鼠血浆Nampt水平无明显差异。MCAO造模24 h后,肝脏特异性Nampt基因敲除组与对照组神经行为学损伤评分、脑梗死体积和血浆Nampt浓度也无显著性差异。 结论 成功构建肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠;肝脏来源Nampt对缺血性脑卒中没有明显保护作用。 -
关键词:
- 烟酰胺磷酸核糖转移酶 /
- 特异性敲除 /
- 肝脏 /
- 脑卒中
Abstract:Objective Nicotinamide phosphoribosyltransferase (Nampt) is a new therapeutic target for ischemic stroke. The aim of this study was to investigate protective effect of liver-derived Nampt on ischemic stroke. Methods Liver-specific Nampt knockout mice were generated using the Cre/loxP system. NamptloxP/loxP mice were crossed with liver-specific Cre recombinase expression mice (Alb-Cre), and the progeny genotypes were identified by polymerase chain reaction. Body weight of knockout mice and control mice were measured. Nampt in liver and brain was determined by Western blot assay. Middle cerebral artery occlusion (MCAO), a classical ischemic stroke model, was generated in liver-specific Nampt knockout mice and control mice by electrocoagulation. After 24 h of modeling, neurological deficit scores of each group were evaluated and TTC staining was performed to determine the cerebral infarction volume. The level of plasma Nampt in each group was determined by ELISA. Results Liver-specific Nampt knockout mice with the genotype of NamptloxP/loxPAlb-Cre were successfully constructed. The hepatic Nampt expression in knockout mice was significantly decreased by 74.2% compared to control mice, while there was no significant difference in the expression of brain Nampt protein between the knockout group and the control group. Specific knockout of liver Nampt gene expression had no effect on the body weight of mice. Under normal physiological conditions, there was no significant difference in plasma Nampt levels between liver-specific Nampt knockout mice and control mice of the same gender. 24 h after MCAO modeling, there were no significant differences in neurological deficit scores, cerebral infarct volume and plasma Nampt concentration between liver-specific Nampt knockout group and control group. Conclusion Liver-specific Nampt knockout mice are successfully constructed. Liver-derived Nampt has no significant protective effects on ischemic stroke. -
Key words:
- Nampt /
- specific knockout /
- liver /
- stroke
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表 1 基因型鉴定引物
序号 引物序列(5’-3’) 鉴定基因型 条带位置 引物1 野生型上游引物:
TGCAAACATCACATGCACAC
通用型下游引物:
TTGGCCCCTTACCATAACTG
突变型上游引物:
GAAGCAGAAGCTTAGGAAGATGGNamptloxP/loxPAlb-Cre 150 bp
351 bp
390 bpNamptloxP/loxP 351 bp 引物2 下游引物:
TTCCAGGCTATTCTGTTCCAG
上游引物:
TCTGGCTCTGTGTACTGCTGANamptloxP/loxP 300 bp 表 2 各组小鼠MCAO造模24 h后神经行为学损伤评分 (n≥8)
组别 神经行为学损伤评分(分) WT雄性组 1.20±0.42 LNKO雄性组 1.50±0.71 WT雌性组 1.32±0.56 LNKO雌性组 1.63±0.69 WT组 1.26±0.49 LNKO组 1.56±0.68 WT: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠同窝对照;LNKO: 肝脏特异性Nampt基因敲除小鼠。 -
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