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中药沪地龙为上海市的唯一道地药材，具有突出的定惊，通络，平喘和利尿功效。用于高热神昏，惊痫抽搐，关节痹痛，肢体麻木，半身不遂，肺热喘咳，水肿尿少等证[1]。当前，心脑血管疾病的发病率增高，该药是治疗这类疾病的中成药组方中重要组成成分[2-3]。地龙药用市场需求量从2010年的400 t已上涨至2020年的1100 t，并仍呈上涨趋势。沪地龙主产于上海，20世纪60年代供应量占全国地龙销售量的2/3，自1995年起被历版《中国药典》收载[4]。然而，随着上海城市化进程的发展、农业上化肥和农药的大量使用以及蔬菜大棚面积的扩大，沪地龙的原动物蚯蚓的生存条件遭受严重破坏，以致可得蚯蚓的数量明显减少，从而导致沪地龙药材的产量也急剧下降。目前沪地龙药材的产量已无法满足市场需求，人工养殖技术尚未取得实质性进展[5]。而且地龙来源复杂，采收混乱，近年来伪品地龙大量混入市场[6]。为满足市场对沪地龙药材的需求，确保人民的用药安全，解决沪地龙资源紧缺的问题，开展沪地龙的人工养殖研究迫在眉睫。本课题参照中药材生产质量管理规范的要求[7-8]，对沪地龙药材原动物的品种来源和鉴定、养殖环境、养殖方法、采收加工和包装运输进行研究，提出了作物和蚯蚓套养的新方法，考察了养殖蚯蚓对土壤改善的作用，并制订了相关的操作规程。
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沪地龙的品种按药典规定原动物为3个种，分别为环节动物门、寡毛纲、钜蚓科动物威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen[1]（图1）。
图 1 药典规定的沪地龙3种原动物形态
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我国是蚯蚓种数的大国，现有蚯蚓记录已达9科28属640种[9]，陆续还有新物种被发现[10]。蚯蚓的外部形态，如大小、颜色和环节数有较多的相似之处，所以鉴定蚯蚓除了一般的外部形态鉴定外，还必须进行解剖，对其有重要鉴别特征的盲肠和受精囊的形态特征进行观察，从而获得正确的鉴定结果。
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体长96～150 mm，宽5～8 mm。体节数88～156，背面颜色青黄，或灰青色。背中线深青色。环带于14～16节，戒指状，无刚毛。身体上刚毛较细，前段腹面并不粗而疏。13～22（Ⅷ）在受精囊孔间，13～21在雄孔之间。雄生殖孔在18节两侧一浅交配腔内。陷入时呈纵裂缝（图2A-1），内壁有褶皱，褶皱间有刚毛2～3条，在腔底突起上为雄孔，突起前面常有一乳突。受精囊3对（图2A-2），在6/7～8/9节间，孔在一横裂中小突上。无受精囊腔。隔膜8/9，9/10缺失。盲肠简单（图2A-3）。受精囊的盲管内端2/3在平面上，左右弯曲，为纳精囊，与管分明（图2A-4）。
图 2 沪地龙解剖鉴别要点
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本种身体大小、色泽及内部构造和前种相似。体长130～150 mm，宽5～7 mm。环带位于14～16节，戒指状，无刚毛。体上刚毛环生，13～18（Ⅷ）在受精囊孔间，9～13在雄孔间。雄生殖孔在18节两侧一浅交配腔内（图2B-1）。唯受精囊腔较深广，前后缘均隆肿（图2B-2），外面可见腔内大小乳突各一。雄交配腔亦深广，内壁多皱纹，有平顶乳突3个。盲管内端2/3在同一平面上左右弯曲，与外端1/3的管状有明显区别（图2B-3）。受精囊在第9节呈一定角度的弯曲（图2B-4）。
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体长100～150 mm，宽5～9 mm，背面及侧面有深紫颜色或紫红色，刚毛圈不白。环带占3节，无刚毛。身体前部刚毛虽粗，在2～9节并不特殊粗。28～34（Ⅷ）在受精囊孔间，20～36在雄孔之间。雄生殖孔在一“十”字形突的中央，常由一浅囊状皮褶盖住（图2C-1），内侧有一个或多个乳头，其排列变化很大。受精囊孔3对，位6/7至8/9节间，孔常常陷入（图2C-2），孔的内侧腹面在刚毛圈前或后，有乳头突，排列较规则。盲肠复式，其腹侧有栉状小囊（图2C-3）。副性腺有索状短管。盲管较受精囊本体长，内端3/4稍粗，或直或稍弯曲（图2C-4）。以上特征符合蚯蚓分类的描述[11]。
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沪地龙长8～15 cm，宽0.5～1.5 cm。全体具环节，背部棕褐色至黄褐色，腹部浅黄棕色；受精囊孔3对，在6/7至8/9环节间。第14～16环节为生殖带，较光亮。第18环节有一对雄生殖孔。通俗环毛蚓的雄交配腔能全部翻出，呈花菜状或阴茎状；威廉环毛蚓的雄交配腔呈纵向裂缝状；栉盲环毛蚓的雄生殖孔内侧有1或多个小乳突[1]。沪地龙药材形态见图3。
图 3 沪地龙药材形态
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根据蚯蚓喜欢安静的生活习性，养殖蚯蚓的地点须选择在离公路50 m以远的地方，周围没有化工厂，没有噪声源、震动源等工厂企业。有自然水源。空气清新。土壤要求腐殖土，pH为6.5～7.5。
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饲养蚯蚓的土地四周需挖水沟，其中分成多个畦，每畦宽度根据需要可达1.5～2.0 m，两畦间挖一宽30～50 cm，深30 cm的沟。经常保持周围和中间沟内的水量达2/3高度（冬天需降至1/4高度）。土壤的湿度保持在60%～70%。水沟中可种植芹菜或养殖黄鳝和泥鳅。水质要求卫生安全无污染，可利用附近的河水及雨水。
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蚯蚓的投放选择在春秋二季，气温在15～20 ℃之间。在蚯蚓苗地里挖出蚯蚓，选取符合沪地龙3个种基原要求的蚯蚓，并挑选活动能力强、无损伤的蚯蚓，按每亩地放30～50 kg鲜蚯蚓，分撒在用水浇湿的土地里，蚯蚓将自动钻入泥土中。
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选用发酵至少6个月的牛粪、猪粪、鸡粪或人工有机肥。按每亩田4～6 t的量投放。可一次投放，也可分2次投放。在畦上适时投放菜叶和粉碎或切断的秸秆。
为摸索牛粪（上海光明奶牛场供）、猪粪（崇明新村乡饲养场供）、鸡粪（崇明西新村农家供）或人工有机肥（上海聚源有机肥有限公司）对蚯蚓生长和繁殖的效果，比较在同一块地（分隔3块）投放相同量的饲料，1年后蚯蚓的生长情况（图4），结果表明牛粪和猪粪作为养殖蚯蚓饲料的效果最好。
图 4 不同蚯蚓饲料对蚯蚓增长的影响
在上海4月间的崇明区三星镇西新村养殖地里按每亩地放入30 kg鲜活蚯蚓（经鉴定为威廉环毛蚓），随后按每亩地放4 t经发酵后的牛粪，田里种芋艿。次年4月分散选择3个1 m2的土地，挖取蚯蚓称重，并计算每亩地里蚯蚓的产量。第3年、第4年仍旧按该方法操作，3年后的蚯蚓生长情况见图5。结果表明，在牛粪作为蚯蚓饲料的养殖下，蚯蚓3年的繁殖量达到500 kg，可以进行收获。
图 5 蚯蚓养殖年度产量
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人工养殖蚯蚓必须与农作物套养，否则养殖地不能获得经济效益，农民也就会失去养殖的积极性。而植物的生长好坏又与土质的改善有密切的关系。不同蚯蚓饲料的投放对蚯蚓生长地土质的改善有不同的结果。土壤的容重的改变是土地质量变化的重要指标。土壤的容重降低，表示土壤的团粒结构更好，更有利于作物的良好生长。按照测定土壤容重通常使用的环刀法[12]，对不同蚯蚓饲料投放的蚯蚓生长土地进行容重的测定，土壤容重改变的测试结果如下（表1）。由此可见，虽然牛粪和猪粪做饲料使蚯蚓的生长达到近乎相同的效果，但对于土壤的改善作用牛粪较猪粪的效果更胜一筹。所以在猪粪和牛粪同时可得的情况下，使用牛粪效果更好。
表 1 不同蚯蚓饲料投放后蚯蚓地容重变化
饲料名称 土地容重测定值 样地1 样地2 样地3 均值 RSD (%) 未添加 1.86 1.84 1.80 1.83 1.64 牛粪 1.68 1.71 1.65 1.68** 1.78 鸡粪 1.76 1.74 1.72 1.74* 1.15 猪粪 1.80 1.73 1.75 1.76 2.04 人工有机肥 1.79 1.78 1.77 1.78 0.56 * P<0.05，**P<0.01，与未添加组比较 -
使用农作物套种养殖蚯蚓的方法是本课题的创新点。如在农田里单独养殖蚯蚓，不但浪费土地资源，而且不可能达到理想的经济效益，蚯蚓的人工养殖方法就无法推广。所以必须在蚯蚓地里套种农作物，以期获得蚯蚓和农作物双双得利的效果。由于使蚯蚓生长良好的土壤其湿度要求在60%～70%的程度，所以必须选择能在这一土壤湿度下也能生长良好的作物品种，以适应蚯蚓喜潮湿土地的特性。此外，在夏天能有叶大能遮阳的植物，则更能降低土壤表面的温度，有利于蚯蚓晚间外出觅食。经试验，花菜、芋艿、玉米和卷心菜等能符合这一要求，而地瓜、马铃薯和山药等作物因不宜在60%～70%的土地湿度中生长，故不宜作为和蚯蚓套种的作物。由于养殖蚯蚓能使土壤松软，蚯蚓排出的粪便能增加土壤的肥力，套种作物的产量也获得了提高，从而明显地提高农民获得的经济效益，见表2。
表 2 不同农作物在蚯蚓养殖地产量的增减
作物名称 现产量（kg/km2） 增/降幅(%) 单价（元） 收益（元/ km2） 花菜 5 250 15～17 2.0 10500 芋艿 2 700 15～17 5.0 13500 玉米 3 000 17 4.0 12000 地瓜 4 000 −8 1.2 4800 马铃薯 2 200 −6 2.0 4400 卷心菜 6 000 15～17 1.8 10800 -
根据套种作物的生长习性，调节生长密度。经常除草。尽量不用杀虫药和除草剂，如作物生长的要求必须使用，应按国家的规定使用低毒和最小有效剂量。使用前一星期起降低水沟里的水量。蚯蚓养殖地内要经常灌水，其中水沟的水要经常保持在2/3的高度。盛夏土地的表面也要常喷水。在蚯蚓的养殖中要注意除去蚯蚓的天敌，如野鼠、家鼠、黄鼬、蜈蚣和蚂蚁等，防止他们进入养殖区造成对蚯蚓的损害。
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①利用插秧前稻田灌水后，蚯蚓自动游到田埂上避水，此时进行人工抓捕。②在养殖的蚯蚓田里，当一季作物收割后，在水沟里放水。此时蚯蚓自动爬到土埂上避水，可进行人工抓捕。③在一种作物收割后至另一种作物栽种前的间歇期内挖土捕捉蚯蚓。④选择在每年的4～5月或10月捕捉蚯蚓。⑤温和湿润的天气，在蚯蚓养殖地人工挖掘。⑥严格禁止用电击方法捕捉蚯蚓。
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将捕捉的蚯蚓用清水冲去体表的泥沙，分批放入草木灰中2 min，蚯蚓即失去活动能力。取出后用清水冲去表面草木灰，逐条加入到蚯蚓剖切机内。经全剖切后的蚯蚓用清水淘洗2～3次，除去泥沙。逐条挂在竹杆上至室外晒干。也可将洗净的蚯蚓放在挂空的尼龙网或不锈钢网上晒干。如遇下雨天，则可分摊放入具细孔的不锈钢盘内，置60 ℃烘房中烘8 h至干。
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地龙药材的标准按《中华人民共和国药典》一部地龙项记载的要求执行[1]。内容包括检查杂质不得过6%、水分不得过12.0%、总灰分不得过10.0%、酸不溶性灰分不得过5.0%、重金属不得过30 mg/kg、每1000 g中含黄曲霉素B1不得过5 µg，黄曲霉素G2、黄曲霉素G1、黄曲霉素B2和黄曲霉素B1的总量不得过10 µg。水溶性浸出物不得少于16.0%。该基地地龙药材经上海市食品药品检验院检测（报告书编号：YW202105450），杂质为0.2%，水分为10.3%，总灰分为5.9%，酸不溶性灰分为1.0%，重金属符合规定。黄曲霉素B1小于检出限0.5 µg/kg，黄曲霉素B20.2 µg/kg、黄曲霉素G10.5 µg/kg、黄曲霉素G20.2 µg/kg，和黄曲霉素B1的总量小于10 µg/kg。水溶性浸出物为25.9%。
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干燥后的地龙药材在包装前应仔细检查是否已充分干燥，并清除杂质和异物。后置药用级的塑料包装中，包装袋表面贴上药材的溯源码。溯源码包括生产企业、地龙基源、栽培方式和环境、养殖管理、采收加工的时间和方法。
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地龙药材应储存于阴凉干燥的仓库里，仓库的地面应有木质或塑料堆放架。库房注意防虫防鼠。
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地龙的运输应遵循及时、准确、安全、经济的原则。将固定的运输工具清洗干净，每件地龙捆扎好，遮盖严密，及时运往贮藏地点。不得雨淋、日晒，长时间滞留在外，不得与其他有毒、有害物质混装，避免污染。
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中药的规范化种植和管理是确保中药质量安全有效的重要环节。国家药品监督局等4部委今年再次颁布了《中药材生产质量管理规范（GAP）》的要求[7]，说明中药材规范化种植和管理的重要性。动物类药材养殖往往较植物类药材的种植更具复杂性。本课题组数年来对沪地龙的养殖不断的进行探索，在此基础上提出了沪地龙规范养殖的新方法，为解决沪地龙规模化和可持续的人工养殖、缓解沪地龙的资源紧缺提供了可行的途径。
Study on the good agricultural practice for Shanghai Pheretima
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摘要:
目的 制定沪地龙生产质量管理规范（GAP）。 方法 按照我国中药材GAP规范化生产的综合技术要求，在上海市崇明区三星镇开展规范化养植和加工关键技术研究。 结果 明确规范了沪地龙的产地环境、品种特征、养殖技术、病虫害防治、采收加工、包装储藏运输、质量监测等技术环节。 结论 为沪地龙的标准化和现代化质量管理提供操作依据。 -
关键词:
- 沪地龙 /
- 中药材生产质量管理规范 /
- 人工养殖 /
- 标准操作规程
Abstract:Objective To establish the Good Agricultural Practice（GAP）for standard operation procedure of Shanghai Pheretima. Methods According to the comprehensive technical requirements of GAP standardized production of Chinese herbal medicine, the key technologies of standardized cultivation and processing were studied in Sangxin Town, Chongming District, Shanghai. Results The production area environment, variety characteristics, breeding technology, pest control, harvesting and processing, packaging, storage and transportation, quality monitoring and other technical links of Shanghai Pheretima were clearly defined and standardized. Conclusion This study provides practical basis for the standardization and modernization quality management of Shanghai Pheretima. -
Key words:
- Shanghai Pheretima /
- GAP /
- artificial culture /
- standard operating procedure
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脑血管疾病是仅次于心脑血管疾病和癌症的第三大病症，其中脑缺血是常见的脑血管疾病之一。脑缺血的患病率和死亡率仍处于上升趋势，严重影响人们的健康。目前，西医对于脑缺血的主要治疗方式是溶栓和取栓，但有严格的溶栓时间窗和较大的取栓风险，并且缺血后造成神经功能的损伤没有有效的药物治疗[1]。中医药在脑缺血的预防和治疗中具有潜在作用，以气虚为本、血瘀为标作为主要病因[2]。查阅近几年文献发现，益气活血化瘀方药在防治脑缺血中表现出多方面和整体调节的优势。
参麻颈复方是临床名老中医经验方，临床应用发现具有活血通络，益气养血，宁神安脑，健筋壮骨之效。该方由首乌藤、丹参、山茱萸（制）、天麻、当归、川芎等组成，临床应用广泛。首乌藤有养血安神、祛风通络之效[3]，丹参有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、除烦安神之效[4]，当归有补血调经、活血散寒、消肿止痛生肌、润肠通便之效[5]，川芎、陈皮的补气之效辅佐以上药物活血功效运行，而且川芎具有活血化瘀之效，是传统中医防治中风选择最多的配方之一[6]。本研究评估参麻颈复方对小鼠脑缺血损伤的改善作用，并进一步探讨其对骨髓来源内皮祖细胞干预发挥防治脑缺血损伤的机制，为中药方剂治疗脑缺血提供新的思路、寻找新的靶点。
1. 材料与方法
1.1 实验仪器及试剂
细胞培养箱（Thermo公司）；倒置荧光显微镜（Leica 公司）；Odssey红外荧光显像（Li-Cor公司）；酶标仪（芬兰 Labsystens Dragon 公司）；涡旋混合器（江苏天翎仪器有限公司）；超净台（苏州净化设备有限公司）；电子天平JA2003（上海天平仪器厂）。 参麻颈复方颗粒（岳阳医院自制制剂，批准文号：沪药制字Z05050324）；尼莫地平片（天津市中央药业有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（Thermo公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，北京西浓科技有限公司）；VEGF抗体（abcam公司）；BDNF抗体（abcam公司）；GAPDH内参抗体（abcam公司）；Tubulin内参抗体（abcam公司）；内皮细胞培养基（EGM-2 Single Quots，Lonza公司)；波连蛋白（vitronection，BD公司）。
1.2 实验动物及分组
实验动物为SPF级C57BL/6雄性小鼠30只（上海吉辉实验动物饲养有限公司，许可证：SCXK（沪）2017-0012），体重为18-20 g，6-7周龄。适应性饲养1周后，将30只小鼠随机分为模型对照组（Control组）、参麻颈组（SMJ组）、尼莫地平组（NMDP组），10只/组。实验过程中对于实验小鼠的所有处理均符合伦理学规定。
1.3 实验方法
1.3.1 制备动物模型
采用电凝法制备局灶性脑缺血模型[7]，用浓度为12%的水合氯醛对小鼠进行腹腔注射，剂量控制在350 mg/kg。小鼠麻醉后，仰卧位固定在手术台。借助显微镜，用显微镊沿颞肌纤维束的方向钝性分离肌肉，直到颧骨及麟骨暴露，显微镊夹住颧骨固定小鼠头部，用牙科钻重点打磨颧骨和麟骨的交叉部位，骨壳变薄并有裂缝时，停止打磨，用撬棒沿已暴露的动脉血管剥离骨片，直至小鼠左侧大脑中动脉与伴行的迷走神经分叉暴露；在显微镜下，找准纹状体外侧动脉近心端，用双极电凝器凝断左侧大脑中动脉后，将电凝器缓慢移出，显微镜下再次确认是否凝断。最后用显微镊将皮肤和肌肉归置原位，以便于缝合。小鼠完全苏醒后，观察精神状态，若出现站立不稳、左侧肢体偏瘫、提尾向一侧转圈等神经功能损害症状，即为造模成功。
参麻颈组在手术前通过灌胃方式给予6.88 g∙kg−1的参麻颈复颗粒；尼莫地平组给予2.16 mg/kg溶液灌胃；模型对照组给予等量蒸馏水灌胃，每日1次，共14 d。
1.3.2 神经行为学功能评分
术后第3 d，由观察者在不知分组情况下记录神经行为学表现，并采用参考文献[7]评分方法，如提尾悬空试验等[8]，评估神经行为学功能评分。
提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠重复提尾悬空试验：提起小鼠尾巴末端使其悬空，观察小鼠头部偏转。以小鼠身体的中线为基准，头部偏离中线超过10度记为成功的偏转，每只小鼠测20次，并且每次测定的时间间隔不少于1 min，以保证小鼠得到充足的休息。小鼠的偏转率计算按以下公式：摆动频率（%）=（T−10）/10×100%。
T为实验小鼠头部向手术对侧偏转的次数。
平衡木试验：记录小鼠由木棍一端顺利通过平衡木80%长度所用的时间。在正式试验前对小鼠进行3次训练，正式试验时每只小鼠重复测定3次，对每只小鼠均间隔5 min后进行下一次实验。
1.3.3 脑组织TTC染色
行为学评分测完后，小鼠脱颈处死，取脑组织，放1×PBS中清洗干净，将脑组织放在脑片模具中，共切7片，每片2 mm，放2%的TTC溶液中，并在37 ℃水浴锅中染色10 min，染色结束后放4%多聚甲醛固定6 h，按照脑片大小顺序排好拍照，脑片使用Image J统计软件测定小鼠的脑梗死体积。
1.3.4 细胞功能测定
取脑组织的同时，提取小鼠骨髓来源内皮祖细胞，培养至第7d时，收集和处理细胞，对细胞黏附、迁移及形成小管能力进行测定。
细胞黏附实验：用胰酶消化细胞,按照3×105个/ml细胞接种于预先包被人纤维粘连蛋白的96孔板中，在细胞培养箱中培养5 h后弃掉未黏附细胞，再用4%多聚甲醛固定，以Hochest 33258染料染色后于倒置显微镜下拍照。
细胞迁移实验：调整细胞浓度3×105个/ml，Transwell小室置于24孔板，按分组下室加600 μl配好的下室溶液，细胞悬液接种于上室各100 μl,置培养箱内培养24 h，用PBS清洗2次，弃上清液，在2%多聚甲醛固定15 min。弃上清，PBS清洗2次，上室转移至含600 μl Hochest 33258染料的孔中，避光染色15 min。弃上清，PBS浸泡5 min,弃上清，光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组迁移细胞数。
小管形成实验：调整各组细胞至3×105个/ml，每孔100 μl的细胞悬液加到铺有基质胶的孔中，最后将96孔板移至培养箱孵育6 h，在光学显微镜下拍照，以Image J软件计算各组小管形成数量。
1.3.5 Western blot检测
细胞样本同“1.3.4”项中相同来源，六孔板放在冰枕上，用预冷PBS润洗细胞两次，弃上清液；向板内加入60 μl已配置好的细胞裂解液，在冰枕上裂解15 min，收集细胞液转移至1.5 ml EP管中，使用高速离心机在12 000 r/min，4 ℃离心15 min，将离心后的上清液收集到新的离心管中并放到−80 ℃冰箱保存。应用紫外分光光度计测量蛋白浓度后，进行蛋白定量，95 ℃ 5 min蛋白灭活后，−20 ℃保存待用。SDS-PAGE凝胶电泳：初始电压调为50 V，电泳至Marker中红色条带分离出，将电压调为 120 V，直至Marker显示跑到胶的底部时停止电泳。转膜：恒流200 mA转膜，不同目的蛋白按其分子量大小设置转膜时间。封闭：用5%脱脂牛奶封闭1 h。封闭之后用1%牛奶配置的一抗4 ℃孵育过夜。第2天，用1%牛奶配制的二抗室温孵育1 h，NC膜放到Odyssey扫膜仪上进行扫描，保存扫描照片，使用Quantity One软件统计蛋白的灰度值。
1.4 统计学处理
使用Graphpad prism 5.0分析数据。实验数据均以（
$ \bar x $ ±s）表示，两组之间的差异采用非配对T检验进行分析，多组数据间的差异采用单因素方差分析（ANOVA），P<0.05表示差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 各组小鼠神经功能学评分
小鼠造模成功后出现明显的神经功能障碍，表现为站立不稳、左前肢屈曲内收，肌张力下降。与对照组比较，尼莫地平组小鼠的神经功能有明显改（P<0.01）；与对照组比较，参麻颈组小鼠的爬杆时间（P<0.05）和对侧偏转率（P<0.01）均有显著降低，表明小鼠给予参麻颈复方后，能有效保护缺血后神经功能的缺损（图1）。
2.2 各组小鼠脑梗体积变化
用TTC染色后结果显示：对照组小鼠术后脑组织出现明显的梗死灶。与对照组比较，给参麻颈组小鼠脑缺血后脑梗体积显著减少（P<0.01）；给予尼莫地平的小鼠与参麻颈组相比，其脑梗体积虽有减少，但无统计学差异（图2）。 2.3 各组小鼠内皮祖细胞黏附功能比较
细胞黏附实验结果显示：对照组相比于另外两组，黏附细胞数目减少。预先给予参麻颈的小鼠，在发生脑缺血后，小鼠骨髓来源内皮祖细胞黏附于96孔板中细胞数目，明显高于对照组（P<0.01）；给予尼莫地平组，其细胞数目也比对照组增多（P<0.01）；而尼莫地平组和参麻颈组两组的差异无统计学意义（图3）。 2.4 各组小鼠内皮祖细胞迁移功能比较
迁移实验结果显示：与参麻颈组和尼莫地平组比较，模型对照组细胞迁移至Transwell板上室下面的数目可见减少。与对照组比较，给予参麻颈复颗粒后的脑缺血小鼠，其骨髓来源内皮祖细胞迁移数显著增加（P<0.05）；给予尼莫地平的小鼠与对照组比较，其迁移细胞数目增加（P<0.01）；参麻颈组和尼莫地平组，两组结果有差异但无统计意义（图4）。 2.5 各组小鼠内皮祖细胞形成小管能力比较
从图中可看出，对照组小鼠内皮祖细胞形成小管的数目减少。与对照组比较，参麻颈组内皮祖细胞形成小管数目有明显增加（P<0.05），尼莫地平组小管形成数目更为突出（P<0.01）；尼莫地平组形成的小管状态也优于参麻颈组（图5）。
2.6 各组小鼠内皮祖细胞中相关蛋白的表达水平
Western blot检测结果显示：与对照组比较，参麻颈组（P<0.01）和尼莫地平组（P<0.01）小鼠内皮祖细胞内BDNF蛋白表达增加，而参麻颈组和尼莫地平组之间结果差异无统计学意义（图6）。
3. 讨论
缺血性中风是一种以动脉粥样硬化为基础的中枢系统不可逆损伤；它是由阻塞颈内动脉、椎动脉或者脑血管的血栓形成引起的，这一过程减少了血液供应，导致细胞代谢紊乱和衰老，并进一步导致血管内皮损伤[9-10]。脑缺血后导致严重的脑损伤，并造成神经功能障碍，包括偏瘫、肢体痉挛和认知障碍等，从而降低患者的生活质量[11]。目前，西医临床治疗存在局限性，使得该疾病的残疾率仍然很高，以及带来的社会经济负担也在继续增加。中医药博大精深，很多研究者一直都在致力于寻找改善脑缺血所致神经功能障碍的中医疗法。
中医典籍《伤寒杂病论》早就将活血化瘀中药或中药复方用于缺血性疾病的治疗。活血化瘀中药复方通过多靶点、多途径的作用方式发挥整体性作用。现代研究方法——代谢组学、基因组学、蛋白质组学等为中药复方作用机制的阐述提供强有力的支持。前期相关研究显示，在传统中药中，发现许多成分可以促进血管的生成，如丹参酮，川芎嗪，三七总皂苷等[12-14]，这些是方剂中常用的中药，也是活血化瘀类草药的代表。而参麻颈复方中，大部分的中药具有活血化瘀作用，是否能够改善骨髓来源内皮祖细胞功能，又能否促进脑缺血损伤后的新血管的生成，需要进一步验证。
本研究中，参麻颈复方颗粒预处理后，小鼠脑缺血所致的神经行为学功能评分显著改善；TTC染色梗死体积也显著减少（P<0.01）。证明参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤具有保护作用，可改善神经功能和减小缺血梗死体积。
越来越多的临床前研究表明[15]，无论是缺血性脑卒中急性期还是慢性期，均会导致炎症和脑组织不可逆转的损伤。因此，为了减轻缺血组织的病理损伤，修复内皮功能障碍引起的血管损伤成为缺血性脑卒中治疗的主要方向。骨髓来源内皮祖细胞是内皮愈合和血管生成的关键效应因子。内皮祖细数量减少、内皮功能障碍与心血管事件风险增加息息相关[16]，这与内皮祖细胞介导的血管修复受损致使血管疾病进展是一致的[17]。为了响应缺血信号和血管损伤,骨髓来源的内皮祖细胞被动员到循环中并募集到内皮损伤部位，从而形成新生血管，这也是一种自然的防御机制[18]。
第二部分实验研究了参麻颈复方颗粒对脑缺血损伤小鼠内皮祖细胞的保护作用。结果显示，小鼠脑缺血损伤后，来自骨髓的内皮祖细胞黏附在96孔板和迁移至Transwell板下室的数目有显著减少，给予参麻颈复方颗粒预处理后，黏附细胞数目（P<0.01）和迁移细胞数目（P<0.05）均有明显增加。另外，脑缺血损伤可影响血管新生的速度和质量，表现为内皮祖细胞形成小管的能力，包括形成小管的数量和小管长度。本研究的结果中，参麻颈复方颗粒显著增加脑缺血损伤小鼠的内皮祖细胞形成小管的数量和长度（P<0.05）。
神经营养因子是一组对神经系统的发育、生长、存活和分化至关重要的蛋白质[19]。脑源性神经营养因子（BDNF）是神经系统中含量最丰富、分布最广的神经营养因子。血管内皮细胞合成并分泌BDNF，并通过刺激其原肌球蛋白受体激酶B促进神经系统中的细胞分化、细胞生长、突触形成和神经发生[20-21]。重要的是，BDNF在缺血性和创伤性脑损伤后表现出许多神经保护特性[22]。BDNF通过促进新生血管、调节内皮一氧化氮生成和抑制凋亡来改善内皮细胞功能障碍[23]。
第三部分实验深入探讨了参麻颈复方颗粒保护小鼠脑缺血损伤的作用，结果显示，小鼠脑缺血后，大脑受到损伤，内皮祖细胞中BDNF蛋白表达显著降低，内皮祖细胞功能受损；参麻颈复方颗粒干预后，BDNF蛋白表达水平显著增加（P<0.01），细胞功能得以改善。这与二甲双胍上调人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中BDNF的表达逆转高糖状态下的细胞损伤相同[23]。由于BDNF蛋白表达的增加，脑缺血小鼠的神经功能得到改善，脑梗死体积减小。
综上所述，参麻颈复方颗粒对小鼠脑缺血损伤有保护作用，这一作用可能与促进内皮祖细胞中脑源性神经因子BDNF蛋白表达，改善内皮祖细胞功能有关。我们这一研究为参麻颈复方颗粒在心血管疾病的治疗提供了新视角，并进一步验证了在心脑血管疾病治疗领域的应用，这可能减缓疾病的进展和改善预后。
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表 1 不同蚯蚓饲料投放后蚯蚓地容重变化
饲料名称 土地容重测定值 样地1 样地2 样地3 均值 RSD (%) 未添加 1.86 1.84 1.80 1.83 1.64 牛粪 1.68 1.71 1.65 1.68** 1.78 鸡粪 1.76 1.74 1.72 1.74* 1.15 猪粪 1.80 1.73 1.75 1.76 2.04 人工有机肥 1.79 1.78 1.77 1.78 0.56 * P<0.05，**P<0.01，与未添加组比较 
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表 2 不同农作物在蚯蚓养殖地产量的增减
作物名称 现产量（kg/km2） 增/降幅(%) 单价（元） 收益（元/ km2） 花菜 5 250 15～17 2.0 10500 芋艿 2 700 15～17 5.0 13500 玉米 3 000 17 4.0 12000 地瓜 4 000 −8 1.2 4800 马铃薯 2 200 −6 2.0 4400 卷心菜 6 000 15～17 1.8 10800
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