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肝苏颗粒是由苗药赶黄草(Penthorum chinense Pursh)加工制成的单方制剂,1998年被列为基本药物,在临床上主要用于治疗酒精性肝损伤、慢性乙型肝炎等疾病[1],目前收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十三册》(下称《部颁标准》)[2]。近年来对肝苏颗粒的研究主要集中于药理与临床研究,药理研究表明肝苏颗粒对CCl4致化学性、胆管阻塞性和免疫性大鼠肝纤维化模型均有治疗作用,可明显抑制肝脏脂质过氧化损伤,改善肝功能和减轻肝脏纤维化[2-4];临床上,明确了采用肝苏颗粒联合西药共同作用,在治疗慢性乙型肝炎、保肝降酶、退黄上均具有高于单用西药的治疗效果[5-8],但对其制剂质量控制的研究较少,鉴于《部颁标准》发布时间久远,随着研究进展及分析技术与设备的进步,应制定更为科学、完善的标准,以保证制剂稳定、临床用药安全。
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取肝苏颗粒适量,研细(过3号筛),取1.0 g,精密称定,精密加入10 ml 80%甲醇,称定重量,超声提取15 min(功率350 W,频率53 kHz),取出放至室温,用80%甲醇补足失重,摇匀,过0.45 µm微孔滤膜,取续滤液作为供试品溶液。取乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷标准品适量,精密称定,置于容量瓶,加入80%甲醇定容至刻度线,制成每1 ml含乔松苷1 mg的标准品溶液,作为对照品溶液。吸取供试品溶液5 µl、对照品溶液2 µl,分别点于同一高效硅胶G薄层板上,以二氯甲烷-甲醇-甲酸(7∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干。喷以5%三氯化铝乙醇溶液,晾干,热风吹至斑点显色清晰,置紫外光(365 nm)下检视。根据图1显示,供试品色谱与对照品色谱中乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷在相同位置显示相同颜色斑点。
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色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm);流动相:乙腈(A)-0.5%甲酸水溶液(B);梯度洗脱:0~10 min,28%→30% A;10~17.5 min,30%→ 34.5% A;17.5~20 min,34.5%→90% A;检测波长:280 nm(紫外检测时间20 min);柱温:30 ℃;流速:1.0ml/min;进样量:10 μl。
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取乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量,精密称定,加80%甲醇制成质量浓度分别为0.24 mg/ml的对照品储备液。
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取肝苏颗粒适量,研细(过3号筛),取粉末1.0 g,精密称定,置100 ml具塞锥形瓶中,精密加入25 ml 80%甲醇溶液,称定重量,超声处理15 min,取出放至室温,用80%甲醇补足失重,摇匀,取样过0.45 μm微孔滤膜,取续滤液即得。
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取提取溶剂80%甲醇与对照品储备液、样品溶液,按上述色谱条件进样10 µl,记录色谱图,结果见图2。根据结果,乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷分离效果良好,分离度大于1.5,理论塔板数不低于7700。
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量取对照品储备液(240µg/ml)适量,依次用80%甲醇稀释成240、120、60、24、4.8、2.4µg/ml,以进样质量为横坐标 (X) ,峰面积为纵坐标 (Y) 进行回归,得乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的标准曲线为:Y=2323.5748X+2.0537,r= 0.9999,表明乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷在2.4~240 µg/ml范围内线性关系良好。
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精密吸取对照品溶液(240µg/ml)10µl,在上述液相色谱条件下连续进样6次,测定峰面积,结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面积RSD为0.13%,表明仪器精密度良好。
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取肝苏颗粒(GSKL-10),按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液6份,测定峰面积,结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷峰的平均峰面积为1789.29,RSD为2.12%,表明该方法重复性良好。
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取肝苏颗粒(GSKL-10),按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液,并按“2.2.1”项下色谱条件,分别于0、4、8、12、24 h进样,结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均峰面积为1788.29,RSD为0.67%,表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
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分别称取肝苏颗粒(GSKL-10)6份已知含量的样品约0.5 g,精密称定,置于具塞锥形瓶中,按照接近 1∶1 的量计算所需添加的乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液,加入到样品中,按“2.2.3”项下方法平行制成6份供试品溶液,进样 10 μl,记录峰面积,结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率为100.76%,RSD 为 0.66%,说明该方法准确度较好,计算结果见表1。
表 1 乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷加样回收率试验结果(n=6)
样品
编号样品中含量
(mg)加入量
(mg)测得总量
(mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)GSKL-10 0.96 0.95 1.9306 102.17 100.76 0.66 0.95 1.9102 100.02 0.95 1.9146 100.48 0.95 1.9162 100.65 0.95 1.9162 100.65 0.95 1.9156 100.59 -
分别取每批肝苏颗粒适量,研细(过3号筛),取粉末1.0 g,精密称定,按“2.2.3”项下的方法制成供试品溶液,每批样品平行制备2份,每份进样3次,进样量10 μl,记录峰面积,计算乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量,结果见表2。
表 2 15批肝苏颗粒中乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定结果(
$ \overline x $ ±SD)样品编号 含量(mg/袋) GSKL-1 17.87±0.13 GSKL-2 19.02±0.07 GSKL-3 19.19±0.40 GSKL-4 18.67±0.14 GSKL-5 18.37±0.07 GSKL-6 18.84±0.08 GSKL-7 18.00±0.01 GSKL-8 15.99±0.02 GSKL-9 17.17±0.01 GSKL-10 17.31±0.03 GSKL-11 17.50±0.02 GSKL-12 20.93±0.16 GSKL-13 20.12±0.16 GSKL-14 15.30±0.06 GSKL-15 17.46±0.08
Study on quality standard improvement for Gansu granules
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摘要:
目的 建立肝苏颗粒质量标准,有效控制药品质量。 方法 以乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷为指标性成分,改进肝苏颗粒的薄层鉴别方法;采用Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)色谱柱,以乙腈-0.5%甲酸水溶液为流动相,以280nm检测波长,建立乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的HPLC含量测定方法。 结果 采用所建立的TLC方法鉴别肝苏颗粒时,特征斑点分离度良好、清晰;定量分析结果显示乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的质量浓度在2.4~240 µg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系(r= 0.9999),平均加样回收率为100.76%,RSD为0.66%,准确度良好。 结论 本实验所建立的TLC鉴别方法和 HPLC含量测定方法专属性强、重现性好,可以作为肝苏颗粒质量控制的提高标准。 -
关键词:
- 肝苏颗粒 /
- 质量标准 /
- 薄层色谱法 /
- 乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷 /
- 高效液相色谱法
Abstract:Objective To establish the quality standard of Gansu granules (GGs) and effectively control the quality of GGs. Methods TLC identification method of Gansu granules was improved by using pinocembrin-7-O-β-D-glucoside as the indicator. In HPLC analysis, Agilent ZorbaxSB-C18 (4.6 mm×250 mm, 5 μ m) was used as a chromatographic column, and acetonitrile-0.5% formic acid solution was used as the mobile phase. The detection wavelength of 280 nm was used to analyze the content of pinocembrin-7-O-β-D-glucoside in GGs. Results The separation of characteristic spots was good and clear when the established TLC method was used to identify Gansu granules. Quantitative analysis showed that the concentration of pinocembrin-7-O-β-D-glucoside has a good linear relationship with the peak area in the range of 2.4-240 µg/ml (r= 0.9999). The average sample recovery rate of pinocembrin-7-O-β-D-glucoside is 100.76% with RSD value of 0.66%. The accuracy was good. Conclusion The TLC identification method and HPLC content determination method established in this experiment have strong specificity and good reproducibility, and can be used as an improved standard for the quality control of Gansu granules. -
Key words:
- Gansu granules /
- quality standards /
- TLC /
- pinocembrin-7-O-β-D-glucoside /
- HPLC
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表 1 乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷加样回收率试验结果(n=6)
样品
编号样品中含量
(mg)加入量
(mg)测得总量
(mg)回收率
(%)平均回收率
(%)RSD
(%)GSKL-10 0.96 0.95 1.9306 102.17 100.76 0.66 0.95 1.9102 100.02 0.95 1.9146 100.48 0.95 1.9162 100.65 0.95 1.9162 100.65 0.95 1.9156 100.59 表 2 15批肝苏颗粒中乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷的含量测定结果(
$ \overline x $ ±SD)样品编号 含量(mg/袋) GSKL-1 17.87±0.13 GSKL-2 19.02±0.07 GSKL-3 19.19±0.40 GSKL-4 18.67±0.14 GSKL-5 18.37±0.07 GSKL-6 18.84±0.08 GSKL-7 18.00±0.01 GSKL-8 15.99±0.02 GSKL-9 17.17±0.01 GSKL-10 17.31±0.03 GSKL-11 17.50±0.02 GSKL-12 20.93±0.16 GSKL-13 20.12±0.16 GSKL-14 15.30±0.06 GSKL-15 17.46±0.08 -
[1] 郑洋, 王佳慧, 赵铁建. 肝苏颗粒治疗慢性乙型肝炎疗效的Meta分析[J]. 中国现代医学杂志, 2018, 28(31):47-52. [2] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第十三册[M]. 北京, 人民卫生出版社, 1997: 87. [3] 谢君. 肝苏颗粒对肝纤维化影响的实验研究[D]. 成都: 成都中医药大学, 2017. [4] 谢君, 谢晓芳, 李梦婷, 等. 肝苏颗粒对胆总管阻塞性肝纤维化大鼠肝功能和病理损伤的影响[J]. 中药与临床, 2018, 9(2):48-51. [5] 谢君, 谢晓芳, 代良萍, 等. 肝苏颗粒对四氯化碳致肝纤维化大鼠肝功能和病理损伤的影响[J]. 中国实验方剂学杂志, 2017, 23(8):117-123. [6] 高占华. 肝苏颗粒的保肝降酶及退黄作用临床效果分析[J]. 承德医学院学报, 2019, 36(1):42-44. [7] 胡淑华, 冯佩璐, 江雪, 等. 肝苏颗粒联合替比夫定治疗慢性乙型肝炎的疗效观察[J]. 现代药物与临床, 2018, 33(6):1506-1509. [8] 李毅, 赵川, 杨凤. 肝苏颗粒联合拉米夫定和阿德福韦酯治疗乙型肝炎肝硬化的疗效观察[J]. 现代药物与临床, 2016, 31(8):1209-1212. [9] WANG A Q, LI M X, HUANG H M, et al. A review of Penthorum chinense Pursh for hepatoprotection: traditional use, phytochemistry, pharmacology, toxicology and clinical trials[J]. J Ethnopharmacol,2020,251:112569. doi: 10.1016/j.jep.2020.112569 [10] WANG A Q, LIN L G, WANG Y T. Traditional Chinese herbal medicine Penthorum chinense Pursh: aphytochemical and pharmacological review[J]. Am J Chin Med,2015,43(4):601-620. doi: 10.1142/S0192415X15500378 [11] ZHOU F Y, WANG A Q, LI D, et al. Pinocembrin from Penthorum chinense Pursh suppresses hepatic stellate cells activation through a unified SIRT3-TGF-β-Smad signaling pathway[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2018,341:38-50. doi: 10.1016/j.taap.2018.01.009 [12] SUN Z L, ZHANG Y Z, ZHANG F, et al. Quality assessment of Penthorum chinense Pursh through multicomponent qualification and fingerprint, chemometric, and antihepatocarcinoma analyses[J]. Food Funct,2018,9(7):3807-3814. doi: 10.1039/C8FO00754C