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根据世界卫生组织最新统计显示，心脑血管疾病如心肌梗死、缺血性卒中等是目前全球最主要的致死原因[1]。血小板作为动脉血栓形成的一项重要介质，其高反应性是导致动脉血栓事件发病率和病死率增加的重要危险因素[2, 3]。尽管现有的抗血栓药物可有效减少心血管疾病患者的动脉血栓形成，但出血的不良反应也极大限制了它们的使用。因此为了开发出能在抗血栓形成效果和出血之间取得更好平衡的新一代安全有效的抗血栓药物，迫切需要了解导致血管血栓闭塞的致病机制，开展新靶标的基础研究[4, 5]。
分泌蛋白可由机体各种组织器官分泌，在生理、病理过程中起关键作用，具备良好的研究前景，有望开发成为心脑血管疾病防治的药物、靶标、生物标志物[6, 7]。近期有多项研究表明部分分泌蛋白大量存在于血液之中，可直接作用于血栓调控[8-10]。Metrnl是本实验室前期通过构建限食模型筛选获得的一种与神经营养因子Metrn同源的新型分泌蛋白[11]。迄今为止，多项研究结果表明Metrnl在免疫炎症及代谢性心脑血管疾病中发挥重要作用，例如调节胰岛素敏感性、维持肠道稳态、对抗动脉粥样硬化、促进血管新生等[12-17]。此外，临床研究显示，血液Metrnl水平与冠心病、心肌梗死、缺血性脑卒中等多种血栓性疾病存在相关性[18-20]。以上结果均提示Metrnl在心脑血管疾病病理过程中扮演重要角色，但是Metrnl在血栓形成特别是其对血小板的直接作用尚未可知。
前期，本实验室通过使用Metrnl全身性敲除小鼠，已在多种血栓模型下证明Metrnl缺乏会导致血栓形成能力增强，并且在进一步的血小板功能检测中，证实Metrnl缺乏会导致血小板活性增强[21]。然而，我们尚未证明究竟是循环Metrnl还是血小板Metrnl的缺乏在促进血栓形成中扮演主要角色，且血小板Metrnl是否可以直接调控血小板活性改变，从而在血小板高活性与动脉血栓形成事件发生率增加之间建立联系，目前尚不清楚。
因此，本研究使用Metrnlloxp/loxp小鼠和Pf4-Cre小鼠进行交配繁殖，旨在构建血小板特异性Metrnl敲除小鼠模型，作为深入研究血小板内源性Metrnl在动脉血栓中的作用及调控机制的工具，并对该敲除小鼠的构建成功与否展开验证工作。
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鼠尾DNA提取试剂盒（CW2094S）购自北京康为世纪生物科技有限公司，5×Evo M-MLV RT Master Mix（AG11706）、通用型RNA提取试剂盒（AG21022）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司，小鼠Actin抗体（
66009 -1-IG）购自武汉三鹰技术有限公司，Anti-METRNL抗体（ab235775）购自Abcam公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）（A0216）、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）（A0208）购自上海碧云天生物技术有限公司，红细胞裂解液（BL503B）购自北京兰杰柯科技有限公司。实时荧光定量PCR仪（LightCycler96）来自Roche公司，PCR仪（TP600）来自Takara公司，化学发光分析系统（5200S）来自Tanon公司，动物全血计数仪（pocH-100iV）来自希森美康公司。
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Metrnlloxp/loxp小鼠为实验室前期构建所得。SPF级8周龄Pf4-Cre小鼠购自上海南方模式生物技术有限公司。
所有实验小鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（24±2） ℃，相对湿度为40%~60%，饲养期间笼盒内保持清洁，小鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学大学医学研究伦理委员会批准指导。
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将剪刀消毒后剪取小鼠尾尖约3 mm，剪碎，按照DNA提取试剂盒的说明书方法提取DNA。之后，对目的基因进行PCR扩增，各引物序列如表1。
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） Metrnl loxp TGAGGGTTGGAGGCTCCTAGC GGATGAGCGTTTGAGCACAGC Pf4-Cre CCAAGTCCTACTGTTTCTCACTC TGCACAGTCAGCAGGTT 内参基因 CAAATGTTGCTTGTCTGGTG GTCAGTCGAGTGCACAGTTT 将PCR产物进行1.2% 琼脂糖凝胶电泳，上样量为每孔6 μl，电泳条件为100 V×30 min，结束后进行拍照、分析。
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将小鼠称重后，腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液（100 mg/kg），待小鼠处于深度麻醉后，打开其腹腔，用1 ml注射器吸取约100 μl 2%枸橼酸钠溶液（枸橼酸钠0.2 g，蒸馏水定容至10 ml），自腹主动脉处缓慢抽取抗凝血液，并转移至15 ml离心管中。组织灌流后迅速剪取小鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠组织，放入组织冻存管扔进液氮速冻，待取材结束后及时转入−80 ℃超低温冰箱储存。骨髓提取分离小鼠股骨并剪去多余肌肉和纤维组织，剪掉股骨两端，在干净PBS中反复冲洗骨髓腔，收集冲洗液室温离心
1000 r/min×5 min获得骨髓细胞，用1 ml Triozl溶液重悬混匀，储存至−80 ℃超低温冰箱。 -
向小鼠抗凝全血中加入等体积0.9%生理盐水，并加入Apyrase（终浓度2 U/ml），快速颠倒混匀后室温离心800 r/min×10 min；离心后收集最上层富血小板血浆（PRP），转移至新的15 ml离心管，室温离心
1700 r/min×5 min，弃去上清液，取适量台式液重悬。 -
小鼠心脏采抗凝血后，室温离心
1000 r/min×5 min,弃去上清液后加入5 ml的红细胞裂解液，室温作用10 min，室温离心1000 r/min×5 min，重复1次，在血细胞沉淀中加入5 ml PBS洗涤，室温离心1000 r/min×5 min，弃去上清后根据白细胞沉淀的量加入100～500 μl PBS重悬。红细胞提取在全血中加入等体积红细胞保存液（枸橼酸钠0.8 g，葡萄糖2.05 g，枸橼酸0.0325 g，氯化钠0.42 g，蒸馏水定容至100 ml）, 室温离心2 000 r/min×10 min，连续离心洗涤3次后，取压积红细胞加入100～500 μl红细胞保存液重悬。 -
使用RNA提取试剂盒提取组织RNA，Triozl法提取骨髓RNA，将得到的RNA进行浓度测定与吸光度测定后进行逆转录，得到cDNA用于实时荧光定量PCR实验，各引物序列如表2。
表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） Mouse Metrnl CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT GGACAACAAAGTCACTGGTACAG Mouse Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG -
取适量组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240 s。取出高速离心管，离心：
12000 g×15 min。将上清液转移至另一干净1.5 ml EP管中，进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5×蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V×60 min。使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为100 V×60 min。
转膜结束后，使用快速封闭液封闭20 min，之后使用1 × TBST缓冲液洗膜，5 min×3次。加入一抗孵育液（1∶
1000 稀释）4 ℃孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1×TBST缓冲液洗膜，10 min×3次。加入二抗孵育液（1∶1000 稀释）常温孵育1 h，用1×TBST缓冲液洗去二抗，10 min×2次，结束后即可进行扫膜。 -
实验数据使用GraphPad Prism 9.5进行统计分析。两组间的比较使用two-tailed Student’s t test检验，P<0.05视为结果存在统计学意义。
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本研究构建策略基于前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠和Cre-LoxP重组酶系统,所构建血小板特异性Metrnl敲除小鼠（Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+）简称Plt-Metrnl-/-小鼠，具体构建策略如图1A所示。
图 1 血小板特异性Metrnl敲除小鼠构建策略、培育流程及基因型鉴定
Metrnlloxp/loxp小鼠是前期构建而成，该小鼠Metrnl基因的3号外显子两侧和4号外显子编码区的都插有同向LoxP位点（即图1A中所示“等位基因”），可基于Cre-LoxP系统在Cre酶的作用下，将LoxP位点之间的序列切除（图1A）[12]。
Pf4-Cre小鼠是由Pf4基因启动子Cre重组酶在巨核细胞及血小板谱系表达的工具鼠，最初开发用于研究APC-Wnt调节途径在巨核细胞生成和血小板产生中的作用，其Cre重组酶的表达受巨核细胞特异性受体Pf4基因的启动子介导，在巨核细胞的成熟Ⅰ期（最早可识别形态期）中即开始发生转录激活，之后广泛表达于成熟的血小板[22, 23]。
将Metrnlloxp/loxp小鼠和Pf4-Cre小鼠进行交配繁殖，巨核细胞特异性表达的Cre酶可将Metrnl同向LoxP位点之间的序列切除，以达到在巨核细胞及血小板谱系特异性敲除Metrnl基因的目的，具体构建繁殖流程如图1B所示，最终可以获得Plt-Metrnl-/-小鼠及其对照小鼠（WT）。
繁殖过程中进行基因型鉴定时，需确认Metrnlloxp基因和Pf4-Cre基因的表达情况。采用相应基因上下游引物分别进行鼠尾基因型鉴定，Metrnlloxp突变型基因阳性条带为243bp，对应野生型序列条带为131bp，Pf4-Cre基因阳性条带为420bp，内参基因阳性条带为200bp。对培育繁殖过程中的母代及子代小鼠均进行了基因型鉴定，如图1C、D、E中DNA电泳条带图所示：图1C中泳道1、2为母代Metrnlloxp/loxp小鼠，泳道3、4为母代Pf4-Cre小鼠；图1D中泳道1、2为Metrnlloxp/WT小鼠，泳道3、4为Metrnlloxp/WT/Pf4-Cre+小鼠；图1E泳道1、2、4为Plt-Metrnl-/-小鼠，泳道3、5、6为WT小鼠。
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为验证血小板特异性Metrnl敲除小鼠是否实现血小板特异性Metrnl基因敲除，分别提取Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血小板蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证敲除情况，结果如图2所示，Plt-Metrnl-/-小鼠血小板蛋白Metrnl表达较对照WT小鼠明显降低，提示Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl成功敲除。
图 2 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血小板Metrnl蛋白相对表达量（
$\bar x $ ±s, n=3） -
为验证血小板特异性Metrnl敲除小鼠是否存在其他组织非特异性敲除，本研究首先利用实时荧光定量PCR技术检测了该小鼠各组织中Metrnl mRNA的表达情况。如图3所示，以WT对照小鼠的心脏Metrnl mRNA表达量为1，Plt-Metrnl-/-小鼠在心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠、骨髓组织mRNA水平上并未存在显著差异。该结果说明，血小板特异性Metrnl基因敲除小鼠在组织mRNA水平上并未发生其他组织非特异性敲除。
图 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各组织的Metrnl mRNA相对表达量（
$\bar x $ ±s，n=5～6）然后，本研究提取血细胞及各组织的蛋白，使用蛋白免疫印迹实验方法验证Plt-Metrnl-/-小鼠各血细胞及组织中Metrnl蛋白表达情况。如图4所示，并未发现Metrnl蛋白在Plt-Metrnl-/-小鼠和对照WT小鼠各组织中存在显著差异，该结果提示，Plt-Metrnl-/-小鼠在其他血细胞蛋白水平及各组织蛋白水平上并未发生非特异性敲除。
图 4 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各血细胞及各组织的Metrnl蛋白表达情况（
$\bar x $ +s, n=3） -
分别对Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠外周血进行血常规指标检测，结果如表3所示，外周血血常规计数红细胞、白细胞、血小板数量未见明显改变，血小板大小及分布未见显著差异，提示血小板特异性敲除Metrnl后不影响外周血细胞数量，且对血小板形态没有明显影响。
表 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血常规指标对比（n=6）
血常规检验项目 WT Plt-Metrnl-/- 白细胞计数（109/L） 2.10±0.50 2.25±0.30 淋巴细胞计数（109/L） 1.28±0.20 1.52±0.20 淋巴细胞比率（%） 63±3 68±3 嗜酸性粒细胞计数（109/L） 0.10±0.05 0.05±0.02 嗜酸性粒细胞比率（%） 3.0±1.8 1.0±0.3 其他细胞计数（109/L） 0.72±0.20 0.68±0.10 其他细胞比率（%） 34.0±3.3 31±3 红细胞计数（1012/L） 8.49±0.40 7.83±0.40 血红蛋白（g/L） 122.0±5.5 113.0±4.6 红细胞压积（%） 42±2 37±2 平均红细胞体积（fL） 49.1±0.8 47.7±0.9 平均血红蛋白含量（pg） 14.30±0.08 14.5±0.1 平均血红蛋白浓度（g/L） 292±5 304.0±7.7 红细胞分布宽度-SD（fL） 27.6±0.4 26.2±0.6 红细胞分布宽度-CV（%） 13.2±0.4 12.4±0.3 血小板计数（109/L） 1121 ±581049 ±132血小板平均宽度（fL） 6.7±0.4 6.1±0.1 平均血小板体积（fL） 6.20±0.26 5.80±0.08 大型血小板比率（%） 1.9±1.0 3.5±0.3 -
Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠和对照WT小鼠为首次繁殖培育的转基因动物，在生理状态下，血小板Metrnl缺失是否影响动物繁殖情况尚未见报道，因此，本研究统计记录了小鼠基因型分布情况。Plt-Metrnl-/-小鼠扩大繁殖流程如图5A所示，按照遗传学规律，Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠杂交繁殖获得子代鼠中Plt-Metrnl-/-小鼠和WT小鼠的比例应为1∶1。如图5B、5C所示，对繁殖过程中所获得的16窝次共计130只目的鼠进行统计，Plt-Metrnl-/-小鼠共有67只，其中雄鼠31只，雌鼠36只；WT小鼠共有63只，其中雄鼠37只，雌鼠26只。结果表明繁殖鼠遗传规律基本符合预期，无明显差异，提示血小板特异性敲除Metrnl对小鼠胚胎发育和性别比例无明显影响。
图 5 Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠扩大繁殖流程和子代鼠一般繁殖情况
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Cre-LoxP重组酶系统主要用于构建条件性基因敲除小鼠模型，是当前阐释基因功能的最直接的方式之一。Pf4-Cre工具鼠长期以来应用于巨核谱系基因敲除动物的构建，虽然有研究表明Pf4-Cre表达不仅限于巨核细胞/血小板谱系，也表达于其他骨髓造血干细胞以及远端肠道的上皮细胞中，但是该小鼠目前仍是巨核细胞谱系遗传修饰的最佳工具，且不影响血小板和血栓形成功能的考察[22-24]。因此本研究利用Pf4-Cre工具鼠和实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠进行杂交繁殖，最终获得血小板特异性Metrnl敲除小鼠，即Plt-Metrnl-/-小鼠。
本研究从mRNA水平、组织蛋白水平、外周血常规水平考察了Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl敲除的情况。本研究结果显示，Plt-Metrnl-/-小鼠血小板Metrnl蛋白表达较对照WT小鼠减低约50%，可能是由于本实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠插入的loxp序列位点在3、4号外显子，因此Pf4-Cre仅介导3、4号外显子间的同向基因序列切除，并未实现Metrnl基因全长敲除。另外，血小板是骨髓巨核细胞分化形成的“细胞碎片”，由于无法获得原代骨髓巨核细胞，本研究并未对骨髓巨核细胞的Metrnl敲除情况进行验证，未证实Metrnl敲除是否会对骨髓巨核细胞的生成和形态产生影响，仅从血常规计数中初步得知血小板的生成未受到明显影响。Metrnl与骨髓巨核细胞之间的关系也可作为下一步的研究方向。
在小鼠培育的过程中，尚未发现Plt-Metrnl-/-小鼠和同窝对照WT小鼠在体重、形态等方面的差异。基于孟德尔遗传定律，Plt-Metrnl-/-小鼠和Metrnlloxp/loxp小鼠杂交进行扩大繁殖和保种的得率也接近50%，说明血小板Metrnl缺失不影响小鼠繁殖情况。
前期本课题组已证实Metrnl全身敲除小鼠血栓形成能力增强，血小板活性明显增强，构建Plt-Metrnl-/-小鼠可考虑用于血小板内源性Metrnl与血小板功能相关性的研究，并且该小鼠可与Metrnl全身敲除小鼠进行血栓形成能力比较，比较全身Metrnl和局部血小板Metrnl的作用，深入研究其作用方式及机制，为血栓性疾病的防治提供新靶点。
Construction and validation of a platelet-specific Metrnl gene knockout mouse model
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摘要:
目的 构建血小板特异性Metrnl基因敲除的小鼠（Plt-Metrnl-/-小鼠）模型。 方法 基于Cre-LoxP系统利用Pf4-Cre小鼠与实验室前期构建的Metrnlloxp/loxp小鼠进行交配繁殖，得到目的Plt-Metrnl-/-小鼠。对该目的小鼠进行基因型鉴定，收集其血液及心、肝、脾、肺、肾、脑、结肠、骨髓组织，利用实时荧光定量PCR技术、蛋白免疫印迹实验，考察血小板特异性Metrnl敲除小鼠的敲除情况。 结果 Plt-Metrnl-/-小鼠的血小板Metrnl蛋白水平显著低于对照组WT小鼠，其他外周血细胞及各组织mRNA水平、蛋白水平、血常规指标、生长发育一般情况与对照组WT小鼠无明显差异。 结论 血小板特异性Metrnl敲除小鼠（Plt-Metrnl-/-小鼠）模型构建成功。 Abstract:Objective To construct the platelet-specific Metrnl gene knockout （Plt-Metrnl-/-）mice model. Methods Based on the Cre-LoxP system, Metrnlloxp/loxp mice, previously constructed in our laboratory, were mated with Pf4-Cre mice to generate Plt-Metrnl-/- mice. The genotypes of the offspring were identified, and tissues of the platelet, other peripheral blood cells, heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, colon, and bone marrow were collected. The expression of the Metrnl gene in Plt-Metrnl-/- mice was investigated by quantitative real-time PCR and western blot. Also, the blood routine index was tested in Plt-Metrnl-/- mice. Results Compared with wild-type mice, the level of Metrnl protein in platelets was significantly decreased in Plt-Metrnl-/- mice. There was no significant difference in mRNA and protein levels of other peripheral blood cells and tissues, as well as in blood routine index, growth, and development between Plt-Metrnl-/- mice and WT mice. Conclusion Platelet-specific Metrnl knockout mice（Plt-Metrnl-/- mice）model was successfully constructed. -
Key words:
- Metrnl /
- gene-knockout mouse /
- platelet
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复方金钱草颗粒由广金钱草、车前草、光石韦以及玉米须四味中药材组成，现执行标准为《中国药典》（一部）2015年版及国家食品药品监督管理总局药品补充批件（2016B00026）。该药具有清热利湿、通淋排石的作用，在临床上用于治疗湿热所致的热淋、石淋，症见尿频、尿急、尿痛、腰痛的患者，以及泌尿系结石、尿路感染见上述证候者[1]。现代药理学研究也显示复方金钱草颗粒具有防治草酸钙结石形成、促进输尿管蠕动和增加尿量、抗炎[2-5]及增加冠脉血流量、保肝利胆[3-5]、免疫调节等作用[5]。复方金钱草颗粒中的化学成分包含黄酮类[5-8]、甾醇类[5,7-9]、生物碱类[5-7]、萜类[5,7,9]、酚酸类[5-6,8]、挥发油[5,7]、多糖类等[6-7]。由于复方金钱草颗粒成分复杂，目前尚无全面的化学成分鉴定工作。本研究致力于建立起一种快速有效的系统分析方法，同时定性地鉴别其多种化合物成分，为其有效成分研究提供依据。
1. 试剂与仪器
1.1 试剂
分析纯无水乙醇（中国医药集团上海化学试剂公司）；质谱纯甲酸、质谱纯乙腈、0.22 µm滤膜（德国Merck集团）；复方金钱草颗粒（规格：10g，广西万通制药有限公司）
1.2 仪器
BP121S电子分析天平（德国Sartorius公司）；Milli-Q A10超纯水净化系统(美国Millipore公司)；KQ-400KDB超声波清洗器（400W, 40KHz；昆山市超声仪器有限公司）；X1R-230 V台式离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Agilent 1290超高效液相色谱仪、Agilent 6538四极杆飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司）。
2. 试验方法
2.1 色谱和质谱条件
2.1.1 色谱条件
采用Agilent 1290超高效液相色谱仪(UHPLC)，色谱柱为XBridge BEH C18柱(2.1 mm×100 mm, 2.5 µm )，柱温为40 ℃，进样量为3 µl，流动相由0.1%甲酸水(A)和0.1%甲酸乙腈(B)组成，梯度洗脱，洗脱条件见表1，分析时间为19 min，流速为0.4 ml/min。
表 1 流动相梯度洗脱条件时间(t/min) A(%) B(%) 0 98 2 2 98 2 12 40 60 17 2 98 19 2 98 2.1.2 质谱条件
采用Agilent 6538四极杆飞行时间质谱仪(Q-TOF/MS)，质谱参数如下：电喷雾离子源（正离子模式）；质谱扫描范围: 50～1500 m/z；干燥气温度为350 ℃；干燥气流速为11 L/min；雾化气压力为45 psig；毛细管电压为4000 V；碎片电压为120 V；Skimmer电压为60 V；参比离子m/z为121.0509和922.0098。
2.2 供试品溶液制备
精密称取2.0 g复方金钱草颗粒，置于50 ml具塞三角烧瓶中，加入55 %乙醇提取溶剂25 ml，称定质量并记录，在55 ℃水浴中超声加热回流提取药液10 min，经室温冷却后，再次称定并用提取溶剂补足损失的质量，15000 r/min离心20 min，取上清液并经0.22 µm滤膜过滤，得提取液。
2.3 复方金钱草颗粒中化学成分数据库的建立
复方金钱草颗粒由广金钱草、车前草、光石韦和玉米须等四味中药材组成。通过搜索中国知网、万方数据、PubMed等网站中关于复方金钱草颗粒及其四味中药材的文献，检索上海有机化学研究所的化学专业数据库、TCMID来建立复方金钱草颗粒化学成分数据库，其相关信息包括化合物中英文名称、分子式以及相对分子质量。
3. 结果与讨论
3.1 四极杆飞行时间质谱成分筛查
复方金钱草颗粒UHPLC-Q-TOF/MS总离子流图见图1。应用Qualitative Analysis质谱分析软件计算可能的分子组成(误差<8 ppm)，结合复方金钱草颗粒化学成分数据库，对复方金钱草颗粒提取溶液所得色谱图上色谱峰进行分析，利用精确分子量匹配和碎片离子归属策略，初步尝试鉴定出51个化学成分，结果如表2所示。
表 2 复方金钱草颗粒化学成分鉴别分析结果序号 名称 分子式 M+X m/z 质量 误差(ppm) 1 b 水苏糖 C24 H42 O21 (M+H)+ 667.2312 666.2244 3.86 2 b 桂皮酸 C9 H8 O2 (M+H)+ 149.0594 148.052 −3.2 3 abd 原儿茶酸 C7 H6 O4 (M+H)+ 155.0335 154.0261 −3.44 /龙胆酸 4 a 广金钱草内酯 C8 H13 N O3 (M+H)+ 172.0968 171.0894 −0.75 5 bd 咖啡酸 C9 H8 O4 (M+H)+ 181.0493 180.0421 −0.79 6 abcd 绿原酸 C16 H18 O9 (M+H)+ 355.1028 354.0955 1.1 7 b 丁香酸 C9 H10 O5 (M+H)+ 199.0607 198.0531 1.24 8 a 香橙素 C15 H12 O6 (M+H)+ 289.0716 288.0641 2.62 9 ab 黄芩素 C15 H10 O5 (M+H)+ 271.0609 270.0535 2.66 /染料木素 /芹菜素 10 c (R/S)-eriodictyol-8-C-β-D-glucopyranoside C21 H22 O11 (M+H)+ 473.1063 450.118 3.88 11 a 芸香苷 C27 H30 O16 (M+H)+ 611.1623 610.1551 2.79 12 ac 槲皮素 C15 H10 O7 (M+H)+ 303.0505 302.0432 1.78 /3,5,7,4'-tetrahydroxy-coumaronochromone /6-羟基木犀草素 13 b 大车前苷 C17 H24 O10 (M+H)+ 389.1458 388.1385 4.04 14 bd 对-香豆酸 C9 H8 O3 (M+H)+ 165.0547 164.0476 1.45 15 a homoadonivernite C26 H28 O15 (M+H)+ 581.152 580.1445 2.96 /刺苞菊苷 16 a 维采宁-2 C27 H30 O15 (M+H)+ 595.1672 594.1597 2.08 17 b 桃叶珊瑚苷元 C9 H12 O4 (M+H)+ 185.0816 184.0742 3.46 18 a 6-C-glycopyranosyl-8-C-xyloeyl apigenin C26 H28 O13 (M+H)+ 549.1621 548.1552 4.12 /6-C-glycopyranosyl-8-C-glycopyranosyl apigenin 19 ab 阿魏酸 C10 H10 O4 (M+H)+ 195.0654 194.058 0.71 /咖啡酸甲酯 20 b 黑麦草内酯 C11 H16 O3 (M+H)+ 197.117 196.1097 −1.16 21 b 车前黄酮苷 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 22 b 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 23 a 异槲皮苷 C21 H20 O12 (M+H)+ 465.1033 464.0965 2.16 /紫花杜鹃素丁 /6-hydroxyl luteolin 7-O-glucoside 24 c 杧果苷 C19 H18 O11 (M+H)+ 423.0933 422.0861 2.84 /异杧果苷 25 a 山柰酚-3-O-芸香糖苷 C27 H30 O15 (M+H)+ 595.1672 594.1597 2.08 26 a 维采宁-1 C26 H28 O14 (M+H)+ 565.1572 564.1498 3.42 /维采宁-3 /异夏佛塔雪轮苷 /夏弗塔雪轮苷 27 abd 对羟基苯甲酸 C7 H6 O3 (M+H)+ 139.039 138.0317 0.31 /水杨酸 /原儿茶醛 28 a 异荭草素 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 29 a 牡荆素 C21 H20 O10 (M+H)+ 433.1137 432.1064 1.65 /异牡荆素 /大波斯菊苷 /染料木苷 30 a 三叶豆苷 C21 H20 O11 (M+H)+ 449.1089 448.1016 2.34 31 ab 5, 7-dihydroxy-2', 4'-dimthoxy-isoflavanone-7-O-β-glucopyranoside C23 H26 O11 (M+H)+ 479.1563 478.149 3.11 /[(2R,3S,4S,5R,6R)-6-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]-4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-3-yl] (E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoate /木通苯乙醇苷A /木通苯乙醇苷B /车前草苷 A /车前草苷 B /3,4-Dihydroxyphenethylalcohol-6-O-caffeoyl-β-D-glucoside /去鼠李糖洋丁香酚苷 32 b 车前草苷D C29 H36 O16 (M+H)+ 663.19 640.1989 −2.26 /大车前苷 33 b 异洋丁香酚苷 C29 H36 O15 (M+H)+ 647.195 624.2038 −2.67 /洋丁香酚苷 /Beta-D-Glucopyranoside, 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl 3-O-(6-deoxy-alpha-L-mannopyranosyl)-, 6-(3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-propenoate), (E)- 34 b 黄芩苷 C21 H18 O11 (M+H)+ 447.0938 446.0864 3.35 35 b 高车前苷 C22 H22 O11 (M+H)+ 463.1239 462.117 1.7 36 a 5, 7-Dihydroxy-2'-methoxy-3', 4'-methylenedioxy-isoflavanone-7-O-β-glucopyranoside C23 H24 O12 (M+H)+ 493.136 492.1282 2.96 37 abcd 山柰酚 C15 H10 O6 (M+H)+ 287.0558 286.0482 1.45 /木犀草素 /2’-Hydroxygenistein /高山黄芩素 38 a 5, 7-Dihydroxy-2', 3', 4'-trimethoxy-isoflavanone-7-O-β-glucopyranoside C24 H28 O12 (M+H)+ 509.1668 508.1596 2.93 39 b 异角胡麻苷 C31 H40 O15 (M+Na)+ 675.2281 652.2391 3.69 /角胡麻苷 40 a 5, 7-Dihydroxy-2'-methoxy-3', 4'-methylenedioxy-isoflavanone C17 H14 O7 (M+H)+ 331.0824 330.0748 2.45 41 a 5, 7-Dihydroxy-2', 3', 4'-trimethoxy-isoflavanone C18 H18 O7 (M+H)+ 347.112 346.105 −0.6 42 a Homoferreirin C17 H16 O6 (M+H)+ 317.1034 316.0959 3.82 43 a 大豆皂苷 I C48 H78 O18 (M+H)+ 965.5112 942.5214 2.75 44 b 桃叶珊瑚苷 C15 H22 O9 (M+H)+ 347.1352 346.1279 4.44 45 d 亚油酸 C18 H32 O2 (M+H)+ 303.2303 280.2408 2.2 46 d 邻苯二甲酸二丁酯 C16 H22 O4 (M+H)+ 301.1421 278.1531 4.47 47 d Bis[(2R)-2-ethylhexyl] benzene-1, 2-dicarboxylate C24 H38 O4 (M+H)+ 413.2681 390.2798 7.14 注：a. 广金钱草中的成分；b. 车前草中的成分；c. 光石韦中的成分；d. 玉米须中的成分 3.2 同位素分布验证
对于以上鉴别分析结果，在数据匹配的基础上，我们还利用峰物质特征的同位素分布进行验证。以4号峰广金钱草内酯和11号峰芸香苷为例，采用Qualitative Analysis软件的“显示预测的同位素分布”功能分别对这两种化合物的同位素峰进行匹配，其结果见图2和图3。图中结果明显可见，该两种离子理论上的同位素峰强度比、出峰位置(由方框表示)与实际测得的(由竖线峰表示)结果吻合良好，4号化合物广金钱草内酯的吻合分数为99.94，11号化合物芸香苷的吻合分数为95.28。以上结果证明鉴别分析结果准确。
3.3 同分异构体的区分
实验中我们发现复方金钱草颗粒中含有多组同分异构体，本文采用ACD/ChemSketch软件计算化合物的油水分配系数logP值判断出峰顺序。以16号峰维采宁-2与25号峰山柰酚-3-O-芸香糖苷为例，在UHPLC-Q-TOF/MS总离子流图中，提取m/z为595.1672的离子，结果见图4。
维采宁-2和山柰酚-3-O-芸香糖苷的结构式如图5所示。采用ACD/ChemSketch软件计算它们的油水分配系数logP值分别为−0.10(±0.94)和1.96(±1.45)，表明山柰酚-3-O-芸香糖苷的疏水性更强，在反相色谱柱中的保留时间则越长，确定这两个化合物的出峰顺序维采宁-2在前，山柰酚-3-O-芸香糖苷在后，从而对异构体的色谱峰进行相应归属。
我们还用此方法对同一分子式的一组多个同分异构体进行logP值的排序，以确定这些成分的出峰顺序来进行归属。例如在总离子流图中，第21、22、28、30号峰为一组同分异构体，分别为车前黄酮苷、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、异荭草素和三叶豆苷，其结构式如图6所示。在UHPLC-Q-TOF/MS总离子流图中，提取m/z为449.1089的离子，结果见图7。对它们的油水分配系数logP值进行排序，可知该4种同分异构体的出峰顺序，结果如表3所示。
表 3 同分异构体（21、22、28和30号峰）的归属结果出峰编号 化合物名称 logP值 保留时间(t/min) 21 车前黄酮苷 −0.30±0.64 11.320 22 木犀草素-7-O-葡萄糖苷 −0.09±0.64 11.675 28 异荭草素 1.58±0.88 13.999 30 三叶豆苷 1.95±1.43 14.355 4. 讨论
本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS技术，实现了对中成药复方金钱草颗粒中多成分的快速定性分析，共鉴定出2个苯乙醇苷类、1个低聚糖类、8个酚酸类、27个黄酮类、1个生物碱类、5个萜类、1个脂肪酸类、2个酯类成分（共47个活性成分），该技术为中药复方多成分分析提供了一种有效、可靠的方法，也同样适用于其他中药复方复杂体系的化学成分分析。
由于中药复方化学成分较单味药材更多更复杂，因而同分异构体的情况非常普遍。使用的四极杆复合飞行时间质谱（Q-TOF）在保持了较高的检测灵敏度以及质量准确性的前提下，可以对样本中所有的成分的质荷比进行全谱采集。这种技术使数据采集效率有了极大的提高，更加适用于中药重要复杂体系化学成分的鉴定。
虽然本研究基于复方金钱草颗粒化学成分数据库，利用精确分子量匹配和碎片离子归属策略并辅以软件计算的方法鉴定出了多个化学成分，但仍有大量的同分异构体无法被有效地区分开来，因此，在下一步实验中，使用标准品对照的方法进行更精确地鉴定。
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图 1 血小板特异性Metrnl敲除小鼠构建策略、培育流程及基因型鉴定
A. Pf4-Cre酶特异性切除巨核细胞及血小板谱系Metrnl同向LoxP位点间的序列，棕色框为等位基因编码区，红色框为非编码区； B. Plt-Metrnl-/-小鼠培育繁殖流程；C. 母代小鼠及DNA电泳条带图；D. 二代小鼠培育流程及DNA电泳条带代表图；E. Plt-Metrnl-/-小鼠培育流程及DNA电泳条带代表图
图 4 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠各血细胞及各组织的Metrnl蛋白表达情况（
$\bar x $ +s, n=3）A.心脏组织；B.肝组织；C.脾组织；D.肺组织；E.肾组织；F.脑组织；G.结肠组织；H.外周血白细胞；I.外周血红细胞
图 5 Metrnlloxp/loxp/Pf4-Cre+（Plt-Metrnl-/-）小鼠扩大繁殖流程和子代鼠一般繁殖情况
A. Plt-Metrnl-/-小鼠扩大繁殖流程；B.子代鼠性别比例；C.子代鼠基因型比例
表 1 PCR扩增实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5’→3’） 下游引物（5’→3’） Metrnl loxp TGAGGGTTGGAGGCTCCTAGC GGATGAGCGTTTGAGCACAGC Pf4-Cre CCAAGTCCTACTGTTTCTCACTC TGCACAGTCAGCAGGTT 内参基因 CAAATGTTGCTTGTCTGGTG GTCAGTCGAGTGCACAGTTT 
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表 2 实时荧光定量PCR实验中的引物序列
基因名称 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′） Mouse Metrnl CTGGAGCAGGGAGGCTTATTT GGACAACAAAGTCACTGGTACAG Mouse Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG
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表 3 Plt-Metrnl-/-小鼠及对照WT小鼠血常规指标对比（n=6）
血常规检验项目 WT Plt-Metrnl-/- 白细胞计数（109/L） 2.10±0.50 2.25±0.30 淋巴细胞计数（109/L） 1.28±0.20 1.52±0.20 淋巴细胞比率（%） 63±3 68±3 嗜酸性粒细胞计数（109/L） 0.10±0.05 0.05±0.02 嗜酸性粒细胞比率（%） 3.0±1.8 1.0±0.3 其他细胞计数（109/L） 0.72±0.20 0.68±0.10 其他细胞比率（%） 34.0±3.3 31±3 红细胞计数（1012/L） 8.49±0.40 7.83±0.40 血红蛋白（g/L） 122.0±5.5 113.0±4.6 红细胞压积（%） 42±2 37±2 平均红细胞体积（fL） 49.1±0.8 47.7±0.9 平均血红蛋白含量（pg） 14.30±0.08 14.5±0.1 平均血红蛋白浓度（g/L） 292±5 304.0±7.7 红细胞分布宽度-SD（fL） 27.6±0.4 26.2±0.6 红细胞分布宽度-CV（%） 13.2±0.4 12.4±0.3 血小板计数（109/L） 1121 ±581049 ±132血小板平均宽度（fL） 6.7±0.4 6.1±0.1 平均血小板体积（fL） 6.20±0.26 5.80±0.08 大型血小板比率（%） 1.9±1.0 3.5±0.3
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