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冻伤是由寒冷、潮湿或大风引起的,会导致周围组织的损伤、丧失和残疾,尤其是手、脚、鼻子、脸颊和耳朵[1]。冻伤可引起微血管收缩,红细胞聚集,小动脉口径减小,硬度增大,毛细血管通透性升高,从而增加血液黏度,增大血流阻力,引起局部组织血流量减少,最终导致微循环障碍,使组织细胞由于缺血缺氧而坏死[2-3],临床早期主要通过血管阻塞症状和软组织缺血边界来判断冻伤程度[4-5]。因此,课题组着手研发一种由肌醇烟酸酯和肝素钠组成的冻伤膏,直接涂在易冻伤的四肢上,用于预防和治疗冻伤,降低冻伤程度。该冻疮膏对早期冻伤、皲裂、湿疹及软组织损伤均有很好的治疗效果[6]。其中,IN是一种外周血管扩张剂,温和持久,能选择性扩张病变部位及冷刺激敏感部位的血管,具有溶栓抗凝、缓解血管痉挛、改善小血管循环、降低毛细血管脆性的作用[7]。此外,它还具有止痒、止痛、消肿的作用。在此处方中,肌醇烟酸酯还可缓解长期使用肝素钠容易引起的局部血肿血栓和皮肤过敏,有效减少全身凝血功能障碍的副作用。
通过分析药物在体内血药浓度随时间变化的动态过程,,是传统药动学的研究方法。然而,对于经皮给药,药物入血浓度往往很低,难以定量。故本研究采用活体分时采样法,直接在大鼠皮肤上涂药,在不同时间点测定皮肤组织匀浆中的药物浓度。目前,已有研究对人或大鼠血浆中肌醇烟酸酯进行药代动力学研究[8-9],但是,没有可用于分析定量大鼠皮肤组织匀浆样品中肌醇烟酸酯的含量。因此,本研究旨在建立一种快速、灵敏、重现性好、经济简便的HPLC法,定量大鼠皮肤中肌醇烟酸酯,用于大鼠经皮给药肝素钠肌醇烟酸酯乳膏后肌醇烟酸酯的药动学研究。
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取涂抹空白乳膏基质的大鼠皮肤和给药后大鼠皮肤经处理后,分别进样20 μl,记录色谱图,考察是否有内源性物质干扰肌醇烟酸酯的测定。结果见图1。由实验结果可知,在此色谱条件下,皮肤中内源性物质和空白乳膏基质不干扰肌醇烟酸酯和内标的定量测定。
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精密吸取系列对照品溶液各50 μl,分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中,分别得到待测物浓度为0.25、0.50、1.00,2.50,5.00,10.00和20.00 μg/ml的系列溶液,按“2.4”项下操作后进样分析,记录峰面积,以肌醇烟酸酯的浓度(X)为横坐标,以肌醇烟酸酯(A)与内标物(B)的峰面积比值(Y)为纵坐标,进行线性回归计算,得回归方程为Y=0.172X+0.002(r=0.999 9),线性范围0.25~20.00 μg/ml,定量下限为0.25 μg/ml(S/N≥10)。
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取低、中、高不同浓度的QC样品及定量下限,按“2.4”项下方法操作。每个浓度配制6份样品,配制3个分析批,连续测定3 d。计算定量下限和QC样品的日间和日内的准确度RE%和精密度RSD%,表1结果表明该方法的精密度和准确度均符合生物样品分析要求。
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度(n=6)
质量浓度
(ρB/μg·ml−1)日内精密度 日间精密度 实测浓度
(ρB/μg·ml−1)RSD
(%)RE
(%)实测浓度
(ρB/μg·ml−1)RSD
(%)RE
(%)0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 -
取低、中、高不同浓度的QC样品,按“2.4”项下方法操作,记录峰面积(A1)。另外,将1 ml空白皮肤匀浆液按“2.4”项下方法操作,提取后,加入3种不同浓度的QC样品各50 μl,空气流吹干,加200 μl流动相涡旋1 min复溶,离心(10 000 r/min,5 min),取上清液,20 μl进样,记录峰面积(A2)。将两者相比,即得QC样品的提取回收率。结果见表2。肌醇烟酸酯的平均提取回收率为96.18%,甲苯咪唑的平均提取回收率为90.65%,RSD均<15%,表明该提取方法具有较好的稳定性和重现性。
表 2 样品提取回收率考察结果(n=6)
成分 质量浓度
(ρB/μg·ml−1)回收率( % ) mean±SD RSD( % ) 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35 -
取低、高不同浓度的QC样品,按照“2.4”项下皮肤样品的处理方法操作,分别考察低、高2个浓度的QC样品在室温下放置12 h、−4 ℃放置12 h、反复冻融3次(−20 ℃)和冷冻贮存2周(−80 ℃)的稳定性。数据结果见表3。结果表明,各生物样品在上述条件下稳定性均良好。
表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性(n=3)
稳定性条件 质量浓度
(ρB/μg·ml−1)实测值
(ρB/μg·ml−1)RSD
(%)室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69 -
采用DAS 2.0软件,以非房室模型分析待测物的药动学数据。皮肤中药物浓度数据以(mean±SD)表示,绘制了平均药物浓度时间曲线,各时间点含药浓度的计算分别伴随行标曲及QC。将给药后不同时间血药浓度和时间数据用DAS 2.0药动学软件处理,以统计矩方法计算药动学参数。详见图2和表4。
表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数(mean±SD, n=6)
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT(0−t) h 9.044±0.618 MRT(0−∞) h 10.444±1.91 CLz/F L/(h·kg) 0.19±0.03 Vz/F L/(h·kg) 1.19±0.437
Skin pharmacokinetics of inositol nicotinate in heparin sodium inositol nicotinate cream
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摘要:
目的 建立HPLC法测定大鼠皮肤中肌醇烟酸酯(IN)的浓度,并研究肝素钠肌醇烟酸酯乳膏(GJR)在大鼠经皮给药后IN的药动学特征。 方法 采用HPLC法建立简便快速的测定给药后不同时间点大鼠皮肤中IN浓度的分析方法,并用建立的方法开展GJR在大鼠经皮给药后IN的药动学研究,采用DAS软件拟合药物动力学参数。 结果 该分析方法在0.25 ~ 20 μg/ml浓度范围内线性良好,定量限为0.25 μg/ml,平均加样回收率为96.18%。GJR在体皮肤给药后IN的药动学参数t1/2 为(4.555±2.054)h、Tmax为(6±0)h、Cmax为(16.929±2.153)mg/L、AUC0−t为(150.665±16.568)mg·h /L、AUC0−∞为(161.074±23.917)mg·h /L、MRT(0−t)为(9.044±0.618)h、MRT(0−∞)为(10.444±1.91)h、CLz/F 为(0.19±0.03) L/(h·kg)、Vz/F 为(1.190±0.437)L/(h·kg)。 结论 IN能迅速渗透进入皮肤, 并能够长时间蓄积在皮肤局部,有利于IN在病变部位长时间发挥药效。该方法简便、快速、专属性强、重复性好,成功地应用于大鼠腹部皮肤给药后IN的药动学研究。 -
关键词:
- 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏 /
- 皮肤药动学 /
- 肌醇烟酸酯
Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of inositol nicotinate(IN) in rat skin, and study the pharmacokinetic characteristics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream(GJR) in rats. Methods HPLC method was used to establish a simple and rapid analytical method for the determination of IN concentration in the skin of rats at different time points after administration. The established method was used to study the pharmacokinetics of IN after transdermal administration of GJR in rats, and the pharmacokinetic parameters were fitted with DAS software. Results The linearity of the analytical method was good in the concentration range of 0.25~20 μg/ml, the quantitative limit was 0.25 μg/ml, and the average recovery rate was 96.18%. The pharmacokinetic parameters of IN after transdermal administration of GJR in rats were as follows: t1/2 was (4.555±2.054) h, Tmax was (6±0)h, Cmax was (16.929±2.153)mg/L, AUC0−t was (150.665±16.568) mg·h /L ,AUC0−∞ was (161.074±23.917) mg·h /L, MRT(0−t) was (9.044±0.618)h, MRT(0−∞) was (10.444±1.91) h, CLz/F was (0.19±0.03) L/(h·kg), and Vz/F was (1.19±0.437) L/(h·kg). Conclusion IN could quickly penetrate the skin and accumulate in the skin for a long time, which was beneficial to the pharmacological action of drugs on the lesion site for a long time. The method was simple, rapid, specific and reproducible, which could be successfully applied to the pharmacokinetic study of IN after transdermal administration in rats. -
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度(n=6)
质量浓度
(ρB/μg·ml−1)日内精密度 日间精密度 实测浓度
(ρB/μg·ml−1)RSD
(%)RE
(%)实测浓度
(ρB/μg·ml−1)RSD
(%)RE
(%)0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 表 2 样品提取回收率考察结果(n=6)
成分 质量浓度
(ρB/μg·ml−1)回收率( % ) mean±SD RSD( % ) 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35 表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性(n=3)
稳定性条件 质量浓度
(ρB/μg·ml−1)实测值
(ρB/μg·ml−1)RSD
(%)室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69 表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数(mean±SD, n=6)
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT(0−t) h 9.044±0.618 MRT(0−∞) h 10.444±1.91 CLz/F L/(h·kg) 0.19±0.03 Vz/F L/(h·kg) 1.19±0.437 -
[1] 陶冶, 顾伟杰, 晋亮, 等. 高原高寒地区官兵冻伤发生情况调查及相关因素分析[J]. 临床军医杂志, 2023, 51(3):243-245. [2] 张莉, 蔺兴遥, 尚芸, 等. 冻伤的病理机制及治疗研究进展[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2023, 28(3):347-354. [3] 焦明克, 楼林, 胡劼, 等. 普通冻伤与高原冻伤血液微循环恢复的差异[J]. 解放军医学杂志, 2017, 42(1):66-69. doi: 10.11855/j.issn.0577-7402.2017.01.13 [4] 毕婷, 冯晓东, 张巍, 等. 寒区军人冻伤发病现状及预测模型研究进展[J]. 创伤与急危重病医学, 2020, 8(2):134-136. [5] 刘清宇, 刘松春, 程治铭, 等. 寒区冻伤预防及诊疗研究进展[J]. 人民军医, 2021, 64(2):147-150. doi: 10.3969/j.issn.1000-9736.2021.02.014 [6] 马宏达, 吴琼, 崔亚玲, 等. 不同促透剂对肝素钠肌醇烟酸酯乳膏透皮吸收影响[J]. 临床军医杂志, 2017, 45(8):771-775. [7] 崔亚玲, 刘小虎, 许子华, 等. 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏对兔皮肤冻伤的治疗作用及刺激性研究[J]. 东南国防医药, 2021, 23(05):449-454. doi: 10.3969/j.issn.1672-271X.2021.05.001 [8] LIANG D, MA J, WEI B, et al. Determination of inositol hexanicotinate in rat plasma by high performance liquid chromatography with UV detection[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2008, 863(1):172-176. doi: 10.1016/j.jchromb.2007.12.024 [9] MILTON S G, ROBINSON K, MA J, et al. Biotransformation and pharmacokinetics of inositol hexanicotinate in rats[J]. Xenobiotica, 2013, 43(9):817-822. doi: 10.3109/00498254.2012.762591 [10] CDE. 药物非临床药代动力学研究技术指导原则. [DB/OL].(2014-05-13). https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/ypggtg/ypqtggtg/20140513120001448.html. [11] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 四部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2020.