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苯磺酸顺阿曲库铵为临床常用的中长效肌肉松弛药,苏醒期药物在体内的残留导致残余肌松的发生,成为导致麻醉后发生呼吸系统不良事件的主要原因,尤其是老年患者,术后残留会带来更严重的不良后果[1],因此对老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的残留进行监测有重要意义。苯磺酸顺阿曲库铵易发生霍夫曼降解,温度和pH值的升高会加速降解[2],因此,临床收集的血浆样本的稳定保存至关重要。本研究在既往文献报道的HPLC法及高效液相色谱-质谱(LC-MS)法[3-6]基础上,开发了一种用灵敏、准确、高效的超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)测定人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度的方法,有效避免了苯磺酸顺阿曲库铵的降解,对老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度随时间变化的规律进行研究,探讨自体血回输对患者体内苯磺酸顺阿曲库铵浓度的影响。
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Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱(安捷伦,美国);Agilent 6470三重四极杆质谱,配备AJS-ESI喷射流电喷雾离子源(安捷伦,美国);SECURA125-1CN型电子天平(赛多利斯,德国);Arium® mini 超纯水机(赛多利斯,德国)。
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苯磺酸顺阿曲库铵对照品(中国食品药品检定研究院,批号101170-201902,纯度>98%);内标维库溴铵对照品(中国食品药品检定研究院,批号100813-201603,纯度>99%);甲酸、乙酸铵为色谱纯(麦克林,中国);乙腈为质谱纯(霍尼韦尔,美国);水为超纯水。
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色谱柱为SHISEIDO(资生堂)ADME(3.0 mm×100 mm,2.7 μm),柱温35 ℃;流动相系统以含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液为A相,以乙腈溶液为B相,等度洗脱,A∶B=30∶70(V/V),流速:0.35 ml/min;进样量2 μl,分析时间3 min。
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选择AJS-ESI离子源正离子模式,离子源参数设置:雾化器压力40 psi;干燥气流速11 L/min;干燥气温度350 ℃;鞘气流速11 L/min;鞘气温度350 ℃;毛细管电压4 000 V。
多重反应监测(MRM)参数:苯磺酸顺阿曲库铵464.3→358.2(m/z),碎片电压135 V,碰撞能量20 eV,保留时间为2.05 min;维库溴铵(IS)557.4→356.3(m/z),碎片电压135 V,碰撞能量35 eV,保留时间为1.86 min。
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取苯磺酸顺阿曲库铵对照品约1.5 mg,精密称定,置于2 ml棕色称量瓶中,精密加入含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解并涡旋混匀,配成浓度为1.0 mg/ml的储备液;取上述储备液适量,用含0.1%甲酸的乙腈溶液按比例逐级稀释,配成浓度为400~100 000 ng/ml的标准溶液,置于4 ℃冰箱备用。
同法配制浓度为800、40 000、80 000 ng/ml的质控溶液,置于4 ℃冰箱备用。
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取维库溴铵对照品约1.5 mg,精密称定,置于2 ml棕色称量瓶中,精密加入含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解并涡旋混匀,配成浓度为1.0 mg/ml的内标储备液;取上述储备液用含0.1%甲酸的乙腈溶液稀释为500 ng/ml的内标标准溶液,置于4 ℃冰箱备用。
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精密吸取空白人血浆与不同浓度的苯磺酸顺阿曲库铵标准溶液,配制为浓度为20、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 ng/ml的苯磺酸顺阿曲库铵模拟标准曲线样品。同法配制浓度为40、2 000、4 000 ng/ml的质控样品。
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取血浆样品50 µl,加入50 µl的维库溴铵内标标准溶液、400 µl的含0.1%甲酸的乙腈溶液,涡旋1 min, 13 000 r/min(5 ℃)离心5 min,取上清液100 µl进样。
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该临床试验经上海市浦东新区公利医院医学伦理委员会审批同意,批件号:(2020)临审第(018)号。选取老年脊柱手术患者给予咪达唑仑0.05 mg/kg,丙泊酚1.5 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg、苯磺酸顺阿曲库铵0.2 mg/kg麻醉诱导;诱导后进行急性等容性血液稀释(ANH),采集总血容量的10% 血液冷藏保存于ACD储血袋中;术中丙泊酚2.5 μg/ml、瑞芬太尼0.1~0.2 μg/(kg·min)、苯磺酸顺阿曲库铵2.0 μg/(kg·min)维持麻醉,于手术主要步骤完成后停止泵注苯磺酸顺阿曲库铵并回输采集的自体血液。收集麻醉诱导结束(T1)、术毕(T2)、术毕0.5 h(T3)、术毕1 h(T4)、回输时刻ACD血袋(LT)的血样各5 ml,于3 000 r/min离心5 min,分离得血浆,精密吸取1 ml血浆置于事先加入100 µl的2%甲酸水溶液的冻存管中,振摇10 s混合后,于−80 ℃冰箱保存。
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取空白人血浆样品、模拟血浆样品(苯磺酸顺阿曲库铵浓度为5 000 ng/ml)以及手术中采集的人血浆样品,分别按“2.1.4”项下进行血浆样品前处理后进样,获得相应的零点样品、模拟样品及人血浆样品的色谱图;空白人血浆样品处理时以含0.1%甲酸的乙腈溶液代替内标溶液,获得双空白样品的色谱图。结果表明该方法选择性良好,见图1。
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以血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度为X,苯磺酸顺阿曲库铵与维库溴铵的峰面积比值为Y,用1/X权重求得回归方程:Y=0.002 6 X+0.010 9,(r=0.999 7),表明在20~5 000 ng/ml范围内线性关系良好。
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通过在定量上限样品(浓度为5 000 ng/ml)之后立即进样分析双空白样品来评估系统残留。结果显示双空白样品中苯磺酸顺阿曲库铵的峰面积不超过该分析批定量下限样品待测物峰面积的20.0%,内标维库溴铵的峰面积不超过该分析批标准曲线内标最小峰面积的5.0%,表明该方法的残留效应不影响测定。
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进样分析低、中、高3个浓度(40、2 000、4 000 ng/ml)的质控样品,每个浓度平行操作6份,连续分析3 d,计算批内、批间的精密度(RSD)及准确度(RE),结果表明批内和批间的RSD<10%,RE<±10%,见表1。
表 1 苯磺酸顺阿曲库铵精密度和准确度考察结果
浓度(ng/ml) 批内(n=6) 批间(n=18) 精密度
(RSD,%)准确度
(RE,%)精密度
(RSD,%)准确度
(RE,%)40 3.10 1.34 7.66 −7.67 2 000 8.27 −5.98 5.23 −7.75 4 000 6.47 4.62 9.34 −5.17 -
配制两种溶液,其中苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的浓度均与低、中、高浓度质控样品处理后的浓度一致:①将6个不同来源的空白人血浆按“2.3.1”项下处理为双空白样品后,加入苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵对照品溶液;②配制两者的对照品溶液。分别记录两种溶液分析后苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的峰面积,以峰面积的比值计算内标归一化的基质效应。
再配制2种溶液:①将低、中、高3个浓度水平的质控样品按“2.1.4”项下处理;②将单一来源的空白人血浆按“2.3.1”项下处理为双空白样品后,加入苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵对照品溶液,使两者浓度均与低、中、高浓度质控样品处理后的浓度一致。分别记录两种溶液分析后苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的的峰面积,以峰面积的比值计算提取回收率。
结果表明,低、中、高浓度的基质效应影响一致,RSD为5.81%,基质效应和提取回收率的考察结果见表2。
表 2 苯磺酸顺阿曲库铵基质效应和提取回收率考察结果
品名 浓度
(ng/ml)内标归一化的
基质效应(%)提取回收率
(%)苯磺酸顺阿曲库铵 40 71.88 83.62 2 000 77.67 83.40 4 000 80.64 88.87 维库溴铵 125.91 -
将新鲜配制的苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的储备液(浓度均为1.0 mg/ml)于4 ℃冰箱中放置28 d,以峰面积的偏差考察其稳定性,结果显示苯磺酸顺阿曲库铵峰面积的偏差为−4.37%,维库溴铵峰面积的偏差为4.75%,表明待测物和内标的储备液稳定性良好。再考察低、中、高3个浓度水平的质控样品(浓度为40、2 000、4 000 ng/ml),室温下放置3 h后处理、处理后在自动进样器(4 ℃)放置24 h、反复冻融3次、−80 ℃冰箱中放置30 d的稳定性,每个浓度平行操作6份,结果见表3。
表 3 血浆样品稳定性考察结果
浓度
(ng/ml)室温(n=6) 进样器(n=6) 冻融(n=18) 长期(n=6) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 40 6.23 7.30 6.75 −1.86 3.89 −2.19 2.23 8.24 2 000 1.38 0.33 2.57 −7.87 4.72 −8.99 3.62 −12.62 4 000 6.75 −2.25 2.40 −6.04 4.38 −10.96 3.48 −10.89 -
研究纳入8名老年患者,受试者1~4诱导后进行ANH,受试者5~8未进行ANH。采用建立的方法测定临床采集的血浆样本的浓度,结果见表4。
表 4 血浆样品中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定结果(ng/ml)
时间点(t/h) 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 受试者7 受试者8 T1 332.0 362.3 556.8 388.9 289.5 328.1 359.9 348.3 T2 228.4 190.9 363.6 205.9 65.71 180.3 170.1 158.5 T3 81.66 99.30 174.4 145.9 41.60 68.56 73.07 61.64 T4 50.11 58.34 125.9 84.42 24.72 35.21 40.14 34.22 LT 270.8 338.0 489.9 316.3 -
既往文献报道的苯磺酸顺阿曲库铵血药浓度的检测方法主要有HPLC法及LC-MS法,但往往需要经过真空离心浓缩或氮吹浓缩等较为复杂的样本前处理方法或经梯度洗脱而分析时间较长[3-6]。本研究在此基础上,开发了UPLC-MS/MS检测方法,优化了前处理方法,采用蛋白沉淀法,操作简便,基质效应和提取回收率满足方法学要求;同时筛选了不同的流动相,最终确定含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液∶乙腈(30∶70,V/V)等度洗脱,使苯磺酸顺阿曲库铵的离子化程度达到最优,方法验证结果显示该方法的精密度和准确度符合生物样本的分析要求。
苯磺酸顺阿曲库铵易发生霍夫曼降解而消除,温度和pH值的升高会加速其降解[2],如不加入酸调节pH值,即使在−80 ℃的储存条件下,其仍会很快降解。本研究中,经过对不同浓度甲酸溶液的考察,最终确定标准品的配制溶剂与蛋白沉淀剂均使用含0.1%甲酸的乙腈溶液、血浆样品的收集过程中加入含2%甲酸的水溶液,稳定性研究显示储备液可在4 ℃稳定储存28 d(RE=−4.37%),血浆样本可在−80 ℃稳定储存30 d(低浓度RE=8.24%,中浓度RE=−12.62%,高浓度RE=−10.89%),有效避免了苯磺酸顺阿曲库铵的降解。
残余肌松导致患者出现主观不适,导致低氧或高二氧化碳血症、咽部肌肉无力,严重的出现上呼吸道梗阻影响患者生命安全[7]。国内一项多中心的纳入1 571例腹部手术患者的研究提示,术后肌松残余率高达52.8%[8],而国外一项使用新斯的明拮抗残余肌松的研究显示,拮抗后仍有63.5%的患者在拔除气管导管时存在残余肌松[9]。ANH常规在麻醉诱导后采集稀释血液,所以其中含有一定量的麻醉药物,本研究中亦检测到离体自体血在回输时刻血袋内含有较高浓度的苯磺酸顺阿曲库铵。回输采集自体血后,患者体内苯磺酸顺阿曲库铵浓度较未进行ANH自体血回输的患者浓度下降缓慢,存在残余肌松的风险。尹磊等[10]研究亦显示,针对老年患者在术毕回输ANH采集自体血存在肌松恢复延迟的现象。因此,针对ANH回输自体血的患者,有必要监测苯磺酸顺阿曲库铵的血浆药物浓度,避免围术期不良事件发生。而本研究建立的检测方法有效、稳定,可以用于临床监测苯磺酸顺阿曲库铵的浓度。
Monitoring of residual cisatracurium besylate in elderly patients plasma at post operation by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的含量,并应用于临床治疗中监测老年患者手术后血浆中的药物残留。 方法 样品经含0.1%甲酸的乙腈溶液蛋白沉淀处理后,采用SHISEIDO(资生堂)ADME(3.0 mm×100 mm,2.7 μm)色谱柱,流动相以含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈溶液(30 : 70,V/V),等度洗脱。质谱检测选择AJS-ESI离子源正离子模式,多反应监测(MRM)检测离子对为:苯磺酸顺阿曲库铵464.3→358.2(m/z)、维库溴铵(IS)557.4→356.3(m/z)。收集老年脊柱手术患者麻醉诱导后、手术结束、术后0.5 h、术后1 h以及自体血回输时刻血袋内的血浆样品,于事先加入2%甲酸水溶液的冻存管中保存,测定样本中的苯磺酸顺阿曲库铵的含量,评估自体血回输对老年患者术后血浆苯磺酸顺阿曲库铵浓度的影响。 结果 人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵在20~5 000 ng/ml范围内线性良好,r=0.999 7;批内和批间的精密度RSD<10%、准确度RE<±10%;低中高3个浓度的基质效应为71.88%~80.64%、提取回收率为83.62%~88.87%,内标维库溴铵的提取回收率为125.91%,符合方法学要求。老年患者手术后血浆中有一定程度残留的苯磺酸顺阿曲库铵,需严格掌握拔管时间,适当延长患者在麻醉复苏室的停留时间。 结论 该方法灵敏、准确、高效,适用于临床治疗中老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 苯磺酸顺阿曲库铵 /
- 含量测定 /
- 残余肌松
Abstract:Objective To establish a method for the determination of cisatracurium besylate in human plasma by UPLC-MS/MS which could be used in the monitoring of drug residual in plasma of elderly patients after operation. Methods The samples were precipitated with 0.1% formic acid-acetonitrile solution and separated by an SHISEIDO ADME column(3.0 mm×100 mm, 2.7 μm) for isocratic elution with the mobile phase of water containing 0.1% formic acid with 2 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (30 : 70, V/V). MS condition was optimized in the positive ion detection mode by multiple reaction monitoring (MRM), along with the Agilent jet stream electrospray source interface (AJS-ESI). The precursors to the product ion transitions were m/z 464.3→358.2 for cisatracurium besylate and m/z 557.4→356.3 for vecuronium bromide (the internal standard, IS). Plasma samples of elderly patients undergoing spinal surgery were collected after anesthesia induction, at the end of surgery, 0.5 h and 1 h after surgery, and from the blood bags while autologous blood transfusion, and stored in cryopreservation tubes with 2% formic acid solution. Then the contents of cisatracurium besylate were determined. The effects of autogenous blood transfusion on plasma concentration of cisatracurium besylate in elderly patients after surgery evaluated. Results The calibration curve was linear in the range of 20-5 000 ng/ml for cisatracurium besylate in human plasma, r=0.999 7. The intra-day and inter-day precision and accuracy were good (RSD<10%, RE<±10%). The matrix effect of different concentrations was 71.88%~80.64%. The recovery of different concentrations was 83.62%~88.87%. The recovery of vecuronium bromide (IS) was 125.91%, which conformed with the requirement of methodological validation. There was a certain degree of residual cisatracurium besylate in the plasma of elderly patients, so the extubation time should be strictly controlled and the stay time of patients in the anesthesia recovery room should be appropriately extended. Conclusion The method is sensitive, accurate, and efficient, which could be used for the determination of cisatracurium besylate in human plasma of elderly patients after operation. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- cisatracurium besylate /
- content determination /
- residual curarization
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菊花为菊科植物菊花的干燥头状花序,是一种常见的药食两用的花卉,具有清热、明目、疏风、解毒之功效[1-2]。根据经典的记载,中国栽培菊花历史已有3000多年。汉朝《神农本草经》记载:“菊花久服能轻身延年”。现代药理学研究表明,菊花具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎以及保肝等作用[3-12],因此,常作为保健饮品服用。安徽黄山是菊花的重要产地,拥有黄山金丝皇菊、黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊等多个品种,其中皇菊的黄酮含量极高,富含多种氨基酸、维生素和微量硒元素,具有重要的药用价值;而道地黄山贡菊更是菊花中的上等品,“白边黄芯绿屁股”,处于四大药菊之首。本研究主要对以上四种菊化品种进行研究,对比其抗氧化及抗炎活性,为菊花抗氧化和抗炎品种的开发提供参考和借鉴。
1. 材料与试剂
4种菊花(黄山金丝皇菊、黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊)来源于黄山市产品质量检验研究院;总抗氧化能力检测试剂盒(ABTS法)、总抗氧化能力检测试剂盒(FRAP法)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼试剂盒(DPPH法)购自Solarbio;双报告基因检测试剂盒购自Promega;LPS购自美国Sigma公司;SD大鼠,雄性,体重180~220g,购自上海斯莱克实验动物中心。
2. 实验方法
2.1 菊花提取工艺
4种不同菊花经粉碎机粉碎并过60目筛,各取100 g,加入1000 ml去离子水浸泡12 h,然后加热回流提取2 h,过滤去除滤渣,滤液用旋转蒸发仪(60 ℃)蒸发去除溶剂,然后经真空干燥彻底去除水分[13]。由于4种菊花水提物得率基本一致(约17%),因此后续用相同质量的水提物表征同等质量的菊花。
2.2 ABTS法检测抗氧化能力
将等体积的ABTS溶液和氧化剂溶液混合配置成ABTS工作母液,室温避光存放24 h。使用前,把ABTS工作液用PBS稀释30~50倍,要求ABTS工作液的吸光度减去相应的PBS空白对照后,A734为0.7±0.05,对应的A405在1.4左右。称取菊花粗提物粉末100 mg,用适量蒸馏水充分溶解。同时,用蒸馏水将10 mmol/L Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。于96孔板的每个检测孔中加入200 μl ABTS工作液,空白对照孔中加入10 μl蒸馏水;标准曲线检测孔中加入10 μl各浓度Trolox标准溶液;样品检测孔中加入10 μl样品溶液,轻轻混匀。室温孵育2~6 min后测定A734。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力[14]。
2.3 FRAP法检测总抗氧化能力
将TPTZ稀释液与TPTZ溶液充分混匀再加入检测缓冲液,从而配制成FRAP工作液。称取菊花粗提物粉末100 mg,用适量蒸馏水充分溶解。称取27.8 mg本试剂盒提供的 FeSO4•7H2O,溶解并定容到1 ml,此时浓度即为100 mmol/L。取适量100 mmol/L FeSO4溶液用蒸馏水稀释至0.15、0.3、 0.6、 0.9、 1.2和1.5 mmol/L。于96孔板的每个检测孔中加入180 μl FRAP工作液,空白对照孔中加入5 μl蒸馏水;标准曲线检测孔中加入5 μl各浓度FeSO4标准溶液;样品检测孔中加入5 μl样品溶液,轻轻混匀。室温孵育2~6 min后测定A593。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力[14]。
2.4 DPPH法检测总抗氧化能力
称取菊花粗提物粉末100 mg,用适量蒸馏水充分溶解。同时,用蒸馏水将10 mmol/L Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。于96孔板的每个检测孔中加入190 μl DPPH工作液,空白对照孔中加入10 μl蒸馏水;标准曲线检测孔中加入10 μl各浓度Trolox标准溶液;样品检测孔中加入10 μl样品溶液,混匀后室温避光静置30 min,测定A515。根据标准曲线计算样品的总抗氧化能力[14]。
2.5 双报告基因法测定菊花提取物的抗炎活性
Raw264.7细胞以适当密度接种于96孔板,实验分别设置空白组、LPS刺激组和不同药物浓度处理组,每组分别设置3个复孔。细胞过夜贴壁,利用转染试剂共转染报告基因质粒pNF-κB-Luc 和pRL-SV40,转染6 h后换液。转染24 h后加药,药物孵育2 h后加入LPS(终浓度1 μg/ml)刺激6 h,双报告基因法检测NF-κB转录活性。
2.6 菊花提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀的治疗作用
取SD大鼠48只,随机分为6组,分别为空白组、模型组、菊花水提物给药组(2 g/ kg,相当于菊花11.76 g/kg)。各组大鼠连续灌胃给药3 d,模型组给予相同体积的生理盐水,第4天于每只大鼠右后足垫皮下注射1.0%角叉菜胶100 μl,致炎后灌胃给予相应药物,分别在致炎前和致炎后1、2、4 h,测量大鼠致炎侧足容积,计算足趾肿胀率和肿胀抑制率[15-16]。按下式计算小鼠足趾肿胀率和抑制率:肿胀率=(致炎后足趾体积-致炎前足趾体积)/致炎前足趾体积×100%, 抑制率= (模型组足趾肿胀率-给药组足趾肿胀率)/模型组足趾肿胀率×100%。
3. 数据统计
数据以(
$\bar x $ ±s)表示,单因素方差分析(One way ANOVA)比较各组差异,以P<0.05为差异具有统计学意义。4. 实验结果
4.1 线性关系
ABTS、FRAP和DPPH线性方程以及相关系数见表1。
表 1 ABTS、FRAP、DPPH的线性方程及相关系数项目 方程 相关系数 ABTS Y=0.662 4X+0.715 3 r=0.999 5 FRAP Y=0.298 5X+0.060 r=0.999 4 DPPH Y=0.459 8X−0.023 8 r=0.998 9 从表1可以看出,ABTS、FRAP以及DPPH测定方法具有很好的线性。
4.2 4种菊花水提物抗氧化能力
ABTS法检测菊花水提物总抗氧化能力,结果显示,4种菊花的抗氧化能力存在明显差异,其中,黄山金丝皇菊抗氧化能力最强,为(0.481±0.052) mmol/g(总抗氧化能力用TEAC标准溶液表示),其次是黄山皇菊,为(0.402±0.043) mmol/g,然后依次是黄山贡菊(0.369±0.031)mmol/g和黄山黄菊(0.287±0.014)mmol/g。FRAP和DPPH检测以上四种菊花水提物抗氧化能力,结果与ABTS法类似,黄山金丝皇菊抗氧化能力最强,其次依次是黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊。综上,可以得出结论:黄山金丝皇菊水提物抗氧化能力最强,其次是黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊(表2)。
表 2 4种菊花抗氧化能力名称/抗氧化
能力FRAP(mmol FeSO4/g) ABTS(mmol Trolox/g) DPPH(mmol Trolox/g) 黄山金丝皇菊 0.504±0.049 0.481±0.052 0.359±0.025 黄山皇菊 0.421±0.036 0.402±0.043 0.305±0.033 黄山贡菊 0.347±0.028## 0.369±0.031 0.277±0.041# 黄山黄菊 0.270±0.017###,** 0.287±0.014## 0.208±0.019##,* *P<0.05,**P<0.01,与黄山皇菊比较;#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,与黄山金丝皇菊比较。 4.3 4种菊花水提物对LPS诱导的NF-κB转录活性的影响
利用双报告基因的方法检测4种菊花水提物对Raw264.7细胞 NF-κB转录活性的影响,结果显示4种菊花水提物均能够一定程度的抑制LPS诱导的NF-κB的转录活性。相同作用浓度下,黄山皇菊NF-κB抑制活性最强,其次依次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊。结果表明黄山皇菊抗炎作用最强,其次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊(图1)。
4.4 4种菊花水提物对角叉菜胶致大鼠急性炎症的影响
为了进一步确认4种菊花提取物的抗炎活性,我们构建了角叉菜胶致大鼠足肿胀模型。大鼠足趾肿胀率和肿胀抑制率如表3所示,1 h时间点,给予菊花水提物处理的各组大鼠足趾肿胀均低于模型对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。2 h时间点,黄山皇菊和黄山金丝皇菊对足趾肿胀仍然具有抑制作用,而黄山贡菊和黄山黄菊抑制作用消失; 组间比较,黄山皇菊足趾肿胀抑制作用优于黄山贡菊和黄山黄菊(P<0.05)。4 h时间点,各组对足趾肿胀的抑制作用消失。综上结果表明,黄山皇菊的抗炎活性最好,其次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊,该结论与NF-κB报告基因结果一致。
表 3 角叉菜胶致大鼠急性炎症模型结果(x±s,n=8)组别 1 h 2 h 4 h 肿胀率(%) 抑制率(%) 肿胀率(%) 抑制率(%) 肿胀率(%) 抑制率(%) 模型组 41.6±
4.5− 52.5±
10.7− 45.1±
8.2− 黄山金丝皇菊 31.5±
5.9#24.3 42.3±
7.1#19.5 44.9±
8.80.5 黄山皇菊 28.9±
5.9##30.6 38.9±
7.8#,*,ΔΔ26.0 46.4±
10.0−2.8 黄山贡菊 31.8±
6.3#23.7 50.0±
11.74.8 46.4±
8.3−2.8 黄山黄菊 33.3±
6.2#20.1 51.0±
7.32.9 44.9±
8.80.6 *P<0.05,与黄山贡菊比较;#P<0.05,##P<0.01,与模型组比较;ΔΔP<0.01,与黄山黄菊比较。 5. 结论
本研究采用ABTS、FRAP和DPPH 这3种方法测定了4种黄山菊花水提物的抗氧化活性,并通过报告基因法和大鼠足肿胀模型评估了其抗炎活性。结果表明,4种菊花表现出不同的抗氧化活性和抗炎活性,其中黄山金丝皇菊的抗氧化能力最强,其次是黄山皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊;而黄山皇菊的抗炎活性最强,其次是黄山金丝皇菊、黄山贡菊和黄山黄菊。菊花中黄酮类化合物具有清除自由基和超氧阴离子的能力,其抗氧化能力与黄酮类化合物含量有关;而菊花中的抗炎成分相对复杂,包含多糖、黄酮类化合物(如木犀草素、槲皮素及黄芩苷等)、有机酸(如绿原酸)和挥发油等,4种不同菊花在抗炎及抗氧化方面的活性差异可能与上述成分的差异有关[2,17-18]。尽管不同菊花品种在抗氧化和抗炎活性方面存在差异,但是均表现出良好的药用及食用价值,人们在日常生活中可以根据使用目的的不同进行选择,如考虑通过饮用菊花茶起到抗氧化目的,可以优先选用金丝皇菊,而如果考虑菊花抗炎作用,则可以考虑黄山皇菊。综之,4种黄山道地菊花提取物均表现出一定的抗氧化活性及抗炎活性,常饮之有保健功效。
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表 1 苯磺酸顺阿曲库铵精密度和准确度考察结果
浓度(ng/ml) 批内(n=6) 批间(n=18) 精密度
(RSD,%)准确度
(RE,%)精密度
(RSD,%)准确度
(RE,%)40 3.10 1.34 7.66 −7.67 2 000 8.27 −5.98 5.23 −7.75 4 000 6.47 4.62 9.34 −5.17 表 2 苯磺酸顺阿曲库铵基质效应和提取回收率考察结果
品名 浓度
(ng/ml)内标归一化的
基质效应(%)提取回收率
(%)苯磺酸顺阿曲库铵 40 71.88 83.62 2 000 77.67 83.40 4 000 80.64 88.87 维库溴铵 125.91 表 3 血浆样品稳定性考察结果
浓度
(ng/ml)室温(n=6) 进样器(n=6) 冻融(n=18) 长期(n=6) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 精密度(RSD,%) 准确度(RE,%) 40 6.23 7.30 6.75 −1.86 3.89 −2.19 2.23 8.24 2 000 1.38 0.33 2.57 −7.87 4.72 −8.99 3.62 −12.62 4 000 6.75 −2.25 2.40 −6.04 4.38 −10.96 3.48 −10.89 表 4 血浆样品中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定结果(ng/ml)
时间点(t/h) 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 受试者7 受试者8 T1 332.0 362.3 556.8 388.9 289.5 328.1 359.9 348.3 T2 228.4 190.9 363.6 205.9 65.71 180.3 170.1 158.5 T3 81.66 99.30 174.4 145.9 41.60 68.56 73.07 61.64 T4 50.11 58.34 125.9 84.42 24.72 35.21 40.14 34.22 LT 270.8 338.0 489.9 316.3 -
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