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人体表面及内部生活着数量巨大、种类多样的微生物，其中绝大部分是由细菌菌群组成的。肠道微生物和中枢神经系统之间存在相互作用，肠道微生物的异常可以通过“菌-肠-脑”轴参与到机体认知和社会行为等的复杂调控中，且已有多项研究发现肠道菌失调与抑郁症的发生密切相关[1]，会通过多种不同的方式和途径加速或诱导抑郁症的发生。口服药物治疗是目前常用的方式，可在一定程度上减缓病人症状，但是目前部分抗抑郁药物仍具有一定的局限性[2]。现已有研究发现，益生菌可以通过多重机制来控制抑郁样行为[3]，这为我们探索抗抑郁药物的研发提供了一个新的方向。本综述将从抑郁症、肠道菌代谢产物、作用分子水平出发探讨抑郁症的机制，在对现有益生菌生物制剂治疗抑郁症的研究发现的基础上，对肠道菌这一新靶点进行展望，为寻找抗抑郁药物研发的方向提供帮助。
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目前抑郁症确切的病理生理机制仍不清楚，多集中在单胺神经递质紊乱、肾上腺轴功能障碍、缺乏神经营养因子和促炎细胞因子过度等方面，随着肠道菌在抑郁症中的调控机制逐渐被揭示，肠道菌对相关致抑郁小分子的作用也逐渐被证实。
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据报道,细胞炎性因子在正常大脑以及大脑发育过程中十分重要，促炎因子可以直接或通过强效激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）来诱导或加速抑郁症的发病[4]。HPA轴功能异常是抑郁病理生理机制的重要组成部分之一。目前有关抑郁症发病机制中作用的促炎性细胞因子有TNF-α、IL-1和IL-6 等，另外新的分子和机制也逐渐被发现。动物研究发现，动物在注入促炎性细胞因子后出现了一系列与抑郁症表现非常相似的行为学变化[5]。
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脑源性神经营养因子假说是抑郁症发病机制假说之一, BDNF是神经生长的重要调节因子, 当BDNF水平受到影响减少时会对抑郁症的发生起到促进作用[6]，有研究表明BDNF可以参与神经突触可塑性调控，与情绪障碍有很大的联系。
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神经递质是神经细胞交流的信使, 在个体心理和行为中发挥着重要作用, 抑郁症与神经递质异常有直接关系[7]。抑郁症假说之一表明抑郁是由于脑内单胺类神经递质缺乏引起的，另外有研究发现，其他的神经递质也有可能对抑郁症产生影响[8]。
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HPA轴是指下丘脑-垂体-肾上腺轴，糖皮质激素就是这条轴上的介质之一。研究发现糖皮质激素对维持机体正常生理状态十分重要，参与中枢神经系统的调节，可对抑郁的产生起到重要影响[9]。HPA轴的异常是导致神经行为异常的原因之一。
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某些针对抑郁患者或抑郁大鼠的研究发现，正常与抑郁状态下其肠道菌群的丰度存在显著差异，即抑郁状态会导致肠道菌丰度的改变[10-15]，大多导致拟杆菌门丰度增高而厚壁菌门丰度降低[10-13]。反之，肠道菌的紊乱对抑郁症的发生起到诱导或加速作用这一点也在多项研究中得到肯定[16]。
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在门水平上，Liu 等[10]通过对抑郁症患者和健康者进行比对发现两种状态下的肠道群的显著不同，拟杆菌门 Bacteroidetes增高，而厚壁菌门 Firmicutes 降低。除此之外，Chen 等[11]的实验也发现，抑郁症患者肠道菌在拟杆菌门Bacteroidetes、变形菌门 Proteobacteria 、厚壁菌门Firmicutes、放线菌门 Actinobacteria 这4个门中存在显著差异。
在正常与抑郁模型大鼠肠道菌中，差异同样显著存在。Yu 等[12]的实验研究表明了这一点，他们用16S rRNA基因测序法，对由慢性多变压力刺激建立的抑郁大鼠模型进行基因测定，发现与正常大鼠相比，抑郁大鼠模型肠道中厚壁菌门Firmicutes含量是减少的，而拟杆菌门Bacteroidetes含量是增多的。同样证实这一点的还有刘佳琳[13]，她通过对慢性不可预知温和应激实验所造的抑郁模型大鼠进行的实验，发现与正常大鼠相比，抑郁模型大鼠盲肠内容物中拟杆菌门Bacteroidetes和变形菌门Proteobacteria相对丰度升高，厚壁菌门Firmicutes的相对丰度降低。
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在科、属水平上，Jiang等[14]采用测定16S RNA这一细菌身份证片段基因的方法测定 30 例抑郁症患者肠道微生物的变化，发现氨基酸球菌属Acidaminococcus在抑郁症患者中表达上调。而荣晗等 [15]通过选取30岁以上的复发性抑郁症患者做肠道菌群丰度和种类及基因功能测定研究，也证实了氨基酸球菌属表达上调。
在大鼠抑郁模型中，Yu 等[12]实验结果表明，抑郁状态大鼠肠道中的分节丝状菌Candidatus Arthromitu 、颤杆菌克属 Oscillibacter 明显增加，Marvinbryantia、棒状杆菌属 Corynebacterium 、冷杆菌属 Psychrobacter、Christensenella Lactobacillus、Peptostreptococcaceae incertae se-dis、Anaerovorax、Clostridiales incertae sedis 和粪球菌属 Coprococcus 明显降低。刘佳琳[13]探究的抑郁模型大鼠显示，寡源杆菌属 Oligella 、另枝菌属 Alistipes 和脱硫弧菌属Desulfovibrio相对丰度显著增高而乳杆菌属 Lactobacillus 和罗姆布茨菌属Romboutsia 相对丰度显著降低。
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有研究显示肠道微生物可以调控HPA轴、细胞因子和单胺类神经递质等，Messaoudi等[16]将含有双歧杆菌及乳杆菌的配方物质及空白安慰剂随机分配给重度抑郁症患者口服后,通过严格的评价标准,试验组患者的精神压力、抑郁、焦虑、敌对症状评分均有显著改善，这表明通过补充益生菌可以改善抑郁行为。综合目前对抑郁症的肠道微生物多样性研究报道可以看出，拟杆菌门和厚壁菌门是抑郁症的代表微生物，拟杆菌门与抑郁症正相关，而厚壁菌门与抑郁症负相关。拟杆菌门与厚壁菌门比例的改变会导致抑郁症的发生发展。这些方面均提示肠道菌群可能与抑郁症的发病存在相关性。
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肠道菌代谢产物，如短链脂肪酸、吲哚等，被认为通过以下几种机制调节抑郁行为：对中央受体的直接作用；激活神经、免疫或内分泌途径的外周受体；组蛋白去乙酰化或DNA甲基化的表观遗传调控。通过代谢产物了解这些机制，有利于加深我们对抑郁症病因的理解，从而利用这些生物活性分子开发新策略进行有益的精神治疗。
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SCFAs是由肠道菌群厌氧发酵不可消化的碳水化合物产生，极易在大肠中被吸收。已有研究表明SCFAs参与消化、免疫和中枢系统功能，通过控制3个最丰富的SCFAs（丙酸、乙酸和丁酸盐）可以缓解小鼠的抑郁症状[17]。研究发现，抑郁症（MDD）病人体内出现了丙酸、乙酸和丁酸盐的减少[18]，而生活质量较高的人群拥有更多能够产生丁酸盐的肠道菌，如栖粪杆菌属 Faecalibacterium和粪肠球菌属 Coprococcus spp.，其中，栖粪杆菌属是肠道中最丰富的微生物属之一，对包括MDD在内的多种疾病具有重要的免疫功能和临床意义[19]。SCFAs能够结合并激活G蛋白偶联受体，使其在体内多个器官中广泛表达，推测SCFAs可能通过直接刺激神经通路或通过神经-内分泌和免疫激活的间接中枢作用来调控抑郁行为。
组蛋白去乙酰化酶活性的改变是抑郁的特征之一，例如，丁酸盐的全身给药诱导小鼠海马和额叶皮质的组蛋白乙酰化[20]以及反复注射丁酸钠通过海马组蛋白H3和H4的乙酰化介导抗抑郁作用[21]。色氨酸代谢改变是抑郁症的特征，其中，丙酸盐通过增加色氨酸羟化酶（TPH）促使色氨酸向5-羟色胺的转化[22]。
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研究表明，色氨酸经宿主（TDO和IDO）和肠道菌酶（色氨酸酶等）代谢后产生具有既定情绪调节特性的神经活性分子，包括5-HT、犬尿氨酸和吲哚。只有不到5%的色氨酸被色氨酸羟化酶沿着甲氧基吲哚途径转化为5-HT，其余95%通过犬尿氨酸途径由TDO和IDO酶代谢。色氨酸代谢紊乱（即色氨酸从5-HT转移到犬尿氨酸代谢合成）可能是典型抑郁症表现在情绪、认知和睡眠障碍的部分原因[23]。在被定植色氨酸代谢细菌的动物体内发现了色氨酸减少和海马体5-HT浓度增加，并伴有类似焦虑行为的减少[24]。
吲哚通过增加与上皮细胞结构和功能有关的基因表达来增强肠上皮屏障功能，并且通过影响孢子形成、质粒稳定性与耐药性、生物膜形成和毒力在微生物群落中发挥重要作用。另外，吲哚进一步代谢经氧化和偶联的产物——氧化吲哚和2，3-吲哚醌，同样是具有神经活性的信号分子，能够调节运动功能和情绪行为。2，3-吲哚醌是一种内源性单胺氧化酶（MAO）B抑制剂和苯二氮䓬受体拮抗剂，在小鼠和大鼠中都具有抗焦虑的特性[25]。
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其他肠道菌产生的代谢物质，如乳酸、胆汁酸、神经递质、胆碱代谢物、维生素等也会对抑郁产生一定影响。
乳酸是乳酸菌（乳酸乳球菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等）、双歧杆菌和变形杆菌在哺乳动物寄主过程中对膳食纤维发酵产生的有机酸[26]，可以被几种细菌转化为SCFAs，对整个菌池有贡献。其调节情绪行为的一个潜在机制是通过直接激活受体GPR81，在海马体、新大脑皮层和小脑表达[27]。
胆汁酸是由胆固醇衍生的类固醇酸，在肝脏合成后分泌到小肠，并在回肠吸收。胆酸（CA）和鹅去氧胆酸（CDCA）这两种主要的胆汁酸在人体和大鼠的肠道中通过肠道菌群进一步结构修饰，转化为二级和三级胆汁酸[28]。胆汁酸具有局部去污性，能够乳化亲脂分子，进而促进营养物质的消化和吸收。此外，胆汁酸可能通过破坏紧密连接的表达，导致肠和中央上皮细胞的通透性，从而导致严重的抑制[29]。有研究表明，胆汁酸的作用在一定程度上可能取决于其物理和化学性质，而这些性质又取决于微生物介导的化合物修饰[30]。另一个可能会影响胆汁酸行为结果的因素是受体介导的响应。此外，一些胆汁酸，如碎石胆酸，可刺激中枢PXR和维生素D受体（VDR），具有良好的抗抑郁作用[31]。
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如今人们面临的各方面压力越来越大，抑郁症的发病率呈明显的上升趋势，已经成为一个严重的社会和医疗问题。但它发病机制十分繁杂，在治疗上有相当大的阻力。大量关于肠道菌的基础研究已经证实了肠道微生物的结构和多样性紊乱后会诱导或者加速抑郁症的发生，无论是临床统计观察还是实验动物模型检测，都证实了这一点，改善肠道微生物的状态能预防和治疗抑郁症，这一点也同样被研究佐证。
目前已有多项实验研究发现益生菌[32]以及中药复方提取物[33]等可以通过恢复抑郁状态下紊乱的肠道微生物结构来改善抑郁状态，这一点对抑郁症的治疗产生了极大的应用价值。但是基于肠道菌而进行抑郁症疾病药物研发的探究目前仍是处于初级阶段，对于抑郁症相关性高的肠道菌进行调控，是否会与其他肠道菌群产生反应而造成反作用或毒副作用影响机体健康，对于实验结果的普遍性和有效性能否做到更广泛的临床验证，对于直接补充肠道菌代谢产物是否比直接针对肠道菌群进行改造更有效，这些都是需要考虑的，因此，对于后续存在的问题有待继续挖掘和深入探索。
Advances in antidepressant therapy related to gut microbiota
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摘要:
目的 介绍肠道菌群与抑郁症的病理机制以及相关治疗的研究进展，为后续以肠道菌为靶点的抗抑郁药物的研发提供帮助。 方法 查阅近年来肠道菌群与抑郁症方面的33篇中英文文献进行分类总结，从肠道菌群的门、科、属水平的角度探讨了抑郁状态下肠道菌群多样性的变化，从分子水平上阐述了肠道菌与抑郁症发病机制之间的关系,总结现有相关研究，进一步探索以肠道菌群为靶点进行药物研发治疗的可行性。 结果 肠道菌紊乱与抑郁症之间相互作用，现有益生菌等生物制剂可通过改善肠道菌群病理状态下的紊乱对抑郁症治疗起到缓解作用。 结论 肠道菌群失调与抑郁的发生密切相关，以肠道菌为靶点的相关药物研发治疗，可能成为治疗抑郁症的新途径。 Abstract:Objective This paper introduces the research progress on the pathogenesis of depression related to gut microbiota and provides the resources for the subsequent development of antidepressant drugs targeting gut microbiota. Methods 33 literatures on gut microbiota and depression in recent years were reviewed. The changes of gut microbiota diversity under depression were discussed from the perspectives of phylum, family and genus. The relationship between gut microbiota and the pathogenesis of depression was expounded at the molecular level, and the existing relevant studies were summarized. The feasibility of drug development targeting gut microbiota was explored. Results There is a relationship between gut microbiota disorder and depression. Existing biological agents such as probiotics can alleviate depression by adjusting the disorder of gut microbiota. Conclusion The imbalance of gut microbiota is closely related to the occurrence of depression, and the development of drugs targeting gut microbiota may become a new way to treat depression. -
Key words:
- depression /
- gut microbiota /
- microbiome-gut-brain axis
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小檗碱是从毛茛科植物根茎中提取的一种季胺类异喹啉类生物碱，又称黄连素，为中药黄连的主要成分，临床多用其盐酸盐。盐酸小檗碱（BBR）的药理作用主要为清热解毒，属于传统的消化系统用药，临床上常用作抗菌剂，用于治疗细菌性痢疾、肠胃炎等肠道感染[1-2]。盐酸小檗碱溶解度低， 渗透性差，在口服给药时，还存在药物释放快、半衰期短、生物利用度低等缺陷。对于需要达到一定血药浓度为疗效前提的疾病来说，盐酸小檗碱的传统剂型还无法达到理想的治疗效果[3]。
纳米乳（NE）是由油相、水相、表面活性剂、助表面活性剂组成的脂质纳米给药载体。粒径范围为1～100 nm，液滴呈大小均匀的球形，外观呈透明或半透明。纳米乳是一种热力学稳定的胶体分散体系，制备工艺简单，所需能量低甚至能够自发形成。纳米乳处方中油相和表面活性剂、助表面活性剂等组成成分的增溶效果，可以显著提升难溶性药物的溶解度。纳米乳小且均匀的粒径，可透过胃肠道的水化层，改善胃肠上皮细胞对药物的吸收。纳米给药体系具有较低的表面张力，可提高膜的通透性，促进药物吸收，提高其生物利用度[4]。纳米乳自身的独特优势，使其具有广泛的临床应用范围，可通过口服、透皮、注射等多种途径给药[5-6]。
本研究结合纳米乳剂型的优势，制备了盐酸小檗碱口服纳米乳(BBR-NE)，采用伪三元相图法和星点设计-效应面法优化了制备工艺，并对其体外特性进行表征，从而解决盐酸小檗碱口服给药剂型溶解度差、生物利用度低等问题，提高药物的疗效，为小檗碱的临床应用提供新的给药剂型[4]。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；EPPENDORF 5804R 高速冷冻离心机（德国Eppendorf有限公司）；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）；Zetasizer Nano ZS90 测定仪（英国马尔文公司）。
1.2 试药
盐酸小檗碱原料药（批号XC20170113，西安小草植物科技有限公司）；盐酸小檗碱对照品（批号110713-201212，纯度>86.7 %，中国食品药品检定研究院）；1,2-丙二醇（批号20181008，上海凌峰化学试剂有限公司）；吐温-80（批号2015021，上海凌峰化学试剂有限公司）；甘油（批号20191110，上海源叶生物科技有限公司）；聚乙二醇400（PEG400，批号970248，上海浦东高南化工厂）；聚氧乙烯氢化蓖麻油（RH-40，批号19523275L0，德国 BASF 公司）；烷基糖苷0810（APG，平均聚合度1.2～1.8，批号170502，上海发凯化工有限公司）；丙二醇单辛酸酯（Capryol 90，批号170857，上海嘉法狮贸易有限公司）；肉豆蔻酸异丙酯（IPM，批号F20160731，国药集团化学试剂有限公司）；橄榄油（批号F20180725，中国医药集团上海化学试剂公司）；中链脂肪酸（MCT，批号193717，嘉法狮（上海）贸易有限公司）；大豆油（批号20190801，江西金海棠药用油有限公司）；蓖麻油（批号20180815，上海凌峰化学试剂有限公司）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国 TEDIA 有限公司）；羟丙甲基纤维素（HPMC，批号H08827，阿拉丁生化科技股份有限公司）；水为重蒸水。
2. 方法与结果
2.1 盐酸小檗碱HPLC含量测定方法的建立[7-8]
2.1.1 色谱条件
色谱柱：Hypersil BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L与磷酸二氢钾（0.5 %三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。
2.1.2 方法学考察
精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇稀释定容于10 ml量瓶中作为储备液，用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，按上述色谱条件进样测定。称取适量盐酸小檗碱纳米乳于10 ml 量瓶中，加入甲醇超声破乳30 min，10000 r/min离心5 min，取1 ml上清液于10 ml 量瓶中，加甲醇定容后过0.45 μm微孔滤膜即得供试品溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在1.00～100.00 μg/ml浓度范围内呈良好的线性关系，回归方程为：Y=37.059 X+16.952 （r=0.999 9）。低、中、高浓度的盐酸小檗碱对照品溶液的日内精密度分别为0.68 %、1.64 %、0.80 %，日间精密度分别为0.95 %、0.23 %、013 %，加样回收率RSD分别为1.42 %、0.70 %、1.57 %，表明该方法可用于纳米乳中盐酸小檗碱的含量测定。
2.2 盐酸小檗碱纳米乳的制备[4]
2.2.1 油相、表面活性剂和助表面活性剂的筛选
采用水滴加法制备盐酸小檗碱纳米乳。根据各类溶剂口服的安全性，筛选出以下各相备选溶剂，以BBR的溶解度为指标，确定各相最佳选择。
油相：Capryol 90、蓖麻油、橄榄油、大豆油、IPM、MCT；表面活性剂：吐温-80、APG、RH-40；助表面活性剂：1,2-丙二醇、PEG400、甘油。在具塞玻璃离心管中加入5 ml 上述各溶剂与过量盐酸小檗碱，置于恒温（25 ℃）振荡器振摇（100 r/min）72 h，得到以上各溶剂的饱和盐酸小檗碱溶液。取该饱和溶液于5000 r/min 条件下离心10 min，吸取1 ml上清液置于5 ml量瓶中，加甲醇稀释定容之后过0.45 μm微孔滤膜，按“2.1.1”项下色谱条件进样检测。
结果如图1所示：油相中盐酸小檗碱的溶解度从大到小依次为：Capryol 90> MCT>蓖麻油>大豆油>橄榄油>IPM；表面活性剂的顺序为：吐温-80>APG>RH-40；助表面活性剂的顺序为：1,2-丙二醇>甘油>PEG400。即盐酸小檗碱在Capryol 90、吐温-80、1,2-丙二醇中溶解度最大，故选择Capryol 90为油相，吐温-80为表面活性剂，1,2-丙二醇为助表面活性剂。
2.2.2 表面活性剂与助表面活性剂质量比（Km）的筛选
按照上述筛选的结果，将表面活性剂和助表面活性剂按照Km分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1的比例混合，再取油相与此混合表面活性剂按照1∶9、2∶8；3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的质量比配制成混合溶液，在磁力搅拌下滴加蒸馏水。观察溶液的颜色、乳光和澄明度，判断临界点，记录体系由浑浊变澄清时的加水量，计算临界点时各组分的比例。用Origin 10.0软件绘制伪三元相图，图中各临界点连线下方的区域即为纳米乳区，比较该区域面积大小，确定表面活性剂与助表面活性剂的质量比[9-11]。结果见图2。图中阴影部分即为成乳区，且当Km为2∶1时达到最大，故将Km定为2∶1。然而在实际制备纳米乳过程中，处方中各组分的不同比例会产生交互影响作用，因此，需要进一步采用星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳的制备工艺。
2.2.3 星点设计-效应面法优化盐酸小檗碱纳米乳处方[4]
选择对纳米乳影响较大的表面活性剂与助表面活性剂质量比Km（X1）和油相质量百分数（X2）作为考察因素，以多分散系数（PDI，Y1）和载药量（Y2）为考察指标。实验过程中发现当Km≥4时，大部分处方难以成乳；当Km≤1:2时，平均粒径>100 nm，故将Km范围定在1∶1至3∶1。当含油量增至0.5 g（50 %）时，平均粒径已接近100 nm，而当含油量范围在0.2～0.5 g（20 %～50 %）时，可将粒径控制在100 nm之内。根据单因素试验结果确定了Km的取值范围和油相质量百分数，并将两个评价指标进行归一化，将每个指标换算成0～1之间的“归一值（OD）”,并求算几何平均数，得总评“归一值”。计算公式如下: OD=(d1d2d3…... dk)1/k（k为指标数）。对取值越小越好的因素（PDI）和取值越大越好的因素（载药量）采用Hassan法[9]分别进行数学转换，求归一值dmin和dmax，公式如下：dmin=(Ymax−Yi)/(Ymax−Ymin)；dmax=(Yi−Ymin)/(Ymax−Ymin)。采用2因素5水平星点设计优化处方，因素水平见表1，星点设计各组实验结果见表2。
表 1 星点设计因素水平表因素 水平 −1.41 −1 0 +1 +1.41 X1（Km） 1∶1 1.29∶1 2∶1 2.71∶1 3∶1 X2（含油量/g） 0.2 0.24 0.35 0.46 0.5 表 2 星点设计各组实验结果编号 X1 X2 平均粒径
(l
/nm)Y1 Y2
(mg/g）dmin dmax OD 1 0 −1.41 46.32 0.29 0.72 0.54 0 0 2 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.367 0.558 3 −1 1 85.3 0.25 0.91 0.78 0.820 0.800 4 0 0 74.06 0.23 0.84 0.85 0.53 0.67 5 1 −1 76.58 0.35 0.72 0.21 0.01 0.04 6 1.41 0 59.8 0.36 0.76 0.12 0.15 0.13 7 1 1 101.4 0.38 0.78 0.04 0.34 0.12 8 −1.41 0 58.68 0.21 0.80 1.00 0.36 0.60 9 −1 −1 45.8 0.21 0.84 0.99 0.51 0.71 10 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 11 0 0 74.06 0.23 0.81 0.85 0.37 0.56 12 0 0 74.06 0.23 0.80 0.85 0.37 0.56 13 0 1.41 91.88 0.39 0.95 0.00 1.00 0.00 对X1进行二次式回归，得到方程R1=0.23+0.06 A+3.22×10−3B−2.75×10−3AB+0.03A2+0.03B2 ，（r=0.970 8），P<0.001；对X2进行二项式回归，得到方程R2=0.81−0.04A+0.06B+1.37×10−3AB−0.01A2+0.01B2，（r=0.913 5），P<0.05；对总归一值（OD）进行二项式回归，方程为OD=0.87−0.28A+0.03B−0.01AB−0.03A2−0.34B2，（r=0.910 2），P<0.05。以OD作为指标时，为使方程有效，对其进行方差分析，结果见表3。由表3可知，模型的P < 0.05，说明OD与X1、X2回归方程的非线性关系显著。回归方程的相关系数r=0.910 2，表明模型能说明91.02 %响应值的变化，拟合情况良好，回归方程具有较好的代表性，能准确预测实际情况[12]。
表 3 星点设计-效应面法优化纳米乳处方方差分析表来源 平方和 自由度 均方 F P 模型 1.48 5 0.18 5.88 0.0190 A-A 0.65 1 0.51 12.82 0.0090 B-B 7.73 1 3.600 0.15 0.7067 AB 4.40×10−5 1 0.016 8.74×10−3 0.9281 A2 6.32×10−3 1 0.37 0.13 0.7335 B2 0.83 7 0.026 16.41 0.0049 残差 0.35 3 0.058 纯误差 0.011 4 8.70×10-3 42.60 0.0017 总和 1.83 12 r 0.90 校正后r 0.82 C.V.% 35.29 信噪比 7.05 由拟合曲线可绘制X1、X2和OD值的关系，所绘制的三维效应面和二维等高线如图3所示。利用Design Expert 8.0软件的预测分析功能，根据拟合回归方程、三维效应面图和二维等高线图综合分析，得到最佳处方为X1= 0，X2=0.53，预测值OD为0.6214。故优化后的盐酸小檗碱纳米乳处方为：油相Capryol 90占体系的32.84 %，表面活性剂吐温-80占体系的33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %[4]。
2.2.4 最优处方的验证
对最优处方进行处方验证，结果如表4所示，预测值OD为0.6214，实际OD值为0.6510，偏差为4.76 %。表明预测值与实测值之间偏差较小，表明星点设计-效应面法（CCD-RSM）可用于筛选盐酸小檗碱纳米乳，筛选的处方预测良好、可靠。
表 4 最优处方验证结果评价指标 实测值 实际OD值 预测OD值 偏差（%） PDI 0.235±0.03 0.6510 0.6214 4.76 载药量（mg/g） 0.829 2.3 盐酸小檗碱纳米乳的体外表征[4]
2.3.1 BBR-NE载药量的测定
取适量BBR-NE于10 ml量瓶中，加甲醇超声破乳30 min，加甲醇稀释定容。4 ℃离心（10000 r/min，5 min），吸取1 ml上清液置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释定容后即得样品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样检测，计算纳米乳的载药量。测定结果如表5。
表 5 盐酸小檗碱纳米乳的载药量测定结果($\bar x $ ±s ，n=3)批号 盐酸小檗碱（mg/g） RSD（%） 201118 0.83±0.01 0.16 201119 0.83±0.02 0.21 201120 0.83±0.01 0.17 2.3.2 BBR-NE粒径大小与分布的测定
按照最优处方制备BBR-NE，稀释到适宜浓度，均匀分散后，采用马尔文激光粒度分析仪测定纳米乳的粒径大小。粒径结果如图4和图5所示。所制备的BBR-NE粒径分布范围窄且呈正态分布，平均粒径为（68.85±8）nm，PDI为(0.245±0.03)，表明该制剂粒径分布及均匀性均符合纳米乳制剂要求。
2.3.3 BBR-NE的形态学考察
采用透射电镜（TEM）观察所制备的BBR-NE的形态。取适量BBR-NE滴于铜网上，自然干燥后滴加2 %磷钨酸（pH=7.4）溶液于铜网上负染3 min，晾干后置于透射电镜下观察其外观形貌。最优处方制备的纳米乳的透射电镜如图6所示。结果表明，BBR-NE呈均一圆整的球形，具明显层状结构，粒径大小约为68 nm。
2.3.4 BBR-NE体外释放度的测定[4]
取制备好的盐酸小檗碱纳米乳2 ml，置于透析袋（分子截留值为7 000）中。于pH 1.2的人工胃液中释放2 h，再于pH 6.8的人工小肠液中释放22 h，溶出介质体积满足漏槽条件。将透析袋置于离心管中（含30 ml透析液），在恒温振荡器（37 ℃，100 r/min）中释放24 h，分别于0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h定时取样1 ml，随后立即补加等温等体积释放介质。收集的样品过0.45 μm滤膜后，按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算累积释放度。释放曲线如图7所示，拟合方程如表6所示。
表 6 盐酸小檗碱纳米乳释药曲线的拟合方程释药模型 拟合方程 r 零级动力学方程 Q=29.352 t–4.123 0.816 4 一级动力学方程 ln(1–Q)=92.395 t+0.240 0.962 3 希古契（Higuchi）方程 Q=20.952 t 1/2–6.735 0.889 6 由释放曲线可以看出，BBR-NE在人工胃液中（0～2 h）累积释放度很低（<20%），进入人工小肠液后（2～24 h）释放度逐渐上升，累积释放度达到80 %以上，表明该制剂具有一定缓释效果，其释药行为符合一级动力学方程。
3. 讨论
纳米乳的处方筛选过程中，目前常采用绘制伪三元相图、正交试验设计法、星点设计-效应面法等方法。其中，伪三元相图法的精度不高，常用于初筛[13-14]；正交试验设计法在因素水平较少时试验次数虽不多，但由于采用线性模型拟合，预测性较差[15]；而星点设计-效应面法各因素对效应的影响拟合结果多数是非线性，可从效应面上选择最佳效应区域，适合于多因素、多水平的处方优化。
在应用伪三元相图筛选Km时，随着表面活性剂和助表面活性剂质量比的增加，形成纳米乳区域的面积逐渐增加，当Km为2∶1 时最大，而后稍有减小。这是由于加入吐温-80的比例增加，纳米乳的乳化作用增强。因此需要综合考虑选择最佳的Km值。
本研究在单因素筛选的基础上，利用星点设计-效应面法，以载药量及外观形态为考察指标，优化并确定了盐酸小檗碱纳米乳的最优处方：油相 Capryol 90占体系32.84 %，表面活性剂吐温−80占体系33.90 %，助表面活性剂1,2-丙二醇占体系16.95 %，水相占体系15.25 %，载药量为0.829 mg/g。 外观形态分析，表明所制备的BBR-NE 呈圆整均一的球体且具有明显的层状结构，平均粒径为 (68.85±8) nm，呈正态分布，多分散系数为(0.245±0.03)，说明该制剂粒径大小符合纳米乳粒径要求且均匀性好[4]。由验证试验结果可知，该制备工艺稳定可行，有望为盐酸小檗碱临床应用提供一种新的给药剂型。
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