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苯磺酸顺阿曲库铵为临床常用的中长效肌肉松弛药，苏醒期药物在体内的残留导致残余肌松的发生，成为导致麻醉后发生呼吸系统不良事件的主要原因，尤其是老年患者，术后残留会带来更严重的不良后果[1]，因此对老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的残留进行监测有重要意义。苯磺酸顺阿曲库铵易发生霍夫曼降解，温度和pH值的升高会加速降解[2]，因此，临床收集的血浆样本的稳定保存至关重要。本研究在既往文献报道的HPLC法及高效液相色谱-质谱（LC-MS）法[3-6]基础上，开发了一种用灵敏、准确、高效的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）测定人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度的方法，有效避免了苯磺酸顺阿曲库铵的降解，对老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度随时间变化的规律进行研究，探讨自体血回输对患者体内苯磺酸顺阿曲库铵浓度的影响。
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Agilent 1290 UPLC超高效液相色谱（安捷伦，美国）；Agilent 6470三重四极杆质谱，配备AJS-ESI喷射流电喷雾离子源（安捷伦，美国）；SECURA125-1CN型电子天平（赛多利斯，德国）；Arium® mini 超纯水机（赛多利斯，德国）。
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苯磺酸顺阿曲库铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号101170-201902，纯度>98%）；内标维库溴铵对照品（中国食品药品检定研究院，批号100813-201603，纯度>99%）；甲酸、乙酸铵为色谱纯（麦克林，中国）；乙腈为质谱纯（霍尼韦尔，美国）；水为超纯水。
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色谱柱为SHISEIDO（资生堂）ADME（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），柱温35 ℃；流动相系统以含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液为A相，以乙腈溶液为B相，等度洗脱，A∶B=30∶70（V/V），流速：0.35 ml/min；进样量2 μl，分析时间3 min。
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选择AJS-ESI离子源正离子模式，离子源参数设置：雾化器压力40 psi；干燥气流速11 L/min；干燥气温度350 ℃；鞘气流速11 L/min；鞘气温度350 ℃；毛细管电压4 000 V。
多重反应监测（MRM）参数：苯磺酸顺阿曲库铵464.3→358.2（m/z），碎片电压135 V，碰撞能量20 eV，保留时间为2.05 min；维库溴铵（IS）557.4→356.3（m/z），碎片电压135 V，碰撞能量35 eV，保留时间为1.86 min。
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取苯磺酸顺阿曲库铵对照品约1.5 mg，精密称定，置于2 ml棕色称量瓶中，精密加入含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解并涡旋混匀，配成浓度为1.0 mg/ml的储备液；取上述储备液适量，用含0.1%甲酸的乙腈溶液按比例逐级稀释，配成浓度为400~100 000 ng/ml的标准溶液，置于4 ℃冰箱备用。
同法配制浓度为800、40 000、80 000 ng/ml的质控溶液，置于4 ℃冰箱备用。
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取维库溴铵对照品约1.5 mg，精密称定，置于2 ml棕色称量瓶中，精密加入含0.1%甲酸的乙腈溶液溶解并涡旋混匀，配成浓度为1.0 mg/ml的内标储备液；取上述储备液用含0.1%甲酸的乙腈溶液稀释为500 ng/ml的内标标准溶液，置于4 ℃冰箱备用。
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精密吸取空白人血浆与不同浓度的苯磺酸顺阿曲库铵标准溶液，配制为浓度为20、50、100、250、500、1 000、2 500、5 000 ng/ml的苯磺酸顺阿曲库铵模拟标准曲线样品。同法配制浓度为40、2 000、4 000 ng/ml的质控样品。
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取血浆样品50 µl，加入50 µl的维库溴铵内标标准溶液、400 µl的含0.1%甲酸的乙腈溶液，涡旋1 min， 13 000 r/min（5 ℃）离心5 min，取上清液100 µl进样。
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该临床试验经上海市浦东新区公利医院医学伦理委员会审批同意，批件号：（2020）临审第（018）号。选取老年脊柱手术患者给予咪达唑仑0.05 mg/kg，丙泊酚1.5 mg/kg、舒芬太尼0.5 μg/kg、苯磺酸顺阿曲库铵0.2 mg/kg麻醉诱导；诱导后进行急性等容性血液稀释（ANH），采集总血容量的10% 血液冷藏保存于ACD储血袋中；术中丙泊酚2.5 μg/ml、瑞芬太尼0.1~0.2 μg/(kg·min)、苯磺酸顺阿曲库铵2.0 μg/(kg·min)维持麻醉，于手术主要步骤完成后停止泵注苯磺酸顺阿曲库铵并回输采集的自体血液。收集麻醉诱导结束（T1）、术毕（T2）、术毕0.5 h（T3）、术毕1 h（T4）、回输时刻ACD血袋（LT）的血样各5 ml，于3 000 r/min离心5 min，分离得血浆，精密吸取1 ml血浆置于事先加入100 µl的2%甲酸水溶液的冻存管中，振摇10 s混合后，于−80 ℃冰箱保存。
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取空白人血浆样品、模拟血浆样品（苯磺酸顺阿曲库铵浓度为5 000 ng/ml）以及手术中采集的人血浆样品，分别按“2.1.4”项下进行血浆样品前处理后进样，获得相应的零点样品、模拟样品及人血浆样品的色谱图；空白人血浆样品处理时以含0.1%甲酸的乙腈溶液代替内标溶液，获得双空白样品的色谱图。结果表明该方法选择性良好，见图1。
图 1 人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵及内标维库溴铵典型色谱图
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以血浆中苯磺酸顺阿曲库铵浓度为X，苯磺酸顺阿曲库铵与维库溴铵的峰面积比值为Y，用1/X权重求得回归方程：Y=0.002 6 X+0.010 9，（r=0.999 7），表明在20～5 000 ng/ml范围内线性关系良好。
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通过在定量上限样品（浓度为5 000 ng/ml）之后立即进样分析双空白样品来评估系统残留。结果显示双空白样品中苯磺酸顺阿曲库铵的峰面积不超过该分析批定量下限样品待测物峰面积的20.0%，内标维库溴铵的峰面积不超过该分析批标准曲线内标最小峰面积的5.0%，表明该方法的残留效应不影响测定。
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进样分析低、中、高3个浓度（40、2 000、4 000 ng/ml）的质控样品，每个浓度平行操作6份，连续分析3 d，计算批内、批间的精密度（RSD）及准确度（RE），结果表明批内和批间的RSD<10%，RE<±10%，见表1。
表 1 苯磺酸顺阿曲库铵精密度和准确度考察结果
浓度(ng/ml) 批内（n=6） 批间（n=18） 精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）40 3.10 1.34 7.66 −7.67 2 000 8.27 −5.98 5.23 −7.75 4 000 6.47 4.62 9.34 −5.17 -
配制两种溶液，其中苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的浓度均与低、中、高浓度质控样品处理后的浓度一致：①将6个不同来源的空白人血浆按“2.3.1”项下处理为双空白样品后，加入苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵对照品溶液；②配制两者的对照品溶液。分别记录两种溶液分析后苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的峰面积，以峰面积的比值计算内标归一化的基质效应。
再配制2种溶液：①将低、中、高3个浓度水平的质控样品按“2.1.4”项下处理；②将单一来源的空白人血浆按“2.3.1”项下处理为双空白样品后，加入苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵对照品溶液，使两者浓度均与低、中、高浓度质控样品处理后的浓度一致。分别记录两种溶液分析后苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的的峰面积，以峰面积的比值计算提取回收率。
结果表明，低、中、高浓度的基质效应影响一致，RSD为5.81%，基质效应和提取回收率的考察结果见表2。
表 2 苯磺酸顺阿曲库铵基质效应和提取回收率考察结果
品名 浓度
（ng/ml）内标归一化的
基质效应（%）提取回收率
（%）苯磺酸顺阿曲库铵 40 71.88 83.62 2 000 77.67 83.40 4 000 80.64 88.87 维库溴铵 125.91 -
将新鲜配制的苯磺酸顺阿曲库铵和维库溴铵的储备液（浓度均为1.0 mg/ml）于4 ℃冰箱中放置28 d，以峰面积的偏差考察其稳定性，结果显示苯磺酸顺阿曲库铵峰面积的偏差为−4.37%，维库溴铵峰面积的偏差为4.75%，表明待测物和内标的储备液稳定性良好。再考察低、中、高3个浓度水平的质控样品（浓度为40、2 000、4 000 ng/ml），室温下放置3 h后处理、处理后在自动进样器（4 ℃）放置24 h、反复冻融3次、−80 ℃冰箱中放置30 d的稳定性，每个浓度平行操作6份，结果见表3。
表 3 血浆样品稳定性考察结果
浓度
(ng/ml)室温（n=6） 进样器（n=6） 冻融（n=18） 长期（n=6） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 40 6.23 7.30 6.75 −1.86 3.89 −2.19 2.23 8.24 2 000 1.38 0.33 2.57 −7.87 4.72 −8.99 3.62 −12.62 4 000 6.75 −2.25 2.40 −6.04 4.38 −10.96 3.48 −10.89 -
研究纳入8名老年患者，受试者1～4诱导后进行ANH，受试者5～8未进行ANH。采用建立的方法测定临床采集的血浆样本的浓度，结果见表4。
表 4 血浆样品中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定结果（ng/ml）
时间点（t/h） 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 受试者7 受试者8 T1 332.0 362.3 556.8 388.9 289.5 328.1 359.9 348.3 T2 228.4 190.9 363.6 205.9 65.71 180.3 170.1 158.5 T3 81.66 99.30 174.4 145.9 41.60 68.56 73.07 61.64 T4 50.11 58.34 125.9 84.42 24.72 35.21 40.14 34.22 LT 270.8 338.0 489.9 316.3 -
既往文献报道的苯磺酸顺阿曲库铵血药浓度的检测方法主要有HPLC法及LC-MS法，但往往需要经过真空离心浓缩或氮吹浓缩等较为复杂的样本前处理方法或经梯度洗脱而分析时间较长[3-6]。本研究在此基础上，开发了UPLC-MS/MS检测方法，优化了前处理方法，采用蛋白沉淀法，操作简便，基质效应和提取回收率满足方法学要求；同时筛选了不同的流动相，最终确定含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液∶乙腈（30∶70，V/V）等度洗脱，使苯磺酸顺阿曲库铵的离子化程度达到最优，方法验证结果显示该方法的精密度和准确度符合生物样本的分析要求。
苯磺酸顺阿曲库铵易发生霍夫曼降解而消除，温度和pH值的升高会加速其降解[2]，如不加入酸调节pH值，即使在−80 ℃的储存条件下，其仍会很快降解。本研究中，经过对不同浓度甲酸溶液的考察，最终确定标准品的配制溶剂与蛋白沉淀剂均使用含0.1%甲酸的乙腈溶液、血浆样品的收集过程中加入含2%甲酸的水溶液，稳定性研究显示储备液可在4 ℃稳定储存28 d（RE=−4.37%），血浆样本可在−80 ℃稳定储存30 d（低浓度RE=8.24%，中浓度RE=−12.62%，高浓度RE=−10.89%），有效避免了苯磺酸顺阿曲库铵的降解。
残余肌松导致患者出现主观不适，导致低氧或高二氧化碳血症、咽部肌肉无力，严重的出现上呼吸道梗阻影响患者生命安全[7]。国内一项多中心的纳入1 571例腹部手术患者的研究提示，术后肌松残余率高达52.8%[8]，而国外一项使用新斯的明拮抗残余肌松的研究显示，拮抗后仍有63.5%的患者在拔除气管导管时存在残余肌松[9]。ANH常规在麻醉诱导后采集稀释血液，所以其中含有一定量的麻醉药物，本研究中亦检测到离体自体血在回输时刻血袋内含有较高浓度的苯磺酸顺阿曲库铵。回输采集自体血后，患者体内苯磺酸顺阿曲库铵浓度较未进行ANH自体血回输的患者浓度下降缓慢，存在残余肌松的风险。尹磊等[10]研究亦显示，针对老年患者在术毕回输ANH采集自体血存在肌松恢复延迟的现象。因此，针对ANH回输自体血的患者，有必要监测苯磺酸顺阿曲库铵的血浆药物浓度，避免围术期不良事件发生。而本研究建立的检测方法有效、稳定，可以用于临床监测苯磺酸顺阿曲库铵的浓度。
Monitoring of residual cisatracurium besylate in elderly patients plasma at post operation by UPLC-MS/MS
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摘要:
目的 建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的含量，并应用于临床治疗中监测老年患者手术后血浆中的药物残留。 方法 样品经含0.1%甲酸的乙腈溶液蛋白沉淀处理后，采用SHISEIDO（资生堂）ADME（3.0 mm×100 mm，2.7 μm）色谱柱，流动相以含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈溶液（30 : 70，V/V），等度洗脱。质谱检测选择AJS-ESI离子源正离子模式，多反应监测（MRM）检测离子对为：苯磺酸顺阿曲库铵464.3→358.2（m/z）、维库溴铵（IS）557.4→356.3（m/z）。收集老年脊柱手术患者麻醉诱导后、手术结束、术后0.5 h、术后1 h以及自体血回输时刻血袋内的血浆样品，于事先加入2%甲酸水溶液的冻存管中保存，测定样本中的苯磺酸顺阿曲库铵的含量，评估自体血回输对老年患者术后血浆苯磺酸顺阿曲库铵浓度的影响。 结果 人血浆中苯磺酸顺阿曲库铵在20~5 000 ng/ml范围内线性良好，r=0.999 7；批内和批间的精密度RSD<10%、准确度RE<±10%；低中高3个浓度的基质效应为71.88%~80.64%、提取回收率为83.62%~88.87%，内标维库溴铵的提取回收率为125.91%，符合方法学要求。老年患者手术后血浆中有一定程度残留的苯磺酸顺阿曲库铵，需严格掌握拔管时间，适当延长患者在麻醉复苏室的停留时间。 结论 该方法灵敏、准确、高效，适用于临床治疗中老年患者手术后血浆中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定。 -
关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱 /
- 苯磺酸顺阿曲库铵 /
- 含量测定 /
- 残余肌松
Abstract:Objective To establish a method for the determination of cisatracurium besylate in human plasma by UPLC-MS/MS which could be used in the monitoring of drug residual in plasma of elderly patients after operation. Methods The samples were precipitated with 0.1% formic acid-acetonitrile solution and separated by an SHISEIDO ADME column(3.0 mm×100 mm, 2.7 μm) for isocratic elution with the mobile phase of water containing 0.1% formic acid with 2 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile (30 : 70, V/V). MS condition was optimized in the positive ion detection mode by multiple reaction monitoring (MRM), along with the Agilent jet stream electrospray source interface (AJS-ESI). The precursors to the product ion transitions were m/z 464.3→358.2 for cisatracurium besylate and m/z 557.4→356.3 for vecuronium bromide (the internal standard, IS). Plasma samples of elderly patients undergoing spinal surgery were collected after anesthesia induction, at the end of surgery, 0.5 h and 1 h after surgery, and from the blood bags while autologous blood transfusion, and stored in cryopreservation tubes with 2% formic acid solution. Then the contents of cisatracurium besylate were determined. The effects of autogenous blood transfusion on plasma concentration of cisatracurium besylate in elderly patients after surgery evaluated. Results The calibration curve was linear in the range of 20-5 000 ng/ml for cisatracurium besylate in human plasma, r=0.999 7. The intra-day and inter-day precision and accuracy were good (RSD<10%, RE<±10%). The matrix effect of different concentrations was 71.88%~80.64%. The recovery of different concentrations was 83.62%~88.87%. The recovery of vecuronium bromide (IS) was 125.91%, which conformed with the requirement of methodological validation. There was a certain degree of residual cisatracurium besylate in the plasma of elderly patients, so the extubation time should be strictly controlled and the stay time of patients in the anesthesia recovery room should be appropriately extended. Conclusion The method is sensitive, accurate, and efficient, which could be used for the determination of cisatracurium besylate in human plasma of elderly patients after operation. -
Key words:
- UPLC-MS/MS /
- cisatracurium besylate /
- content determination /
- residual curarization
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心力衰竭，简称心衰，是由于心脏器质性或功能性异常导致的心室充盈或射血能力受损所引起的复杂临床综合征[1]。随着人口老龄化程度不断加深以及许多患者从急性心脏疾病中存活，慢性心衰的患者数呈现增长态势，尽管过去30年其生存率有了显著提高，但5年病死率仍约为50%[2, 3]。慢性心衰因其高发病率和高病死率，长期以来一直是社会的主要医疗负担[4]。慢性心衰主要表现为射血分数降低的心衰，其药物治疗主要包括血管紧张素转换酶抑制剂或血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、β受体阻滞剂、盐皮质激素受体拮抗剂、钠-葡萄糖协同转运体2抑制剂组成的四联疗法[5]。患者尤其是长期用药者，由于低血压、电解质紊乱等不良反应的影响，通常用药依从性欠佳。
传统中药在治疗心衰方面有着悠久的历史和独特的理论[6]，具有多靶点且成本较低等优势，如黄芪[7]。黄芪注射液是临床上治疗心衰的常用中药注射剂之一，疗效肯定[8]。大量研究已经证实了黄芪治疗心衰的有效性和安全性[9, 10]。黄芪甲苷是黄芪治疗心衰的主要活性成分[11]。但是，由于黄芪甲苷水溶性差，生物利用度极低，限制了黄芪甲苷药物制剂在临床上的转化[12, 13]。因此，黄芪甲苷可作为先导化合物，进行结构优化，既保持其原有的活性，又能增强其水溶性，以便增加生物利用度，充分发挥黄芪甲苷治疗心衰的作用。本研究主要从合成的系列水溶性黄芪甲苷衍生物中，筛选具有抗心衰效用的化合物，并初步探讨其对心肌重塑和心肌纤维化的改善作用，以期为临床提供抗心衰的候选新药。
1. 材料
1.1 动物
雄性C57BL/6小鼠150只，7~8周龄，体重为18~22 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证编号：20170012004976。动物实验严格遵守动物护理伦理指南进行操作，已通过海军军医大学动物实验伦理委员会批准。饲养环境为无特定病原体（SPF）环境，温度为（25±2 ）℃，每日光照12 h，昼夜循环，自由摄取标准饲料和饮用水。
1.2 试剂与材料
水溶性黄芪甲苷结构改造衍生物包括HHQ、HHQ12CS和HHQ18TC，HHQ进一步结构改造得到HHQ16和HHQ19，均由上海医药工业研究院孙青䶮教授提供。卡托普利、羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、异氟烷均购自国药集团。内源性过氧化物酶封闭液、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒、苏木素染色液购自碧云天公司。Masson复合染色试剂盒购自博谷德生物工程公司。Trizol试剂、逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix荧光定量试剂盒购自日本Takara公司。Target Retrieval Solution购自丹麦Dako公司。COL1、COL3抗体、TGF-β1抗体购自英国Abcam公司。αSMA抗体购自中国博奥森生物技术公司。
1.3 仪器
呼吸机（意大利UgoBasile公司）；麻醉剂（中国惠德万邦公司）；二维及M型超声（意大利EsaoteMyLab公司）；诊断仪及探头（意大利One/Touch公司）；光学显微镜（德国Leica公司）；病理切片机（中国辅光精密仪器公司）；包埋机（中国BIOBASE博科公司）；组织摊片机（中国湖北孝感安立信公司）；高通量组织研磨仪（中国上海必横生物公司）；PCR扩增仪（德国Eppendorf公司）；Stepone Plus实时荧光定量PCR仪（美国AB applied biosystems公司）。
2. 方法
2.1 左冠状动脉前降支（LAD）结扎心衰模型的建立
通过2.5%异氟烷麻醉小鼠，气管插管接入呼吸机保持麻醉状态。开胸暴露心脏，在左心耳下缘约1 mm处用线缝扎冠状动脉，缝合后，待小鼠恢复自主呼吸，饲养3~4周，通过心超检测慢性心衰模型，从中筛选慢性心衰造模成功的小鼠（EF<50%）。
2.2 分组及给药
首先对黄芪甲苷衍生物进行药效筛选。将LAD结扎造模成功后的小鼠随机分为模型组、卡托普利组、系列黄芪甲苷衍生物（HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC）组、假手术组，共6组。造模后4周使用0.5%CMC-Na溶液配制黄芪甲苷衍生物，并按照小鼠每10 g体重0.1 ml进行灌胃给药，黄芪甲苷衍生物组分别给予10 mg/kg的HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC，假手术组和模型组分别给予同等剂量的0.5%CMC-Na溶液，卡托普利组给予8.6 mg/kg卡托普利混悬液，每日给药1次，连续28 d。HHQ衍生物药效筛选分组同上，即造模成功的小鼠随机分为模型组、HHQ组、HHQ16组和HHQ19组、假手术组，一共5组。假手术组和模型组处理同上，HHQ衍生物组分别用10 mg/kg的HHQ、HHQ16、HHQ19灌胃，每日给药1次，连续28 d。
2.3 心脏超声检测心功能
通过吸入2.5%异氟烷气体麻醉小鼠，在检测过程中提供1.0%~1.5%浓度的异氟烷以维持麻醉状态。通过二维及M型超声诊断仪检测小鼠的心功能，筛选造模后的成功模型（EF<50%）以及评价给药后小鼠的心功能。主要检测指标有左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等参数。分别于给药18、28 d对各组小鼠进行心脏超声检测。
2.4 心脏形态学分析
对小鼠进行心脏超声检测之后称重，然后取心脏称重。计算心脏重量和体重的比值，即心体比（mg/g）。心脏标本用10%福尔马林固定24 h后，将心脏取出，排列整齐，拍照，观察心脏的大小和形态。取小鼠心脏组织于4%多聚甲醛中固定24 h后，常规石蜡包埋切片处理。用HE染色和Masson染色观察心脏大体形态及胶原形成。
2.5 实时荧光定量PCR
提取心肌组织总RNA，逆转录成cDNA，实时定量PCR体系包括：SYBR 10 μl，引物（上游引物和下游引物）1 μl，cDNA 3 μl，以及DEPC水7 μl，引物合成序列见表1。
表 1 引物合成序列名称 上游引物 下游引物 COL1A1 TAAGGGTCCCCAATGGTGAGA GGGTCCCTCGACTCCTACAT COL3A1 ACGTAGATGAATTGGGATGCAG GGGTTGGGGCAGTCTAGTG αSMA GGACGTACAACTGGTATTGTGC TCGGCAGTAGTCACGAAGGA TGF-β1 GAGCCCGAAGCGGACTACTA TGGTTTTCTCATAGATGGCGTTG Gapdh GTATGACTCCACTCACGGCAAA GGTCTCGCTCCTGGAAGATG 2.6 免疫组织化学染色
心脏组织于4%多聚甲醛组织固定液中固定。梯度乙醇脱水后将组织浸入热石蜡中，将浸好的石蜡放入包埋机中包埋。将组织进行横切后去石蜡，使用Target Retrieval Solution进行抗原修复操作。用内源性过氧化物酶封闭液消除内源性过氧化物酶的干扰。用1%牛血清白蛋白封闭，使用相应的特异性抗体进行染色，根据种属关系选择对应二抗染色。为了可视化染色，使用DAB显色，并用苏木素进行复染。
2.7 统计方法
实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。实验结果均采用均数±标准误（mean ± SEM）的方式呈现。两组样本之间的比较采用两独立样本t检验（t-test）；两组以上两两之间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或双因素重复方差分析（two-way ANOVA）。以P<0.05为差异有统计学意义。
3. 结果
3.1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
LVEF和LVFS是评价心衰的重要指标，心衰时LVEF和LVFS下降。如图1所示，阳性对照药卡托普利给药后增加18 d和28 d的LVEF和LVFS，以18 d最为显著，LVEF增长百分比为56%；黄芪甲苷衍生物HHQ、HHQ12CS、HHQ18TC均增加LVEF和LVFS，且呈时间依赖性，增强效果在3种药物之间无显著差异。以HHQ为例，LVEF增长百分比在18 d为61%，28 d为71%，优于同期的卡托普利。结合3种药物的合成难易性、稳定性、水溶性和药动学参数（数据在此不展示），HHQ可以作为进一步优化的候选化合物。
图 1 系列黄芪甲苷衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=5~9）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001, 与0 d比较。3.2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响
对上述筛选出来的HHQ药物进一步衍生化，使其具有更好的合成路线、稳定性、水溶性和药动学参数（数据不展示）。进一步以HHQ为对照，对其衍生物HHQ16和HHQ19进行药效评估。如图2所示，给药28 d，HHQ衍生物均能使得心衰小鼠的LVEF%和LVFS%升高，其中，HHQ16升高LVEF%的百分比为104%，HHQ19升高LVEF%的百分比为171%（图2A、图2B）；而HHQ升高LVEF%的百分比为99%。但HHQ19显著增加心率（HR）（图2C），而HR增加会导致心肌耗氧量增加，增加死亡率[14]。因此，3种HHQ衍生物均能提升心衰小鼠的心功能，综合上述因素，选择HHQ16为最优候选化合物。
图 2 HHQ衍生物对慢性心衰小鼠心功能的影响（n=7~10）A.左室射血分数（LVEF，%）；B.左室短轴缩短率（LVFS，%）；C.心率（HR）**P<0.01，***P<0.001，与0 d比较。3.3 HHQ16改善心衰小鼠心脏大小、形态和结构
进一步观察候选化合物HHQ16对心肌重塑的影响，初步探索其作用机制。如图3所示，与假手术组比较，模型组心脏显著变大，形态不规则，心体比显著升高（图3B）；HHQ16给药28 d后，心脏显著变小，心体比显著下降（图3A、图3B）。HE染色（图3C）表明，假手术组小鼠心肌细胞结构正常，模型组可见部分心肌细胞呈现区域性不规则，心肌细胞变大。HHQ16给药28 d后，形态变规则，心肌细胞肥大显著改善。
3.4 HHQ16抑制心衰小鼠心肌组织纤维化
进一步观察HHQ16对心肌纤维化的影响。首先通过Masson染色，观察胶原沉积。如图4所示，假手术组的心肌组织无胶原沉积。模型组的心肌组织胶原沉积增多；而HHQ16组给药28 d，心肌胶原沉积显著减少。COL1、COL3、αSMA和TGF-β1是评估心肌纤维化的重要指标[15]。免疫组织化学染色结果显示（图5），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA蛋白表达水平显著升高，经HHQ治疗后，这些蛋白表达水平显著降低。基因水平也展示了相似的改变（图6），与假手术组比较，模型组COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA表达水平显著升高，而HHQ16能显著降低这些纤维化指标的mRNA表达水平。以上结果表明，HHQ16可以改善心衰造成的心肌纤维化。
图 6 HHQ16对心衰小鼠心肌纤维化相关指标mRNA水平的影响A.COL1；B.COL3；C.αSMA；D.TGF-β1*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组比较。4. 讨论
心衰已经成为严重威胁人类健康的全球性公共卫生问题。越来越多的研究表明，由于“多靶点效应”，中药治疗心衰具有独特的优势，中药活性成分为新药开发提供了有价值的候选化合物。黄芪甲苷是治疗慢性心衰的中成药黄芪注射液的主要有效成分。然而，黄芪甲苷结构复杂，水溶性差，生物利用度低，化学合成困难，限制了该药物的临床转化。本研究涉及的水溶性黄芪甲苷衍生物均可显著改善心功能，最终根据化合物合成难易、药物稳定性、水溶性以及初步药动学比较，确定HHHQ16为最优候选药物。HHQ16具有抗心衰作用，对左冠状动脉前降支结扎模型诱导的慢性心衰小鼠有明确的治疗效果。
心肌重塑是由一系列复杂的分子和细胞机制导致的心肌结构、功能和表型的变化，包括心肌细胞肥大及心肌纤维化（心肌基质重构）等改变，以及在此基础上形成的心脏扩大、心脏质量增加。目前的研究认为，心肌重塑是心衰发生、发展的分子细胞学基础，是心衰恶化的主要机制之一。相关研究表明黄芪甲苷具有抗氧化、增强免疫力、增强心肌收缩力、减轻心肌纤维化和心肌重塑等作用[16-20]。通过对心衰小鼠表型观察，发现经过LAD手术后，模型组的心脏显著变大，心肌细胞变大，结构不规则，通过HHQ16治疗28 d后，心脏显著变小，心肌细胞接近正常，形态变规则。表明HHQ16能够改善心衰小鼠心肌重塑。
心肌纤维化被认为是心衰的基本病理变化，也是心肌重塑的分子基础[21]。心肌纤维化是当心肌因缺血、炎性反应、衰老等原因受损时，局部的心肌细胞凋亡，心肌成纤维细胞增殖，胶原纤维为主的细胞外基质增多，从而产生的一种病理变化。其主要特征是胶原蛋白合成和降解之间的平衡紊乱，导致心脏的深层结构和功能异常，造成收缩和舒张功能的严重损害，最终体现为心衰[22, 23]。心肌纤维化与心衰患者的疾病严重程度密切相关，但纤维化过程尚未成为心衰的直接治疗靶标。实验和临床证据均表明，心肌纤维化的改变可能是可逆的[22]，开发预防和逆转心肌纤维化的药物对于减轻心肌重塑和延缓心衰的发展至关重要。
胶原蛋白是细胞外基质的重要组分，其中COL1约占心脏胶原总量的85％，参与组成具有抗张强度的粗纤维，COL3约占11％，可组装成细纤维，以保持基质网的弹性[24]。在以心肌纤维化为特征的心脏疾病中，不管其病因如何，TGF-β1通常是导致纤维化的最后的、共同的中介物之一。TGF-β1是最重要的促纤维化生长因子之一，通过调节前胶原蛋白基因的表达，促进合成细胞外基质，促使心肌纤维化[25]。在肌成纤维细胞中，αSMA被组装成应力纤维，进一步导致细胞外基质蛋白过度沉积，减弱组织顺应性并加速心衰，肌成纤维细胞的分化是心肌纤维化反应的标志，其中，α-SMA的表达是此种分化的重要特征[26]。在本研究中，用Masson染色检测了小鼠的胶原，LAD手术可使小鼠胶原明显增多，而HHQ16给药治疗后能有效减少胶原沉积。通过免疫组化染色和qPCR检测了小鼠心肌纤维化相关指标，发现HHQ16可下调COL1、COL3以及αSMA蛋白水平的表达，并且下调COL1、COL3、αSMA和TGF-β1 mRNA水平的表达，从而改善LAD手术引起的心肌纤维化，改善心衰程度。
综上所述，本研究从黄芪甲苷衍生物对心衰小鼠的保护作用入手，筛选出改造后黄芪甲苷衍生物最优的候选化合物HHQ16，通过对心肌重塑和心肌纤维化相关指标的检测，初步研究了其在心衰治疗中的作用机制，为HHQ16治疗心衰的药物研发提供科学依据。
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表 1 苯磺酸顺阿曲库铵精密度和准确度考察结果
浓度(ng/ml) 批内（n=6） 批间（n=18） 精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）精密度
（RSD,%）准确度
（RE,%）40 3.10 1.34 7.66 −7.67 2 000 8.27 −5.98 5.23 −7.75 4 000 6.47 4.62 9.34 −5.17 
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表 2 苯磺酸顺阿曲库铵基质效应和提取回收率考察结果
品名 浓度
（ng/ml）内标归一化的
基质效应（%）提取回收率
（%）苯磺酸顺阿曲库铵 40 71.88 83.62 2 000 77.67 83.40 4 000 80.64 88.87 维库溴铵 125.91
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表 3 血浆样品稳定性考察结果
浓度
(ng/ml)室温（n=6） 进样器（n=6） 冻融（n=18） 长期（n=6） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 精密度（RSD,%） 准确度（RE,%） 40 6.23 7.30 6.75 −1.86 3.89 −2.19 2.23 8.24 2 000 1.38 0.33 2.57 −7.87 4.72 −8.99 3.62 −12.62 4 000 6.75 −2.25 2.40 −6.04 4.38 −10.96 3.48 −10.89
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表 4 血浆样品中苯磺酸顺阿曲库铵的含量测定结果（ng/ml）
时间点（t/h） 受试者1 受试者2 受试者3 受试者4 受试者5 受试者6 受试者7 受试者8 T1 332.0 362.3 556.8 388.9 289.5 328.1 359.9 348.3 T2 228.4 190.9 363.6 205.9 65.71 180.3 170.1 158.5 T3 81.66 99.30 174.4 145.9 41.60 68.56 73.07 61.64 T4 50.11 58.34 125.9 84.42 24.72 35.21 40.14 34.22 LT 270.8 338.0 489.9 316.3
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[1] RAVAL A D, ANUPINDI V R, FERRUFINO C P, et al. Epidemiology and outcomes of residual neuromuscular blockade: a systematic review of observational studies[J]. J Clin Anesth,2020,66:109962. doi: 10.1016/j.jclinane.2020.109962 [2] LIM J, COX J, NGUYEN T, et al. Cisatracurium dosing in a patient with hyperthermia[J]. Am J Health Syst Pharm,2019,76(14):1029-1032. doi: 10.1093/ajhp/zxz098 [3] GUO J R, YUAN X H, ZHOU X F, et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of cisatracurium in patients undergoing surgery with two hemodilution methods[J]. J Clin Anesth,2017,38:75-80. doi: 10.1016/j.jclinane.2017.01.013 [4] SAYER H, QUINTELA O, MARQUET P, et al. Identification and quantitation of six non-depolarizing neuromuscular blocking agents by LC-MS in biological fluids[J]. J Anal Toxicol,2004,28(2):105-110. doi: 10.1093/jat/28.2.105 [5] AYAD M M, BELAL F, HOSNEY M M, et al. Simultaneous HPLC determination of cisatracurium and propofol in human plasma via fluorometric detection[J]. J Chromatogr Sci,2018,56(6):524-530. doi: 10.1093/chromsci/bmy027 [6] 辛博, 万丽丽, 王婧, 等. 用LC-MS法测定人血浆中顺式阿曲库铵的浓度[J]. 药学实践杂志, 2020, 38(2):148-151. [7] BRONSERT M R, HENDERSON W G, MONK T G, et al. Intermediate-acting nondepolarizing neuromuscular blocking agents and risk of postoperative 30-day morbidity and mortality, and long-term survival[J]. Anesth Analg,2017,124(5):1476-1483. doi: 10.1213/ANE.0000000000001848 [8] YU B W, OUYANG B Y, GE S J, et al. Incidence of postoperative residual neuromuscular blockade after general anesthesia: a prospective, multicenter, anesthetist-blind, observational study[J]. Curr Med Res Opin,2016,32(1):1-9. doi: 10.1185/03007995.2015.1103213 [9] FORTIER L P, MCKEEN D, TURNER K, et al. The RECITE study: a Canadian prospective, multicenter study of the incidence and severity of residual neuromuscular blockade[J]. Anesth Analg,2015,121(2):366-372. doi: 10.1213/ANE.0000000000000757 [10] 尹磊, 徐佳明, 吴敬医, 等. 急性等容血液稀释自体血回输对老年骨科手术患者脑电双谱指数与肌松效应的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2021, 26(10):1153-1158. doi: 10.12092/j.issn.1009-2501.2021.10.007 -
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