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冻伤是由寒冷、潮湿或大风引起的，会导致周围组织的损伤、丧失和残疾，尤其是手、脚、鼻子、脸颊和耳朵[1]。冻伤可引起微血管收缩，红细胞聚集，小动脉口径减小，硬度增大，毛细血管通透性升高，从而增加血液黏度，增大血流阻力，引起局部组织血流量减少，最终导致微循环障碍，使组织细胞由于缺血缺氧而坏死[2-3]，临床早期主要通过血管阻塞症状和软组织缺血边界来判断冻伤程度[4-5]。因此，课题组着手研发一种由肌醇烟酸酯（IN）和肝素钠组成的冻伤膏，直接涂在易冻伤的四肢上，用于预防和治疗冻伤，降低冻伤程度。该冻疮膏对早期冻伤、皲裂、湿疹及软组织损伤均有很好的治疗效果[6]。其中，IN是一种外周血管扩张剂，温和持久，能选择性扩张病变部位及冷刺激敏感部位的血管，具有溶栓抗凝、缓解血管痉挛、改善小血管循环、降低毛细血管脆性的作用[7]。此外，它还具有止痒、止痛、消肿的作用。在此处方中，肌醇烟酸酯还可缓解长期使用肝素钠引起的局部血肿血栓和皮肤过敏，有效减少全身凝血功能障碍的副作用。
分析药物在体内血药浓度随时间变化的动态过程，是传统药动学的研究方法。然而，对于经皮给药，药物入血浓度往往很低，难以定量。故本研究采用活体分时采样法，直接在大鼠皮肤上涂药，在不同时间点测定皮肤组织匀浆中的药物浓度。目前，已有研究对人或大鼠血浆中肌醇烟酸酯进行药代动力学研究[8-9]，但是，没有可用于定量分析大鼠皮肤组织匀浆样品中肌醇烟酸酯的含量。因此，本研究旨在建立一种快速、灵敏、重现性好、经济简便的HPLC法，定量分析大鼠皮肤中肌醇烟酸酯，用于大鼠经皮给药肝素钠肌醇烟酸酯乳膏后肌醇烟酸酯的药动学研究。
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W501型高效液相色谱仪（Waters）；KQ3200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率150 W，频率40 kHz）；FLUKO MODE组织匀浆器（上海弗鲁克流体机械制造有限公司）；XW-80A微型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；离心机（ABBOTT LABORATORIES Germany）；剃须刀（上海飞科电器有限公司）；AUW120D型电子分析天平（SHIMADZU公司）。
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肌醇烟酸酯（天津中瑞药业有限公司，纯度：99.5%）；甲苯咪唑对照品（中国食品药品检定研究院；纯度：99.9%）；肝素钠肌醇烟酸酯乳膏（北部战区总医院药剂科自制，批号：
20150108 ）；盐酸（分析纯，天津市凯信化学工业有限公司）；乙腈（色谱纯，Sigma公司）；甲醇（色谱纯，Sigma公司）；四氢呋喃（色谱纯，Sigma公司）；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。 -
SD清洁级雄性大鼠（体重230~250 g）：由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（辽）2010-0001。
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Kromasil ODS C18 色谱柱（4.6 mm× 250 mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-四氢呋喃（35∶55∶10，V/V/V）；检测波长为262 nm；流速1.0 ml/min；柱温25 ℃；进样量20 μl。
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精密称取肌醇烟酸酯对照品12.5 mg（现用现配），置于10 ml量瓶中，加入适量0.5 mol/L盐酸水溶液，超声溶解，0.5 mol/L盐酸水稀释至刻度，即得浓度为1 250 μg/ml的对照品储备液。精密量取对照品储备液适量，置于10 ml量瓶中，分别用0.5 mol/L盐酸水稀释成系列溶液，即得到浓度为5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00和400.00 μg/ml的系列对照品溶液。同法配制浓度分别为10.00、50.00、300.00 μg/ml的低、中、高对照品溶液。
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精密吸取低、中、高对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到浓度为0.50、2.50和15.00 μg/ml的质控样品（QC）。
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取甲苯咪唑对照品适量，精密称定，加2%盐酸甲醇溶液超声溶解并定量稀释制成浓度为12 μg/ml的内标溶液。
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根据非临床药动学研究技术指导原则及《中国药典》生物样品定量分析方法验证指导原则的有关要求[10-11]，对定量研究方法进行方法学验证。
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取72只健康SD大鼠，雄性，体重（230～250）g，于实验条件下饲养5 d（22±2） ℃，相对湿度（50±10）%。试验开始前1 d，用电动理发器对腹部皮肤进行脱毛（4 cm×4 cm，不要损伤皮肤），禁食不禁水。其中6只大鼠作为空白组，涂抹空白乳膏基质。其余大鼠将临床3倍用量的肝素钠肌醇烟酸酯乳膏均匀涂抹于腹部脱毛处皮肤，剂量为0.2 g/只，于给药后0.25、0.5、l、2、3、4、6、8、10、12、24 h各时间点分别取6只大鼠，给药皮肤表面用生理盐水反复擦拭，以棉签擦干，剥离剪取固定面积的皮肤，去除附着的肌肉，备用。皮肤样品的处理：精密称取皮肤样品0.07 g，加入1 ml 甲醇-0.5mol/L盐酸（50:50，V/V），组织匀浆机研磨后超声处理20 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取300 μl上清液，加入50 μl内标溶液，再加入1 ml乙腈，涡旋混匀1 min，离心10 min（转速为10 000 r/min），取上清液，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心5 min（转速为10 000 r/min），取上清液，20 μl进样。
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采用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。
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取涂抹空白乳膏基质的大鼠皮肤和给药后大鼠皮肤经处理后，分别进样20 μl，记录色谱图，考察是否有内源性物质干扰肌醇烟酸酯的测定。结果见图1。由实验结果可知，在此色谱条件下，皮肤中内源性物质和空白乳膏基质不干扰肌醇烟酸酯和内标的定量测定。
图 1 专属性HPLC图谱
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精密吸取系列对照品溶液各50 μl，分别加入到1 ml空白皮肤匀浆液中，分别得到待测物浓度为0.25、0.50、1.00，2.50，5.00，10.00和20.00 μg/ml的系列溶液，按“2.4”项下操作后进样分析，记录峰面积，以肌醇烟酸酯的浓度（X）为横坐标，以肌醇烟酸酯（A）与内标物（B）的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行线性回归计算，得回归方程为Y=0.172X+0.002（r=0.999 9），线性范围0.25~20.00 μg/ml，定量下限为0.25 μg/ml（S/N≥10）。
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取低、中、高不同浓度的QC样品及定量下限，按“2.4”项下方法操作。每个浓度配制6份样品，配制3个分析批，连续测定3 d。计算定量下限和QC样品的日间和日内的准确度RE%和精密度RSD%，见表1，该方法的精密度和准确度均符合生物样品分析要求。
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 -
取低、中、高不同浓度的QC样品，按“2.4”项下方法操作，记录峰面积（A1）。另外，将1 ml空白皮肤匀浆液按“2.4”项下方法操作，提取后，加入3种不同浓度的QC样品各50 μl，空气流吹干，加200 μl流动相涡旋1 min复溶，离心（10 000 r/min，5 min），取上清液，20 μl进样，记录峰面积（A2）。将两者相比，即得QC样品的提取回收率。结果见表2。肌醇烟酸酯的平均提取回收率为96.18%，甲苯咪唑的平均提取回收率为90.65%，RSD均<15%，表明该提取方法具有较好的稳定性和重现性。
表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35 -
取低、高不同浓度的QC样品，按照“2.4”项下皮肤样品的处理方法操作，分别考察低、高2个浓度的QC样品在室温下放置12 h、−4 ℃放置12 h、反复冻融3次（−20 ℃）和冷冻贮存2周（−80 ℃）的稳定性。数据结果见表3。结果表明，各生物样品在上述条件下稳定性均良好。
表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69 -
采用DAS 2.0软件，以非房室模型分析待测物的药动学数据。皮肤中药物浓度数据以（mean±SD）表示，绘制了平均药物浓度时间曲线，各时间点含药浓度的计算分别伴随行标曲及QC。将给药后不同时间血药浓度和时间数据用DAS 2.0药动学软件处理，以统计矩方法计算药动学参数。详见图2和表4。
图 2 单次经皮给药后大鼠皮肤中肌醇烟酸酯药物浓度-时间曲线图（mean±SD, n=6）
表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437 -
本实验采用在体给药分时取样法，在不同时间点取皮制备成匀浆测定皮肤中药物浓度。该方法线性关系良好、所测匀浆样品的精密度、准确度等方法学均符合生物样品定量分析要求，其专属性强、灵敏度高、简便、快速高效，可以用于大鼠皮肤中IN的含量测定，对IN在体皮肤浓度测定以及相关药理研究有一定的参考价值。由上述结果可知，IN能迅速渗透进入皮肤，并能长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。HPLC分析方法快速、准确、回收率高、重现性好，可成功的用于测定GJR中IN在皮肤中的含量，表明在体给药分时取样法能较好地反映药物在大鼠体内的经皮代谢过程，适用于临床前外用药物的皮肤药动学筛选与评价，为临床用药方案的确定提供参考。
Skin pharmacokinetics of inositol nicotinate in heparin sodium inositol nicotinate cream
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摘要:
目的 建立HPLC法测定大鼠皮肤中肌醇烟酸酯（IN）的浓度，并研究肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学特征。 方法 采用HPLC法建立简便快速的测定给药后不同时间点大鼠皮肤中IN浓度的分析方法，并用建立的方法开展肝素钠肌醇烟酸酯乳膏在大鼠经皮给药后IN的药动学研究，采用DAS软件拟合药物动力学参数。 结果 该分析方法在0.25 ~ 20 μg/ml浓度范围内线性良好，定量限为0.25 μg/ml，平均加样回收率为96.18%。肝素钠肌醇烟酸酯乳膏皮肤给药后IN的药动学参数t1/2 为（4.555±2.054） h、Tmax为（6±0） h、Cmax为（16.929±2.153） mg/L、AUC0−t为（150.665±16.568） mg·h /L、AUC0−∞为（161.074±23.917） mg·h /L、MRT（0−t）为（9.044±0.618） h、MRT（0−∞）为（10.444±1.91） h、CLz/F 为（0.19±0.03） L/（h·kg）、Vz/F 为（1.190±0.437） L/（h·kg）。 结论 IN能迅速渗透进入皮肤，并能够长时间蓄积在皮肤局部，有利于IN在病变部位长时间发挥药效。该方法简便、快速、专属性强、重复性好，可应用于大鼠腹部皮肤给药后IN的药动学研究。 -
关键词:
- 肝素钠肌醇烟酸酯乳膏 /
- 皮肤药动学 /
- 肌醇烟酸酯
Abstract:Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of inositol nicotinate（IN） in rat skin, and study the pharmacokinetic characteristics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats. Methods HPLC method was used to establish a simple and rapid analytical method for the determination of IN concentration in the skin of rats at different time points after administration. The established method was used to study the pharmacokinetics of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats, and the pharmacokinetic parameters were fitted with DAS software. Results The linearity of the analytical method was good in the concentration range of 0.25-20 μg/ml, the quantitative limit was 0.25 μg/ml, and the average recovery rate was 96.18%. The pharmacokinetic parameters of IN after transdermal administration of heparin sodium inositol nicotinate cream in rats were as follows: t1/2 was （4.555±2.054） h, Tmax was （6±0）h, Cmax was （16.929±2.153）mg/L, AUC0−t was （150.665±16.568） mg·h /L ,AUC0−∞ was （161.074±23.917） mg·h /L, MRT（0−t） was （9.044±0.618）h, MRT（0−∞） was （10.444±1.91） h, CLz/F was （0.19±0.03） L/（h·kg）, and Vz/F was （1.19±0.437） L/（h·kg）. Conclusion IN could quickly penetrate the skin and accumulate in the skin for a long time, which was beneficial to the pharmacological action of drugs on the lesion site for a long time. The method is simple, rapid, specific and reproducible, which could be successfully applied to the pharmacokinetic study of IN after transdermal administration in rats. -
盐酸普萘洛尔（propranolol hydrochloride，PPL）是治疗婴幼儿血管瘤的一线和首选药物[1]。口服盐酸普萘洛尔疗效确切，但其存在首过效应强、生物利用度低、半衰期短等问题，且不良反应发生率高[2]。普通盐酸普萘洛尔外用制剂只对浅表型血管瘤有效，对深部型和复合型血管瘤的治疗仍需结合口服给药。诸多研究表明，立方液晶（cubosomes，Cubs）可显著提高经皮给药制剂的皮肤渗透性，且能提高其在皮肤尤其是皮肤真皮层的药物滞留量，有望能提高盐酸普萘洛尔外用制剂对深部型和复合型血管瘤的疗效[3~5]。因此，课题组拟基于立方液晶载药技术将盐酸普萘洛尔制备成一种纳米经皮给药制剂，以期能降低或避免口服给药带来的高不良反应发生率，提高盐酸普萘洛尔的治疗效果和患者依从性。前期实验中，课题组筛选了盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒（PPL-Cubs）的制备方法，并通过单因素考察结合星点设计效应面法优化了其最佳处方和制备工艺，结果制得的PPL-Cubs包封率低（约50%），远低于药典规定的80%。立方液晶为多层囊泡结构，类似于多囊脂质体，其可能与脂质体同样存在对水溶性化合物包封率较低的问题。鉴于前期研究表明，盐酸普萘洛尔在不同pH磷酸盐缓冲液下的溶解度存在极大差异，因此，本研究拟在立方液晶常规制备的基础上，引入“pH梯度法”的载药思路，制备PPL-Cubs，以期提高其包封率。
1. 仪器与试药
1.1 仪器
岛津LC-20AD型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；DV215CD型分析天平（美国奥豪斯公司）；AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；DF-101B集热式恒温加热磁力搅拌器（郑州长城科工贸有限公司）；高压均质机（意大利NIRO-SAVI S.P.A.公司）；NICOMP 380 ZLS激光粒度测定仪（美国PSS粒度仪公司）；超滤离心管（100KD，Millipore）。
1.2 试药
盐酸普萘洛尔（含量99.9%，常州亚邦制药有限公司）；单油酸甘油酯（法国GATTEFOSSé公司）；泊洛沙姆407（德国BASF公司）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
2. 方法与结果
2.1 包封率的测定
取PPL-Cubs适量，装入超滤离心管中，于4000 r/min离心10 min，收集离心液，采用课题组前期建立的盐酸普萘洛尔含量测定方法测定离心液中游离药物浓度C游离；取未透析的PPL-Cubs，测定药物浓度C总；根据公式EE（%）=[(C总−C游离)/ C总]×100%计算PPL-Cubs的包封率。
2.2 PPL-Cubs的制备
2.2.1 注入法
精密称取单油酸甘油酯9 g和泊洛沙姆407 1.5 g，加入10 ml无水乙醇，20 ℃水浴下搅拌溶解，为A相；精密称取盐酸普萘洛尔3.5 g，加入86 g纯化水，20 ℃水浴下搅拌溶解，为B相。于20 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢地滴加至B相中，待磁力搅拌1 h后加入适量纯化水使总质量为100 g，再在800 bar压力下高压均质7次，得PPL-Cubs。
2.2.2 pH梯度法
精密称取单油酸甘油酯适量，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407适量，加入适量纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至酸性，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，得空白立方液晶纳米粒粗品；取空白立方液晶纳米粒粗品，高压均质数次，得空白立方液晶纳米粒（B-Cubs）。取盐酸普萘洛尔溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入一定比例的B-Cubs中，搅拌均匀，并用氢氧化钠溶液调节pH至一定值，于一定温度下持续搅拌一定时间，再放置至室温，即得PPL-Cubs。
2.3 B-Cubs的制备工艺优化
前期试验结果表明，磁力搅拌速度、时间、温度、内水相pH值对B-Cubs的粒径基本无影响，高压均质压力及均质次数是影响其粒径的主要因素，故拟进一步优化高压均质压力和均质次数。
2.3.1 高压均质压力的考察
按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在400、600、800、900、1000 bar下高压均质7次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表1）。结果表明，随高压均质压力的提高，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质压力≥900 bar时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质压力为900 bar。
表 1 高压均质压力的考察（n=3）压力（bar） 粒径（nm） 多分散指数 400 169.1±3.5 0.189±0.056 600 129.9±3.2 0.172±0.062 800 110.9±2.7 0.126±0.041 900 97.9±2.1 0.073±0.016 1000 96.4±1.9 0.057±0.009 2.3.2 高压均质次数的考察
按照“2.2.2”项下方法，取空白立方液晶纳米粒粗品，分别在900 bar下高压均质3、5、7、9次，测定制得B-Cubs的粒径及多分散指数（见表2）。结果表明，随高压均质次数的增加，制得B-Cubs的粒径和多分散指数均逐渐减小，当均质次数≥7次时，B-Cubs的粒径和多分散指数变化较小，故确定高压均质次数为7次。
表 2 高压均质次数的考察（n=3）次数（次） 粒径（nm） 多分散指数 3 160.4±4.6 0.173±0.052 5 129.2±3.8 0.140±0.037 7 97.9±2.1 0.073±0.016 9 93.3±1.7 0.067±0.011 2.4 B-Cubs的处方优化
2.4.1 单油酸甘油酯用量的考察
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定泊洛沙姆407用量为5%，内水相pH为3.0，考察单油酸甘油酯用量（15%、20%、25%、30%、35%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表3）。结果表明，随单油酸甘油酯用量的增加，制得的B-Cubs粒径呈先减小后增大趋势，多分散指数则不断降低，当单油酸甘油酯用量为25%时，制得的B-Cubs具有最小的粒径和较适宜的多分散指数，故确定单油酸甘油酯用量为25%。
表 3 单油酸甘油酯用量的考察（n=3）用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 137.8±3.4 0.160±0.033 20 119.2±2.9 0.147±0.032 25 97.9±2.1 0.073±0.016 30 118.3±3.5 0.024±0.015 35 150.8±5.4 0.026±0.011 2.4.2 泊洛沙姆407用量的考察
基于优化的B-Cubs最佳制备工艺，按照“2.2.2”项下方法，固定单油酸甘油酯用量为25%，内水相pH为3.0，考察泊洛沙姆407用量（3%、4%、5%、6%、7%）对制得B-Cubs粒径及多分散指数的影响（见表4）。结果表明，制得的B-Cubs粒径随泊洛沙姆407用量的增加逐渐降低，多分散指数变化无明显规律，但均较小（<0.1）；当泊洛沙姆407用量≥5%时，粒径变化幅度降低，故确定泊洛沙姆407用量为5%。
表 4 泊洛沙姆407用量的考察（n=3）用量（%） 粒径（nm） 多分散指数 3 143.6±3.5 0.064±0.019 4 116.7±3.2 0.055±0.015 5 97.9±2.1 0.073±0.016 6 91.3±1.9 0.052±0.015 7 83.2±1.8 0.062±0.021 2.5 PPL-Cubs的包封率影响因素考察
2.5.1 外水相pH值的考察
根据前期盐酸普萘洛尔在不同pH的PBS中溶解度测定结果可知（见表5），盐酸普萘洛尔在pH≥8.5时溶解度显著下降。按照“2.2.2”项下方法，制备内水相pH为3.0的B-Cubs，并按载体/药物比（以单油酸甘油酯/盐酸普萘洛尔计）为6∶1的比例与B-Cubs和盐酸普萘洛尔水溶液进行混合，以10%氢氧化钠溶液分别调节外水相pH至7.5、8.0、8.5、9.0，于20 ℃水浴（载药温度）下600 r/min磁力搅拌15 min（载药时间），制得PPL-Cubs中药物浓度为1%，测定对包封率等参数影响（见表6）。结果表明，PPL-Cubs的包封率随外水相pH值的提高逐渐增加，当外水相pH值≥8.5时，包封率增加趋势渐小；外水相pH值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 5 盐酸普萘洛尔在不同pH PBS中的溶解度（n=3）pH 溶解度（mg/ml） 4.5 53.50±4.22 5.5 51.70±2.34 6.5 52.60±1.53 7.5 49.80±2.14 8.5 8.50±1.15 9.5 1.41±0.33 10.5 0.87±0.08 表 6 外水相pH值的考察（n=3）pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 7.5 71.29±2.58 96.8±2.6 0.063±0.012 8.0 86.24±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 8.5 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 9.0 94.58±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 2.5.2 内水相pH值的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察内水相pH（3.0、4.0、5.0、6.0）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表7）。结果表明，不同内水相pH的B-Cubs对制得的PPL-Cubs包封率无明显差异，对PPL-Cubs的粒径和多分散指数亦无明显影响。
表 7 内水相pH值的考察（n=3）pH EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 3.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 4.0 91.85±1.05 97.5±2.3 0.054±0.006 5.0 91.62±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 6.0 89.33±1.57 97.6±1.7 0.051±0.006 2.5.3 载体/药物的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载体/药物（5∶1、6∶1、7∶1、8∶1）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表8）。结果表明，当载体/药物≥6时，PPL-Cubs的包封率不再增加；载体/药物比值对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 8 载体/药物的考察（n=3）载体/药物 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 5∶1 90.93±1.52 98.5±2.7 0.076±0.015 6∶1 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 7∶1 92.06±2.37 97.5±2.1 0.077±0.015 8∶1 92.41±2.58 98.1±2.4 0.102±0.025 2.5.4 载药温度的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药温度（20、30、40、50 ℃）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表9）。结果表明，载药温度对PPL-Cubs的包封率、粒径和多分散指数无明显影响。
表 9 载药温度的考察（n=3）载药温度（℃） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 20 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 91.05±1.95 96.9±2.3 0.068±0.021 40 91.38±2.08 97.1±2.6 0.066±0.012 50 90.55±1.75 97.2±2.1 0.053±0.018 2.5.5 载药时间的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5时，分别考察载药时间（15、30、45、60 min）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表10）。结果表明，载药时间对PPL-Cubs的粒径和多分散指数无明显影响。
表 10 载药时间的考察（n=3）载药时间（min） EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 15 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 30 92.09±1.54 97.2±2.4 0.071±0.013 45 92.01±2.01 97.5±1.6 0.065±0.024 60 91.86±1.86 98.1±1.9 0.075±0.026 2.5.6 B-Cubs粒径和多分散指数的考察
通过调整高压均质压力，制备不同粒径B-Cubs。按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察B-Cubs粒径和多分散指数对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表11）。结果表明，B-Cubs的粒径和多分散指数不影响所制得PPL-Cubs的包封率，但B-Cubs的粒径和多分散指数基本决定了制得PPL-Cubs的粒径和多分散指数。
表 11 B-Cubs粒径和多分散指数的考察（n=3）载体 EE（%） PPL-Cubs 粒径（nm） 多分散指数 粒径（nm） 多分散指数 97.9±2.1 0.073±0.016 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 129.2±3.8 0.140±0.037 91.87±1.96 128.5±2.1 0.123±0.021 160.4±4.6 0.173±0.052 91.85±2.13 158.2±2.8 0.152±0.037 210.5±5.9 0.182±0.057 91.25±2.53 209.2±2.9 0.174±0.045 2.5.7 PPL-Cubs药物浓度的考察
按照“2.5.1”项下方法，固定外水相pH为8.5，分别考察药物浓度（0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）对制得PPL-Cubs包封率等参数的影响（见表12）。结果表明，随着PPL-Cubs中药物浓度的提高，包封率呈逐渐增加趋势，当药物浓度≥1%时，包封率增加趋势变慢。
表 12 PPL-Cubs中药物浓度的考察（n=3）浓度 EE（%） 粒径（nm） 多分散指数 0.1 51.83±3.17 97.2±2.4 0.057±0.013 0.5 81.87±2.12 96.3±2.1 0.062±0.012 1.0 92.55±1.27 96.3±1.9 0.045±0.005 2.0 94.42±1.37 96.3±1.9 0.045±0.005 3.0 95.87±1.28 97.8±2.5 0.042±0.007 2.6 pH梯度法制备PPL-Cubs的最优处方及制备工艺
精密称取单油酸甘油酯25.0 g，40 ℃水浴加热使融化，为A相；精密称取泊洛沙姆407 5.0 g，加入70 g纯化水，40 ℃水浴加热使溶解，并用1%磷酸溶液调节pH至3.0，为B相；于40 ℃水浴及600 r/min搅拌速度下，将A相缓慢滴加到B相中，待磁力搅拌30 min后，再在900 bar下高压均质7次，得B-Cubs。取盐酸普萘洛尔1 g，溶解于适量纯化水中，得盐酸普萘洛尔水溶液；将盐酸普萘洛尔水溶液加入24 g B-Cubs中，搅拌均匀，用10%氢氧化钠溶液调节pH至8.5，于20 ℃水浴持续搅拌15 min，再放置至室温，即得PPL-Cubs
3. 讨论
立方液晶纳米粒常用的制备方法包括注入法、熔融-分散法、热处理法、喷雾干燥法等[6]。试验前期以粒径、包封率等为评价指标筛选了最佳制备方法为注入法，并优化了其最佳处方制备工艺，结果制得的载药立方液晶纳米粒包封率较低（约50%）[7]。立方液晶是两亲性脂质分子分散在过量水中形成的含双连续水区和闭合脂质双分子层的蜂窝状液晶结构；水溶性分子被包封于立方液晶水道中，脂溶性分子被包封于脂质双层膜中，两亲性分子则贯穿其中。盐酸普萘洛尔在酸性环境下具有较高的溶解性，常规方法制得的盐酸普萘洛尔立方液晶纳米粒pH约为3.5，如何让其具有进入立方液晶载体内相的“动力”是提高载药立方液晶纳米粒包封率的关键。因此，本研究引入“pH梯度法”，通过创造高溶解度内环境（低pH值内水相）和低溶解度外环境（高pH值外水相），给盐酸普萘洛尔提供进入立方液晶载体内相的“动力”。离子化的盐酸普萘洛尔在调节pH的过程中逐渐变为分子形态的普萘洛尔而进入脂质区，脂质区的普萘洛尔分子接触内水相酸性环境而被离子化，内水相中离子化的盐酸普萘洛尔无法再通过脂质区而被捕获于内水相。结果表明，pH梯度法显著提高了PPL-Cubs的包封率，包封率达到90%。
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图 1 专属性HPLC图谱
A. 空白皮肤（涂抹空白基质乳膏）溶液；B. 空白皮肤溶液+肌醇烟酸酯+甲苯咪唑对照品溶液； C.含药皮肤样品溶液（涂抹6 h后）；1. 肌醇烟酸酯；2. 甲苯咪唑
表 1 肌醇烟酸酯在皮肤样品中的精密度和准确度（n=6）
质量浓度
（ρB/μg·ml−1）日内精密度 日间精密度 实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）实测浓度
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）RE
（%）0.25 0.24±0.020 8.20 −3.44 0.24±0.025 10.38 −3.18 0.5 0.50±0.042 8.53 −0.87 0.51±0.039 7.65 1.61 2.5 2.37±0.068 2.85 −5.25 2.33±0.12 5.15 −7.00 15 14.67±0.66 4.49 −2.22 13.99±0.85 6.07 −6.73 
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表 2 样品提取回收率考察结果（n=6）
成分 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）回收率（ % ） mean±SD RSD（ % ） 肌醇烟酸酯 0.5 94.26±4.11 4.36 2.5 96.76±5.02 5.19 15 97.52±2.20 2.26 甲苯咪唑 1.70 90.65±3.17 4.35
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表 3 肌醇烟酸酯在不同贮存条件下的稳定性（n=3）
稳定性条件 质量浓度
（ρB/μg·ml−1）实测值
（ρB/μg·ml−1）RSD
（%）室温下放置12 h 0.5 0.47±0.037 7.94 15 14.56±0.63 4.36 −4 ℃乙腈中放置12 h 0.5 0.46±0.034 7.40 15 16.71±0.50 3.03 −20 ℃反复冻融3次 0.5 0.50±0.019 3.75 15 16.73±0.16 0.96 −80 ℃冷冻贮存2周 0.5 0.47±0.038 8.24 15 13.21±0.75 5.69
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表 4 大鼠经皮给药后肌醇烟酸酯的主要药动学参数（mean±SD, n=6）
统计矩参数 单位 肌醇烟酸酯参数值 t1/2 h 4.555±2.054 Tmax h 6±0 Cmax mg/L 16.929±2.153 AUC0-t mg·h /L 150.665±16.568 AUC0-∞ mg·h /L 161.074±23.917 MRT（0−t） h 9.044±0.618 MRT（0−∞） h 10.444±1.91 CLz/F L/（h·kg） 0.19±0.03 Vz/F L/（h·kg） 1.19±0.437
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