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中药知母（Anemarrhenae rhizoma）为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎，始载于《神农本草经》，具有清热泻火，肺热燥咳，滋阴润燥以及肠燥便秘等作用[1]。知母根茎中含有甾体皂苷类、黄酮类、双苯吡酮类、木质素类、多糖类和生物碱类等多种成分，甾体皂苷类是其首要药理活性成分。其中新芒果苷、芒果苷等黄酮苷类单体成分具有降低血糖的作用，知母皂苷BⅡ以及知母皂苷AⅢ等甾体皂苷类单体成分具有改善学习记忆、抗老年痴呆的作用[2]。
《中国药典》（2020年版）将芒果苷和知母皂苷BⅡ作为知母的质量评价指标[3]，目前知母中芒果苷和新芒果苷的含量测定方法多采用高效液相-紫外检测法，而知母中另外一类重要的活性成分甾体皂苷类，由于不存在共轭结构、缺少紫外吸收，需通过衍生化技术将其转化成有紫外特征吸收的物质；但这种操作复杂、耗时，且准确度受衍生物稳定性的影响较大[4-5]，因此紫外检测器并不适用于甾体皂苷类物质的检测。相比于紫外检测器，蒸发光散射检测器（ELSD）不要求化合物带有发色团或荧光基团，能够测定没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品；而且可以在多溶剂梯度的情况下获得稳定的基线和较高的分辨率。目前，已有应用HPLC-ELSD法对知母药材中单种成分或多成分含量测定的报道[6-7]，但是所建立的方法往往分析时间较长，消耗试剂较多。
本文建立了一种快速、简便、准确的HPLC-ELSD方法，可同时测定知母中3个黄酮类成分（新芒果苷、芒果苷、宝藿苷Ⅰ）和2个甾体皂苷类成分（知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ）的含量，可为知母药材质量控制提供参考依据。
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高效液相色谱仪（1260 InfinityⅡ Prime LC, 美国安捷伦公司）；蒸发光散射检测器（G4260B，美国安捷伦公司）；分析天平（XS205，梅特勒-托利多国际公司）、涡旋混合器（SCILOGEX MX-S，美国Scilogex公司）、超声波清洗器（2300TH型，上海安谱实验科技股份有限公司）。
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新芒果苷对照品（批号：3671）、芒果苷对照品（批号：5586）、知母皂苷BⅡ对照品（批号：1369）、宝藿苷Ⅰ对照品（批号：1869）、知母皂苷AⅢ对照品（批号：3892）购自上海诗丹德标准技术服务有限公司；知母药材由上海市食品药品检验所中药室赠予；色谱纯乙腈（北京迪科马科技有限公司）；色谱纯异丙醇（上海安谱实验科技股份有限公司）；分析纯乙醇和乙酸（国药集团化学试剂有限公司）。
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精密称取芒果苷、新芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ和知母皂苷AⅢ 对照品适量，置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液适量，超声溶解后，加入50%乙醇稀释并定容得到混合溶液，精密量取1 ml该混合溶液置于5 ml容量瓶中，加50%乙醇溶液定容，最终得含芒果苷464 μg/ml，新芒果苷482 μg/ml，知母皂苷BⅡ 1084 μg/ml，宝藿苷Ⅰ 106 μg/ml，知母皂苷AⅢ 200 μg/ml的混合对照品储备液，摇匀备用。
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取知母药材适量，干燥后粉碎，过3号筛得知母药材粉末。取药材粉末0.5 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入50%乙醇50 ml，称重，超声（功率300 W，60 Hz）处理30 min。超声结束后放置至室温后再次称定质量，使用50%乙醇补足所减失的质量，摇匀后滤过。取续滤液过0.22 μm微孔滤膜，作为供试品溶液。
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色谱柱为Agilent poroshell 120 EC-C18柱（2.1×100 mm，2.7 μm）；流动相为乙腈(A)-0.2%醋酸水(B)；梯度洗脱程序设定为0～3 min，4%～10%A；3～5 min，10%A；5～7 min，20%A；7～11 min，20%～25%A；11～14 min，25%～90%A；14～18 min，90%A；18～19 min，90%～4%A；19～20 min，90%～4%A。柱温为30 ℃；流速为0.7 ml/min。蒸发光散射器的参数设定雾化气温度为40 ℃；漂移管温度为90 ℃；氮气体积流量为2.0 ml/min。供试品进样量为20 μl。混合对照品和供试品色谱图见图1，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ 的保留时间分别为4.05、5.49、11.63、13.85、14.38 min，各成分之间分离度均>1.5。
图 1 知母混合对照品(A)和样品(B)的HPLC-ELSD色谱图
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精密量取1.6 ml混合对照品储备液和0. 4 ml 50%乙醇溶液，涡旋30 s混匀，后使用50%乙醇依次对半稀释。按上述色谱条件进行测定，以峰面积（A）的对数值与进样浓度（C）的对数值进行线性回归，考察结果见表1，表明知母中各成分在相应的浓度范围内均呈现良好的线性关系。
表 1 知母中5种成分线性回归方程和线性范围
成分 回归方程 线性范围(μg/ml) r 新芒果苷 lgA=1.8601×lgC−1.6874 24.1～386 0.9993 芒果苷 lgA=1.8445×lgC−1.3955 23.2～371 0.9986 知母皂苷BⅡ lgA=1.43×lgC−0.184 54.2～867.2 0.9956 宝藿苷Ⅰ lgA=1.4974×lgC+0.3364 5.3～84.8 0.9968 知母皂苷AⅢ lgA=1.4808×lgC+0.2387 10～160 0.9989 -
精密吸取混合对照品20 μl，按上述色谱条件连续进样6次，计算5种成分峰面积的RSD值，结果显示，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的RSD分别为1.3%、1.0%、0.9%、1.5%、1.0%、1.4%，表明仪器精密度良好。
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称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，平行称取6份，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%，RSD分别为1.8%、1.8%、1.4%、2.2%、2.4%，显示方法重复性良好。
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称取知母药材粉末0.5 g，按上述操作制备供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12 h进样测定，结果显示新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的峰面积RSD分别为：2.3%、1.3%、0.9%、3.1%、1.8%，说明样品在12 h内稳定。
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称取知母药材粉末0.25 g，精密称定，平行称取6份，分别加入与知母药材粉末各成分含量相近的混合对照品溶液，按上述操作制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表2，知母中5种成分的平均回收率为101.8%～105.0%，表明该方法准确度良好。
表 2 知母中5种成分加样回收率试验结果（n=6）
成分 原有量
（m/mg）加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）新芒果苷 4.06 4.80 9.01 103.2 101.8 1.5 4.11 4.80 8.99 101.9 4.19 4.80 9.07 101.8 3.99 4.80 8.87 101.8 4.07 4.80 9.04 103.5 4.09 4.80 8.83 98.69 芒果苷 2.08 2.13 4.26 102.8 102.2 2.5 2.10 2.13 4.20 98.73 2.14 2.13 4.39 105.3 2.04 2.13 4.27 10.0 2.08 2.13 4.19 99.07 2.09 2.13 4.28 102.7 知母皂苷BⅡ 18.45 10.80 29.88 105.77 104.91 1.28 18.65 10.8 29.93 104.5 19.04 10.80 30.59 107.0 18.14 10.80 29.55 105.6 18.50 10.80 29.65 103.2 18.59 10.80 29.75 103.4 宝藿苷Ⅰ 0.17 0.21 0.39 103.4 102.0 1.8 0.17 0.21 0.39 102.2 0.18 0.21 0.39 102.6 0.17 0.21 0.39 100.9 0.17 0.21 0.39 98.57 0.17 0.21 0.39 104.1 知母皂苷AⅢ 0.87 1.17 2.07 103.4 103.2 1.0 0.88 1.17 2.07 102.7 0.90 1.17 2.08 101.7 0.86 1.17 2.05 102.5 0.87 1.17 2.08 104.3 0.88 1.17 2.09 104.7 -
称取知母药材粉末0.5 g，精密称定，按上述操作进样测定，计算各成分含量，最终计算得新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ、知母皂苷AⅢ的平均含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。
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本研究首先采用乙腈-水作为流动相，结果发现新芒果苷、芒果苷峰形不佳，色谱峰出现分叉现象。考虑到该两种物质呈弱酸性，故采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为流动相以抑制其解离，结果显示其分叉现象消失，各峰之间的分离度良好，且基线平稳，因此最终采用乙腈-0.2%醋酸水溶液作为最终流动相系统。结果如图2所示。
图 2 不同流动相系统对新芒果苷（1）和芒果苷（2）的影响
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流动相流出色谱柱后在载气压力的作用下与雾化气体（氮气）在雾化室内混合形成细小的液滴（气溶胶），气体流量越低，形成的液滴越大，散射光越多，分析灵敏度增加，反之越小。但是较低的气体流量会造成溶剂难以蒸发，因此本研究考察了氮气流速分别为1.5、2.0、2.5 L/min时各待测物质的响应值，结果显示，当氮气流速为2.0 L/min 时待测物质响应值最大，信号噪音比率最大，适合分析。
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漂移管温度的设置主要取决于流动相的构成、样品的挥发性以及流动相的流速。一般来讲，对于有机溶剂含量比例高、流速低的流动相，其要求的漂移管温度也低。本研究使用含新芒果苷386 μg/ml、芒果苷371 μg/ml、知母皂苷BⅡ 867.2 μg/ml、宝藿苷Ⅰ 84.8 μg/ml、知母皂苷AⅢ 160 μg/ml的混合对照品溶液，考察了漂移管温度分别为80、90、100 ℃时各待测物质的响应值，结果表明当漂移管温度为90 ℃时各物质峰面积响应值均较大，信号噪音比率最大，适合分析，因此最终漂移管温度采用90 ℃。结果如图3所示。
图 3 漂移管温度对待测物质响应值的影响
本研究建立了一种同时测定知母药材中包括芒果苷、知母皂苷BⅡ在内的5种活性成分含量的HPLC-ELSD方法。该法快速、简便、准确度高，可为知母的质量评价和质量标准的提升提供科学依据，为知母有效成分的体内动态变化研究提供测定方法。
Simultaneous determination of five components in Anemarrhenae Rhizoma by HPLC-ELSD
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摘要:
目的 采用高效液相色谱-蒸发光散射检测方法（HPLC-ELSD）建立同时测定知母药材中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、宝藿苷Ⅰ及知母皂苷AⅢ的含量测定方法。 方法 采用Agilent poroshell 120 EC-C18柱，流动相采用乙腈-0.2%醋酸水系统，梯度洗脱；柱温为30 ℃，流速为0.7 ml/min；蒸发光散射检测器以氮气为雾化气，雾化气温度为40 ℃，漂移管温度为90 ℃，氮气体积流量为2.0 L/min；进样量为20 μl。 结果 5种成分均能达到基线分离，新芒果苷24.1～386 μg/ml（r=0.999 3）、芒果苷23.2～371 μg/ml（r=0.998 6）、知母皂苷BⅡ 54.2～867.2 μg/ml（r=0.995 6）、宝藿苷Ⅰ 5.3～84.8 μg/ml（r=0.996 8）、知母皂苷AⅢ 10～160 μg/ml（r=0.998 9）的浓度范围内呈现良好的线性关系。5种成分的平均加样回收率在101.8%～105.0%之间，重复性RSD小于2.4%，知母药材中上述5种成分含量分别为1.62%、0.82%、7.36%、0.07%、0.34%。 结论 该方法操作简便、准确、灵敏度高，可用于知母药材的多指标成分定量测定。 -
关键词:
- 高效液相色谱-蒸发光散射检测法 /
- 知母 /
- 含量测定
Abstract:Objective To establish a method for the simultaneous determination of new mangiferin, mangiferin, artemisinin BⅡ, icariin and artemisinin A in Anemarrhenae Rhizoma by high performance liquid chromatography-evaporation light scattering detector (HPLC-ELSD). Methods The column was Agilent Poroshell 120 EC-C18. The mobile phase used acetonitrile-0.2% acetic acid water system with gradient elution. Column temperature was 30 ℃. Flow rate was 0.7 ml/min. Evaporative light scattering detector used nitrogen as atomizing gas. The atomizing gas temperature was 40 ℃ and the drift tube temperature was 90 ℃. The nitrogen volume flow rate was 2.00 L/min and the sample volume was 20 μl. Results The five components were able to achieve baseline separation. Neomangiferin, Mangiferin, Anemaponin BⅡ, Baohuoside I , Anemarrhena saponin AⅢwere determined as 24.1-386 μg/ml (r=0.999 3), 23.2-371 μg/ml (r=0.998 6), 54.2-867.2 μg/ml(r=0.995 6), 5.3-84.8 μg/ml (r=0.996 8), 10-160 μg/ml (r=0.998 9) respectively, which showed a good linear relationship within the concentration range. The average recovery rate of the five components was between 101.8% and 105.0%, and the repeatability RSD was less than 2.4%. The content of the above five components in Zhimu medicinal materials were 1.62%, 0.82%, 7.36%, 0.07%, 0.34%, respectively. Conclusion The method is simple, accurate, and highly sensitive, which could be used as the quantitative determination of multiple index components of Anemarrhenae Rhizoma. -
多剂量滴眼液须使用抑菌剂，以防止使用过程中和货架期内微生物污染和繁殖，但是抑菌剂对眼的伤害不容忽视，多国药典及抑菌剂管理规范[1]均要求处方中抑菌剂的浓度必须在有效性和安全性方面得到合理性支持，保证抑菌剂浓度最低但又能发挥抑菌作用，并规定滴眼液标签必须注明抑菌剂种类和标示量，且实际含量应在标示量的±20%以内。《中国药典》2020版收载了45个滴眼剂品种，只有12个列入抑菌剂检查项，仅占26.7%[2-4]。目前市售滴眼液标签多数未按照《中国药典》2020版四部通则0105眼用制剂[5]要求标明抑菌剂种类和标示量，滴眼液中抑菌剂的使用和质量安全控制缺乏有效监管。
目前滴眼液允许使用的抑菌剂主要有六大类：羟苯酯类、季铵盐类、有机酸类、醇类、酚类和有机汞类,如硫柳汞。硫柳汞在滴眼剂、滴鼻剂、疫苗、化妆品中广泛使用，然而，汞对人体具有潜在的危害，摄入过量的汞可造成神经系统、肾脏、皮肤的损伤。滴眼剂中抑菌剂浓度过高会对眼上皮细胞产生损伤，有研究者在对药源性角膜上皮病变病例研究时发现，有患者使用防腐剂为硫柳汞的滴眼剂后引起了明显的点状角膜上皮损害[6-8]。《中国药典》2020年版三部通则
3115 “含量测定法”中收载硫柳汞测定方法[4]，采用滴定法和原子吸收分光光度法，二部[3]各论阿昔洛韦滴眼剂项下采用高效液相色谱方法，另外文献资料收载的测定法主要有:原子荧光光谱分析法、冷原子吸收光谱法、硫氰酸铵滴定法、二硫腙滴定法、二硫腙比色法等[9-12]，这些方法的共同点是有机汞首先被消解成无机汞，然后测定无机汞的含量。上述方法操作步骤繁琐，专属性不强，不适用于复杂药物制剂中痕量加入的有机汞防腐剂快速准确检测。为此，本研究建立了一种通用型HPLC法用于测定滴眼液中抑菌剂硫枊汞的含量。1. 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪；美国赛多利斯MSE225S型电子天平。硫柳汞（含量97.0%，批号T1605112，Aladdin公司）；醋酸苯汞（纯度:97.0%，批号P27127，Sigma公司）。甲醇、三乙胺为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。
以收集到的4个制药企业（A、B、C|、D）生产的6批滴眼液为供试品，处方中硫柳汞含量均不同（企业A双氯芬酸钠滴眼液批号150301、150802、160801；企业B阿昔洛韦滴眼液批号16090401；企业C盐酸林可霉素滴眼液批号160501；企业D苄达赖氨酸滴眼液批号3160703）。
2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱资生堂MGII-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以1%三乙胺溶液（磷酸调节pH值至3.0）为流动相A，以甲醇为流动相B；按表1进行梯度洗脱；柱温为40 ℃；检测波长为222 nm；流速为1 ml/min；进样体积20 µl。
表 1 梯度洗脱程序时间（min） 流动相A（%） 流动相B（%） 0 50 50 2 50 50 17 10 90 20 10 90 20.1 50 50 27 50 50 2.2 溶液制备
2.2.1 系统适用性考察溶液配制
精密称取硫柳汞对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；另取硝酸苯汞对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；取上述两种液体等量混合，即得。
2.2.2 对照品溶液制备
取硫柳汞对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释成0.2 mg/ml的溶液作为对照品储备液；精密量取储备液适量，加水分别稀释制成20 μg/ml溶液（或根据供试品硫柳汞含量不同制备成其他相同浓度的对照品），作为对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液制备
取滴眼液直接进样。
2.3 方法学考察
2.3.1 专属性试验
精密量取“2.2.1”项下系统适用性考察溶液、对照品溶液、供试品溶液（含硫柳汞）、滴眼液（不含硫柳汞）各20 μl，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，见图1。硫柳汞对照品溶液和硝酸苯汞对照品溶液混合后生成1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐，以及其他产物，色谱图应存在4个色谱峰分别为：主峰硫柳汞、1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐、硝酸苯汞以及一个杂质或其他反应产物，配制该溶液主要是考察专属性，筛选色谱柱和考察色谱系统的改变对分离的影响。图1A表明系统适用性考察用混合溶液各色谱峰之间均完全分离，系统适用性良好。图1D表明不含硫柳汞的滴眼液在硫柳汞峰处无色谱峰，不影响测定，可对未知抑菌剂的滴眼剂是否含有硫柳汞进行筛查。
图 1 专属性试验HPLC色谱图A．系统适用性色谱图；B.对照品色谱图；C.含硫柳汞供试品色谱图；D.不含硫柳汞的滴眼液色谱图；1．硫柳汞；2. 1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐；3.杂质或其他反应产物；4.硝酸苯汞2.3.2 线性关系考察
取硫柳汞对照品适量，精密称定，用水稀释成每1 ml约含硫柳汞4、10、20、60、80和200 μg的溶液，按“2.1”项下色谱条件试验。以对照品的质量浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。硫柳汞回归方程为Y=
54413 X–77901 ，r=1.0，结果表明：硫柳汞在4.3～216.7 µg/ml范围内有良好的线性关系。精密量取线性对照品最低浓度约4.3 μg/ml的溶液，测得信噪比接近10∶1，将其作为定量限溶液，即定量限为4.3 μg/ml。2.3.3 精密度试验
精密量取“2.2.2”项下20 μg/ml硫柳汞对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果硫柳汞峰面积的RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。
2.3.4 稳定性试验
由于供试品溶液取原液没有制备过程，因此稳定性试验取对照品溶液进行，按“2.2.2”方法制备对照品溶液（23.2 μg/ml），取对照品溶液避光室温放置10 h，分别于1、3、5、7、9、10 h，取样分析，记录色谱图，比较硫柳汞峰面积变化情况，峰面积RSD为0.7%，显示稳定性较好。对照品溶液放置过夜后再次测定，峰面积有较明显降低，显示硫柳汞水溶液配制10小时内使用较好。
2.3.5 重复性试验
取三个企业A、B、C三批样品（批号分别为160801、16090401、160501）原液做为供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件直接进样分析，平行测定6份，按外标法以峰面积计算硫柳汞的含量，考察方法重复性。结果RSD分别为0.7%、0.2%和3.4%，表明重复性良好。
2.3.6 中间精密度试验
在不同的日期换用不同的液相色谱仪和实验操作者，重复“2.3.5重复性试验”的操作，按“2.1”项下色谱条件连续进样，平行测定6份，作为中间精密度，合并重复性试验的6份测定结果考察方法中间精密度，12份结果硫柳汞含量RSD分别为0.5%、0.7%和2.7%。参考《中国药典》2020年版四部[5]指导原则9101“分析方法验证指导原则”，重复性试验精密度要求，含量为0.01%，RSD应小于4%，上述含量最大为0.015%，RSD均小于3%，表明中间精密度良好。
2.3.7 加样回收率试验
2.3.7.1 空白辅料溶液制备
按B企业阿昔洛韦滴眼液处方（抑菌剂为硫柳汞，标示量为20 μg.ml−1）制备，取甲基纤维素、氯化钠、无水磷酸氢二钠适量，加水稀释至
1000 ml，放置过夜，即得。2.3.7.2 对照品溶液制备
精密称取硫柳汞对照品（纯度97.0%）21.77 mg，置100 ml量瓶中，加水适量，振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
2.3.7.3 供试品溶液（自制滴眼液）配制
精密量取对照品储备液2、5、3、5 ml，分别置25、50、25、25 ml量瓶中，加空白辅料溶液稀释至刻度，摇匀，即得80%、100%、120%、200%回收率供试品溶液（每浓度平行配制3份）。按“2.1”项下色谱条件进样20 μl，按外标法计算回收率，硫柳汞的回收率为98.3%～106.2%，平均回收率为102.1%，RSD为2.7%，结果见表3。
表 2 硫柳汞回收率试验结果阿昔洛韦
滴眼液投入量
（μg/ml）测得量
（μg/ml）回收率
（%）平均回
收率（%）RSD% 80%供试品 16.89 16.84 99.69% 102.1 2.7 16.73 99.08% 16.60 98.27% 100%供试品 21.12 21.41 101.39% 21.26 100.68% 21.08 99.81% 120%供试品 25.34 25.98 102.54% 25.99 102.56% 26.09 102.97% 200%供试品 42.23 44.74 105.94% 44.86 106.22% 44.59 105.58% 2.3.8 耐用性试验
取“2.2.1”项系统适用性考察溶液和批号为
150301 滴眼液样品，考察方法耐用性。结果表明，在不同的柱温（30、35、40 ℃）、流速（0.9、1.0、1.1 ml·ml−1）、流动相A的pH值（2.8、3.0、3.2、3.5）、流动相组成（初始有机相B比例40%、45%、50%、55%、60%）和不同色谱柱（资生堂公司MGII、Waters Sunfire、Phenomenex Luna）条件下测定系统适用性考察溶液，硫柳汞与各峰分离度好，样品150301 批硫柳汞含量测定结果RSD为2.8%，所建立的方法耐用性良好。2.4 样品测定
取4个制药企业6批含抑菌剂为硫柳汞的样品，以样品原液做为供试品溶液（n=2）。
对照品溶液制备：针对已知抑菌剂为硫柳汞且已知浓度的样品，取硫柳汞对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成与供试品溶液中硫柳汞浓度相当的溶液；针对未知抑菌剂种类和浓度的滴眼剂筛查硫柳汞的含量，对照品溶液浓度可采用20 μg/ml或40 μg/ml（避光保存，10 h内使用）。
按“2.1”项下色谱条件进样分析，用外标法计算硫柳汞的含量（n=2），结果见表4。
表 3 样品测定结果序号 生产
企业品种名称 样品批号 标示量
（μg/ml）含量
（μg/ml）1 企业A 双氯芬酸钠滴眼液 150301 40 36.11 2 企业A 双氯芬酸钠滴眼液 150802 40 37.87 3 企业A 双氯芬酸钠滴眼液 160801 40 38.41 4 企业B 阿昔洛韦滴眼液 16090401 20 18.19 5 企业C 盐酸林可霉素滴眼液 160501 200 151.74 6 企业D 苄达赖氨酸滴眼液 3160703 30 26.30 3. 结果与讨论
3.1 检测波长的选择
USP收载的硫柳汞钠测定方法中，测定波长为222 nm[12]，《中国药典》2020年版二部[3]各论阿昔洛韦滴眼液项下硫柳汞钠测定波长为262 nm。本文采用PDA检测器扫描，显示222 nm吸收强度大于262 nm，并且这两个波长处峰对称性以及与相邻杂质的分离情况一致，因此，测定波长选择为222 nm。
3.2 方法的适用性
本课题研究方法作为可以检测多种滴眼剂中抑菌剂硫柳汞含量的通用方法，需要具备普遍适用性。本课题专属性研究工作还包括将收集到的42种滴眼剂（不含抑菌剂硫柳汞，分别含羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯扎溴铵、苯扎氯铵、三氯叔丁醇等）进样分析，考察是否在硫柳汞保留时间有出峰情况，同时回收试验将企业提供的十四种未加抑菌剂滴眼液进样分析，包含滴眼液常用的附加剂，均无干扰，方法专属性较好。
本课题研究方法拟用于各种不同活性成分的滴眼液中硫柳汞的测定，为了考察色谱条件变化对目标峰特性、分离度的影响，采用硫柳汞与硝酸苯汞混合液作为系统适用性考察溶液，硫柳汞与硝酸苯汞均在pH3.0～pH3.5、甲醇比例50%以上出峰较好，色谱峰对称性优于乙腈，因此采用pH3.0的甲醇系统作为流动相。。
3.3 样品测定结果的讨论
本次收集的6批样品，硫柳汞含量测定结果经药检机构复核基本一致。其中只有B企业1批阿昔洛韦滴眼液（批号16090401）在《中国药典》2020年版二部有硫柳汞含量测定方法，其他5批样品质量标准中均无抑菌剂含量测定方法，对批号为16090401的样品用所建立的方法与药典方法进行了比较，结果一致。根据样品测定结果，滴眼液中硫柳汞含量普遍低于处方标示量，并且测定结果显示随储存时间长含量下降多，尤其是企业C批号为160501的滴眼剂，硫柳汞标示量为200 μg/ml，实际测定结果低于标示量的80%，为151.74 μg/ml。经分析可能是由于硫柳汞不稳定，易在贮存过程中降解或见光分解[13]，另外有文献报道“硫柳汞作防腐剂时易与塑料瓶有反应，故用塑料瓶包装的滴眼剂不宜添加该防腐剂”[14]，这也可能是硫枊汞实测量低于标示量的原因之一。本文样品测定中6批样品均采用低密度聚乙烯瓶包装，贮存时间过长，硫柳汞可能与药包材反应造成含量下降。故建议生产企业注意滴眼液的贮存条件，另外对产品的包装材料进行相容性研究，从而避免不适用药品包装材料对产品质量的影响。
3.4 方法评价
本文建立的滴眼剂中抑菌剂硫柳汞的HPLC含量测定方法既可以对已知抑菌剂为硫柳汞和已知浓度的样品进行定量分析，亦可对未知抑菌剂种类和浓度的滴眼剂进行硫柳汞添加监督筛查及含量测定，具有准确性好、线性范围广、耐用性强、普适性高的特点，所建立方法可作为滴眼剂中抑菌剂硫柳汞含量测定通用检测方法，为抑菌剂合理使用、质量控制和安全评价提供参考。
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表 1 知母中5种成分线性回归方程和线性范围
成分 回归方程 线性范围(μg/ml) r 新芒果苷 lgA=1.8601×lgC−1.6874 24.1～386 0.9993 芒果苷 lgA=1.8445×lgC−1.3955 23.2～371 0.9986 知母皂苷BⅡ lgA=1.43×lgC−0.184 54.2～867.2 0.9956 宝藿苷Ⅰ lgA=1.4974×lgC+0.3364 5.3～84.8 0.9968 知母皂苷AⅢ lgA=1.4808×lgC+0.2387 10～160 0.9989 
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表 2 知母中5种成分加样回收率试验结果（n=6）
成分 原有量
（m/mg）加入量
（m/mg）测得量
（m/mg）回收率
（%）平均回收率
（%）RSD
（%）新芒果苷 4.06 4.80 9.01 103.2 101.8 1.5 4.11 4.80 8.99 101.9 4.19 4.80 9.07 101.8 3.99 4.80 8.87 101.8 4.07 4.80 9.04 103.5 4.09 4.80 8.83 98.69 芒果苷 2.08 2.13 4.26 102.8 102.2 2.5 2.10 2.13 4.20 98.73 2.14 2.13 4.39 105.3 2.04 2.13 4.27 10.0 2.08 2.13 4.19 99.07 2.09 2.13 4.28 102.7 知母皂苷BⅡ 18.45 10.80 29.88 105.77 104.91 1.28 18.65 10.8 29.93 104.5 19.04 10.80 30.59 107.0 18.14 10.80 29.55 105.6 18.50 10.80 29.65 103.2 18.59 10.80 29.75 103.4 宝藿苷Ⅰ 0.17 0.21 0.39 103.4 102.0 1.8 0.17 0.21 0.39 102.2 0.18 0.21 0.39 102.6 0.17 0.21 0.39 100.9 0.17 0.21 0.39 98.57 0.17 0.21 0.39 104.1 知母皂苷AⅢ 0.87 1.17 2.07 103.4 103.2 1.0 0.88 1.17 2.07 102.7 0.90 1.17 2.08 101.7 0.86 1.17 2.05 102.5 0.87 1.17 2.08 104.3 0.88 1.17 2.09 104.7
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