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内生真菌经过长期进化与宿主植物形成互利共生的关系，植物可以为内生真菌提供生长所需的营养物质，内生真菌可以促进植物生长、协助对抗干旱与虫害等胁迫、产生结构新颖丰富的次生代谢物以及诱导植物次生代谢物积累[1]。植物内生真菌作为来源于药用植物的一种新兴微生物资源，在医药、农业和食品工业领域都展现出越来越广泛的应用前景[2]。
金线莲Anectochilus roxburhii为兰科金线兰属（Anectochilus）多年生草本植物，又名金线兰、金耳环、鸟人参等，在民间有“药王”、“金草”等美称，具有清热凉血、除湿解毒等功效，主产于我国南部如福建、台湾、浙江等地，富含多糖、内酯苷和黄酮及苷类等成分，具有抗炎、提高免疫力、保肝、抗肿降糖等生物活性[3, 4]。目前，有关金线莲内生菌的研究多聚焦于植株体内内生菌生物多样性[5]、促进宿主生长[6]，以及提高宿主抗病性[7]等研究。对于金线莲内生菌次生代谢产物的研究相对有限[8, 9]，从金线莲内生真菌次生代谢产物中发现结构新颖、具有显著药效活性的先导化合物具有较大潜能，有待进一步挖掘。
本研究选取从金线莲中分离得到的一株内生真菌株Aspergillus sp. J218，采用大米固体发酵法进行发酵，并从发酵产物的乙酸乙酯萃取物中分离纯化、鉴定得到10个化合物（图1）。所鉴定成分多为二聚萘并吡喃酮类化合物，提示该株内生真菌含有丰富的二聚化合成酶，对其生物合成潜能有进一步挖掘的价值。
图 1 化合物1～10的化学结构式
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Agilent 1200 Series 半制备型液相色谱仪（美国Agilent公司）；Eclipse XDB-C18 半制备色谱柱（250 mm×9.4 mm，5 μm;美国Agilent公司）；Bruker Avance 600 MHz（德国Bruker公司）；APEX7.0 FT-MS型质谱仪（德国Bruker公司）；RE-52C旋转蒸发仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）；HWS-24型恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；SHZ-DⅢ型循环水式真空泵（巩义予华仪器有限责任公司）；Sephadex LH-20（美国Pharmacia公司）；反相柱色谱硅胶12 nm S-50 μm (日本株式会社YMC)；柱色谱硅胶（200～300 目）和 GF254 ( 100 mm × 100 mm) 硅胶板（青岛海洋化工厂）；分析级乙醇、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷（上海泰坦科技股份有限公司）；色谱级甲醇、乙腈（上海泰坦科技股份有限公司）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；发酵用水为去离子水;显色剂为香草醛-硫酸显色剂（12 g 香草醛，250 ml 乙醇，200 ml 浓硫酸，500 ml 蒸馏水）。
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本实验所用菌株为2020年从产自福建南靖的一株金线莲（Anectochilus roxburhii）中分离得到。采样植株经福建中医药大学吴岩斌副研究员鉴定为金线莲，内生真菌经形态学鉴定为曲霉菌属Aspergillus sp.，编号为J218，现保存于海军军医大学中药鉴定学教研室。
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将保存的金线莲内生真菌菌株Aspergillus sp. J218接种至经高压灭菌的PDA平板培养基上，于培养箱活化培养7 d，用灭菌的打孔器打孔取菌饼置于装有250 g大米培养基的1000 ml锥形瓶中，共40瓶，常温发酵30 d。
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发酵产物每瓶用500 ml 95%乙醇超声提取二次，每次45min, 过滤，减压浓缩至无醇味，将发酵提取物用石油醚（1∶1.5）脱脂2次，然后用乙酸乙酯（1∶2）萃取3次，合并乙酸乙酯部分萃取液，减压浓缩得到褐色浸膏24.7 g。将24.7 g浸膏由适量甲醇溶解，上样于Sephadex LH-20柱色谱，以80%甲醇进行洗脱，得到5个组分（Fr. 1～5）。
Fr.2析出淡黄色结晶，经300～400目硅胶色谱以二氯甲烷：甲醇（30∶1）洗脱得到化合物1（49.2 mg）。Fr.3部分经200目硅胶柱色谱，以二氯甲烷：甲醇（200∶1→7∶1）进行梯度洗脱，同时用TLC进行点板检测，合并得到5个组分Fr.3-1～3-5。Fr.3-4经300～400目硅胶色谱以二氯甲烷：甲醇（75∶1）洗脱得到化合物2（5 mg）；Fr.3-5经Sephadex LH-20凝胶柱（80%甲醇洗脱）和300～400目硅胶色谱以石油醚：乙酸乙酯：甲醇（5∶10∶0.5）洗脱得到化合物3（22.6 mg）；Fr.3-2 经200目硅胶柱色谱（二氯甲烷，二氯甲烷：甲醇=1000∶1→100∶1）得到5个亚组分Fr.3-2-1～3-2-5。Fr.3-2-5经300-400目硅胶色谱以二氯甲烷：甲醇（105∶1）洗脱得到化合物4（27.7 mg）；Fr.3-2-4以65%甲醇-0.05%甲酸水为流动相，经Agilent 1200 Series 半制备型液相色谱，色谱柱为Eclipse XDB-C18，流速为2 ml/min，收集22 min馏分减压浓缩得到化合物5（49.3 mg）；Fr.3-2-2经300-400目硅胶色谱以二氯甲烷：甲醇（135∶1）洗脱得到化合物6（10.7 mg）和化合物7（6.8 mg）；Fr.3-2-2经300～400目硅胶色谱以二氯甲烷：甲醇（120∶1）洗脱得到化合物8（15.7 mg）和化合物9（11.5 mg）。Fr.4部分经200目硅胶柱色谱，以二氯甲烷：甲醇（800∶1→80∶1）进行梯度洗脱，得到化合物10（2.3 mg）。
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化合物1：黄色粉末。分子式：C24H22O8, ESI-MS m/z: 439 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 6.73 (s, 1H, H-6, 6′), 5.51 (s, 1H, H-3, 3′), 3.93 (s, 3H, 4,4′-OCH3), 3.80 (s, 3H, 5, 5′- OCH3), 2.70 (s, 3H, 7, 7′-CH3). 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC:169.88 (C-4, 4′), 163.12 (C-2, 2′), 159.57 (C-7, 7′), 153.49 (C-8a, 8a′), 138.52 (C-5, 5′), 111.43 (C-6, 6′), 108.45 (C-8, 8′), 107.47 (C-4a, 4a′), 87.72 (3, 3′-CH3), 56.11 (7, 7′- OCH3), 55.89 (4, 4′- OCH3), 24.06 (5, 5′-CH3) [10], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物1为kotanin。
化合物2：黄色粉末。分子式：C16H14O5, ESI-MS m/z: 285 [M-H]−。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 12.81 (s, 1H, 5-OH), 6.88 (s, 1H, H-6), 6.60 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-7), 6.41 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-9), 6.29 (s, 1H, H-3), 3.99 (s, 3H, 10-OCH3), 3.94 (s, 3H, 8-OCH3), 2.51 (s, 3H, 2-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 182.83 (C-4), 166.54 (C-2), 161.43 (C-8), 159.05 (C-10), 156.61 (C-5), 155.79 (C-11), 141.18 (C-13), 110.21 (C-3), 108.84 (C-14), 105.77 (C-6), 104.88 (C-12), 97.93 (C-7), 96.98 (C-9), 55.85 (10- OCH3), 55.44 (8- OCH3), 20.46 (2-CH3) [11], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物2为flavasperone。
化合物3：黄色粉末。分子式：C32H30O12, ESI-MS m/z: 607 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 14.53 (s, 1H, 5′-OH), 14.17 (s, 1H, 5-OH), 6.88～6.78 (m, 1H, H-9), 6.69 (d, J = 17.8 Hz, 1H, , H-10), 6.37 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-7′), 6.13 (dd, J = 8.5, 2.3 Hz, 1H, H-9′), 4.00 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.79 (d, J = 9.8 Hz, 3H, 8-OCH3), 3.68～3.61 (m, 3H, 8′-OCH3), 3.38 (d, J = 3.1 Hz, 3H, 6-OCH3), 3.07～2.99 (m, 2H, 3-H2), 2.98～2.87 (m, 2H, 3′-H2), 1.79 (d, J = 6.0 Hz, 3H, 2-CH3), 1.48 (d, J = 3.8 Hz, 3H, 2′-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 197.60 (C-4′), 196.89 (C-4), 164.85 (C-8′), 163.81 (C-8), 162.15 (C-6′), 161.81 (C-6), 161.01 (C-5′), 158.18 (C-5), 153.19 (C-10a), 151.34 (C-10a′), 142.66 (C-9a), 142.39 (C-9a′), 117.81 (C-7), 110.55 (C-5a), 107.73 (C-5a′), 106.44 (C-10′), 103.79 (C-4a), 103.58 (C-4a′), 102.77 (C-9), 102.24 (C-10), 100.21 (C-2), 100.11 (C-2′), 97.37 (C-7′), 96.21 (C-9′), 61.58 (C-6), 56.17 (C-6′), 55.89 (C-8), 55.16 (C-8′), 47.33 (C-3), 46.92 (C-3′), 29.24 (2′-CH3), 28.69 (2-CH3) [12, 13], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物3为aurasperone B。
化合物4：微黄色粉末。分子式：C32H28O11, ESI-MS m/z: 587 [M-H]−。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 14.77 (s, 1H, 5-OH), 14.52 (s, 1H, 5′-OH), 7.12 (s, 1H, H-10), 6.97 (s, 1H, H-9), 6.36 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-7′), 6.13 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-9′), 6.04 (s, 1H, H-3), 4.00 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.82 (s, 3H, 8-OCH3), 3.64 (s, 3H, 8′-OCH3), 3.42 (s, 3H, 6-OCH3), 2.92 (d, J = 8.7 Hz, 2H, 3′-H2), 2.40 (s, 3H, 2-CH3), 1.48 (s, 3H, 2′-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 197.49 (C-4′), 184.46 (C-4), 167.68 (C-2), 164.96 (C-8′), 162.18 (C-8), 161.89 (C-6′), 161.86 (C-6), 160.22 (C-5), 157.40 (C-5′), 153.18 (C-10a), 151.30 (C-10a′), 142.62 (C-9a), 140.21 (C-9a′), 118.64 (C-7), 111.39 (C-5a), 107.83 (C-5a′), 107.36 (C-3), 106.62 (C-10′), 104.72 (C-4a), 103.84 (C-4a′), 101.75 (C-9), 101.18 (C-10), 100.23 (C-2′), 97.44 (C-7′), 96.23 (C-9′), 61.78 (6-OCH3), 56.19 (6′-OCH3), 55.90 (8-OCH3), 55.15 (8′-OCH3), 46.88 (C-3′), 28.86 (2′-CH3), 20.74 (2-CH3) [14, 15], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物4为fonsecinone B。
化合物5：淡黄色粉末。分子式：C32H28O11, ESI-MS m/z: 589 [M+H]+。 1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 14.94 (brs, 1H), 14.17 (d, J = 4.3 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H, H-10), 6.86 (d, J = 3.7 Hz, 1H, H-9), 6.73 (d, J = 3.3 Hz, 1H, H-7′), 6.43 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-9′), 6.24 (d, J = 2.3 Hz, 1H, H-3′), 6.00 (t, J = 15.3 Hz, 1H, 2-OH), 4.04 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.78 (s, 3H, 8-OCH3), 3.65 (d, J = 1.4 Hz, 3H, 8′-OCH3), 3.44 (s, 3H, 6-OCH3), 3.13～2.94 (m, 2H, 3-H2), 2.21～2.10 (m, 3H, 2′-CH3), 1.82 (s, 3H, 2-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 196.59 (C-4), 184.58 (C-4′), 167.56 (C-2′), 164.06 (C-8), 162.63 (C-8′), 161.43 (C-6′), 161.04 (C-6), 160.96 (C-5), 159.43 (C-5′), 153.32 (C-10a′), 150.80 (C-10a), 142.74 (C-9a), 140.71 (C-9a′), 116.80 (C-7), 110.70 (C-5a′), 108.57 (C-5a), 107.20 (C-3′), 105.17 (C-10), 104.25 (C-4a′), 103.51 (C-4a), 102.67 (C-9), 101.85 (C-10′), 100.12 (C-2), 96.96 (C-7′), 96.49 (C-9′), 61.87 (6′-OCH3), 56.19 (6-OCH3), 55.91 (8′-OCH3), 55.18 (8-OCH3), 47.35 (C-3), 28.68 (2-CH3), 20.68 (2′-CH3) [12, 14], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物5为fonsecinone D。
化合物6：黄色粉末。分子式：C13H11NO3, ESI-MS m/z: 230 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 9.11 (s, 1H, 4-OH), 8.75 (s, 1H, H-2), 7.42～7.37 (m, 2H, H-9, 13), 7.37～7.31 (m, 1H, H-11), 7.26 (dt, J = 6.2, 1.4 Hz, 2H, H-10, 12), 6.27 (s, 1H, H-5), 6.03 (s, 1H, 3-OH), 3.91 (s, 2H, 7-H2); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 178.08 (C-3), 168.85 (C-6a), 164.15 (C-4), 162.07 (C-2), 133.79 (C-8), 129.12 (C-9,13), 127.83 (C-10,12), 119.26 (C-3a), 116.06 (C-5), 39.60 (C-7) [16], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物6为tensidol A。
化合物7：黄色粉末。分子式：C32H26O10, ESI-MS m/z: 571 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 15.22 (brs, 1H,5′-OH), 12.81 (brs, 1H, 5-OH), 7.08 (s, 1H, H-6), 7.00 (s, 1H, H-7), 6.46 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-7′), 6.37 (s, 1H, H-3), 6.22 (d, J = 2.1 Hz, 1H, H-9′), 6.04 (s, 1H, H-3′), 4.06 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.81 (s, 3H, 8-OCH3), 3.65 (s, 3H, 8′-OCH3), 3.46 (s, 3H, 10-OCH3), 2.52 (s, 3H, 2-CH3), 2.15 (s, 3H, 2′-CH3); 13C NMR (151 MHz, Chloroform-d) δC: 184.59 (C-4′), 183.01 (C-4), 167.48 (C-2), 166.87 (C-2′), 162.83 (C-5′), 161.61 (C-8′), 161.16 (C-6′), 160.07 (C-8), 156.96 (C-10), 156.69 (C-5), 155.15 (C-11), 150.86 (C-10a′), 140.82 (C-6a), 140.67 (C-9a′), 117.16 (C-9), 110.68 (C-3), 108.65(C-5a′), 108.01 (C-10a), 107.37 (C-3′), 106.07 (C-6), 105.05 (C-10′), 104.28 (C-4a′), 101.57 (C-7), 97.03(C-7′), 96.36 (C-9′), 61.21 (10-OCH3), 56.23 (6′-OCH3), 55.98 (8-OCH3), 55.18 (8′-OCH3), 20.67 (2′-CH3), 20.55 (2-CH3) [15, 17], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物7为fonsecinone A。
化合物8：黄色粉末。分子式：C32H28O11, ESI-MS m/z: 588 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 14.55 (s, 1H, 5′-OH), 12.79 (s, 1H, 5-OH), 7.07 (s, 1H, H-7), 7.02 (s, 1H, H-6), 6.41 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-7′), 6.37～6.35 (m, 1H, H-3), 6.17 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-9′), 4.04 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.86 (s, 3H, 8-OCH3), 3.67 (s, 3H, 8′-OCH3), 3.42 (s, 3H, 6-OCH3), 2.97 (d, J = 18.4 Hz, 2H, 3′-H2), 2.51 (s, 3H, 2-CH3), 1.49 (s, 3H, 2′-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 197.18 (C-4′),182.70 (C-4), 166.66 (C-2), 165.11 (C-8′), 162.45 (C-8), 161.91 (C-6′), 160.06 (C-10), 156.55 (C-5), 155.61 (C-5′), 154.98 (C-11), 151.13 (C-10a′), 142.53 (C-6a), 140.45 (C-9a′), 118.17 (C-9), 110.74 (C-10′), 109.4 (C-10a), 107.93 (C-5a′), 107.90 (C-3), 106.58 (C-10), 106.05 (C-4a), 103.71 (C-4a′), 102.01 (C-6), 100.22 (C-2′), 97.31 (C-7′), 96.49 (C-9′), 61.13 (10-OCH3), 56.20 (6′-OCH3), 55.98 (8-OCH3), 55.21 (8′-OCH3), 46.65 (C-3′), 29.16 (2′-CH3), 20.51 (2-CH3) [15], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物8为fonsecinone C。
化合物9：黄色粉末。分子式：C32H26O10, ESI-MS m/z: 571 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 15.20 (s, 1H, 5′-OH), 14.79 (s, 1H, 5-OH), 7.11 (s, 1H, H-10), 6.93 (s, 1H, H-9), 6.37 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-7′), 6.17 (d, J = 2.2 Hz, 1H, H-9′), 6.01 (d, J = 0.8 Hz, 1H, H-3), 5.94 (d, J = 0.8 Hz, 1H, H-3′), 3.98 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.74 (s, 3H, 8-OCH3), 3.58 (s, 3H, 8′-OCH3), 3.42 (s, 3H, 6-OCH3), 2.37 (d, J = 0.7 Hz, 3H, 2-CH3), 2.07 (d, J = 0.7 Hz, 3H, 2′-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 184.60 (C-4′), 184.43 (C-4), 167.62 (C-2), 167.54 (C-2′), 162.72 (C-5′), 162.01 (C-5), 161.41 (C-8′), 161.07(C-6′), 160.20 (C-8), 158.61 (C-6), 153.37 (C-10a), 150.84 (C-10a′), 140.70 (C-9a), 140.55 (C-9a′), 117.63 (C-7), 111.45 (C-5a), 108.59 (C-5a′), 107.44 (C-3), 107.26 (C-3′), 105.17 (C-10′), 104.73 (C-4a), 104.27 (C-4a′), 101.35 (C-9), 101.21 (C-10), 96.88 (C-7′), 96.53 (C-9′), 62.01 (6-OCH3), 56.21 (6′-OCH3), 55.91 (8-OCH3), 55.13 (8′-OCH3), 20.75 (2-CH3), 20.68 (2′-CH3) [11, 17], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物9为aurasperone A。
化合物10：黄色粉末。分子式：C31H26O11, ESI-MS m/z: 575 [M+H]+。1H NMR (600 MHz, Chloroform-d) δH: 15.11 (s, 1H, 5′-OH), 14.28 (s, 1H, 5-OH), 7.05 (s, 1H, H-9), 6.68 (d, J = 2.4, 1H, H-7′), 6.28 (d, J = 2.4, 1H, H-9′), 5.95 (s, 1H, H-10), 5.91 (s, 1H, H-3′), 3.86 (s, 3H, 6′-OCH3), 3.69 (s, 3H, 8′-OCH3), 3.42 (s, 3H, 6-OCH3), 3.00 (dd, J = 16.9, 3.8 Hz, 2H, 3-H2), 2.14 (s, 3H, 2′-CH3), 1.28 (s, 3H, 2-CH3); 13C NMR (150 MHz, Chloroform-d) δC: 196.48 (C-4), 184.14 (C-4′), 168.21 (C-2′), 164.48 (C-5), 163.38 (C-5′), 162.22 (C-8′), 160.92 (C-6′), 159.81 (C-8), 157.63 (C-6), 152.99 (C-10a), 151.98 (C-10a′), 142.79 (C-9a), 140.72 (C-9a′), 115.05 (C-7), 110.59 (C-5a), 108.45 (C-5a′), 107.32 (C-3′), 106.50 (C-9), 106.48 (C-10′), 104.14 (C-4a′), 103.30 (C-4a), 102.31 (C-10), 100.02 (C-2), 97.21 (C-9′), 95.94 (C-7′), 62.03 (6-OCH3), 55.86 (6′-OCH3), 55.31 (8′-OCH3), 47.19 (C-3), 28.80 (2-CH3), 20.72 (2′-CH3) [18], 以上波谱数据与文献对照一致，确定化合物10为aurasperone F。
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本研究选取从金线莲植株中分离得到的一株内生真菌Aspergillus sp. J218为研究对象，从其大米固体发酵产物中共分离鉴定出10个化合物。其中化合物3、4、5、7、8、9、10均为二聚萘并吡喃酮类化合物，化合物1为香豆素类化合物二聚体。据报道，萘并吡喃酮类化合物的单体及二聚体类广泛分布于曲霉属和镰刀属真菌的次级代谢产物中，二聚萘并吡喃酮类化合物对多种致病菌，如绿脓杆菌、克鲁斯假丝酵母、幽门螺杆菌等，有中等抑菌活性[19]，对多种癌细胞如MDA-MB-231、PANC-1、A549等表现出一定抑制活性[20-21]。研究表明，化合物7和9对幽门螺杆菌具有中等抑制活性[22]；化合物8对 A549、HL-60 和 MGC-803细胞具有不用程度抑制作用[23]；化合物6能够增强咪康唑对白色念珠菌的抑制活性[24]；化合物1对枯草芽孢杆菌和尖孢镰刀菌具有一定的抑制作用[25]。由此可见，从Aspergillus sp. J218中分离鉴定的多数化合物对病原微生物具有一定的抑制作用，提示该菌株在提升宿主植物抗病性方面具有潜在的应用价值；所鉴定化学结构类型提示该菌株含有丰富的二聚化合成酶，但相关研究较少。Frandsen等推测二聚萘并吡喃酮类化合物是由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A分子经过一系列缩合、甲基化和氧化还原反应形成萘并吡喃酮单体，再由一种假定的漆酶Gip1将单体羟基上一个电子移除，然后通过电子重排形成碳活化单体，自身或相互偶联形成二聚体[26]；徐丹等[27]发现二聚萘并吡喃酮化合物ustilaginoidins中C-2和C-3双键的还原是由一种磷脂甲基转移酶（UsgR）催化形成，这种还原酶对线性萘并-γ-吡喃酮单体的还原具有特异性，但对二聚体则无特异性，而漆酶（UsgL）对各种单体的阻转异构选择性偶联导致了ustilaginoidins系列衍生物的结构多样性。上述研究为该菌株后续探索该类芳香族聚酮化合物二聚化的生物合成途径提供了一条线索。
Secondary metabolites of endophytic fungus Aspergillus sp. J218 from Anectochilus roxburhii
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摘要:
目的 研究从金线莲Anectochilus roxburhii中分离的一株曲霉属内生真菌Aspergillus sp. J218的次生代谢产物。 方法 利用Sephadex LH-20凝胶、硅胶和高效液相制备等色谱法从J218固体发酵产物的乙酸乙酯部位分离化合物，采用波谱方法对化合物进行结构鉴定。 结果 从金线莲内生真菌Aspergillus sp. J218的次生代谢产物中共分离得到10个化合物，分别鉴定为kotanin（ 1 ）、flavasperone（ 2 ）、aurasperone B（ 3 ）、fonsecinone B（ 4 ）、fonsecinone D（ 5 ）、tensidol A（ 6 ）、fonsecinone A（ 7 ）、fonsecinone C（ 8 ）、aurasperone A（ 9 ）和fonsecinone F（ 10 ）。 结论 从金线莲内生真菌曲霉属Aspergillus sp J218次生代谢产物分离鉴定多为二聚萘并吡喃酮类化合物，提示该菌株含有丰富的二聚化合成酶，可为后续探索该菌株中二聚萘并吡喃酮类化合物的生物合成途径提供线索。 -
关键词:
- 曲霉属 /
- 金线莲 /
- 内生真菌 /
- 次生代谢产物 /
- 二聚萘并吡喃酮类化合物
Abstract:Objective To isolate the secondary metabolites of endophytic fungus Aspergillus sp. J218 from Anectochilus roxburhii. Methods Different chromatographic methods, including Sephadex LH-20 and silica gel chromatography as well as HPLC, were used to isolate compounds from the EtOAc fraction of the solid fermentation of J218, and their structures were identified by spectral methods. Results Ten compounds were isolated from the fermentation of J218 and their structures were individually identified as kotanin（ 1 ）, flavasperone（ 2 ）, aurasperone B（ 3 ）, fonsecinone B（ 4 ）, fonsecinone D（ 5 ）, ensidol A（ 6 ）, fonsecinone A（ 7 ）, fonsecinone C（ 8 ）, aurasperone A（ 9 ）, and fonsecinone F（ 10 ）. Conclusion Most compounds isolated from endophytic fungus Aspergillus sp. J218 in Anectochilus roxburhii were identified as dimeric naphthopyrones. These results suggest that this strain contains rich dimerization synthase, which could provide clues for the further exploration of the rational biosynthesis pathway of dimeric naphthopyrones in this strain. -
高原是指海拔高于2 500 m能够引起机体产生明显生物学效应的地区[1]。高原低氧环境会影响机体的生理功能与药物疗效的发挥[2]。高原地区高血压患病率显著高于平原地区，高血压是高原地区最常见的慢性疾病和心血管疾病的严重危险因素。临床上最常使用钙通道阻滞剂类降压药（CCB）[3]，硝苯地平是治疗高血压的一线用药，通过阻断血管平滑肌细胞上的钙通道从而扩张血管降低血压，同时阻断心肌细胞L型钙通道从而减慢心率[4]。本课题组前期研究表明，急进高原后大鼠体内硝苯地平的药动学参数会发生显著变化[5]。由于高原低氧环境导致药物的药动学参数改变，体内血药浓度可能达不到有效治疗浓度，从而影响硝苯地平降压效果，但目前有关硝苯地平对高原高血压人群的疗效研究尚未见报道。本研究首次报道高原低氧环境下硝苯地平控释片对高血压患者降压作用的临床疗效及安全性评价，从而为高原高血压人群提供有效治疗方案，为临床合理用药提供参考。
1. 材料与方法
1.1 病例选择
研究对象为2020年2月至2021年2月于中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院及玉树八一医院诊治的共84例高血压患者。本研究经第九四〇医院伦理委员会批准，审批编号为2019KYLL068。
1.1.1 诊断与入选标准
①符合《中国高血压防治指南》中关于高血压的诊断标准[6]，即非同日3次所测量的诊室血压：收缩压（SBP）≥140 mmHg和（或）舒张压（DBP）≥90 mmHg的患者；②高原高血压患者为久居高原1年及以上者，平原高血压患者为久居平原1年及以上者，两组患者近1个月内未服用降压药物；③入院后连续每日晨起服用硝苯地平控释片30 mg，连续6 d达到稳态血药浓度者；④年龄40～85岁。
1.1.2 排除标准
①继发性高血压或临床诊断为病危者；②伴发有严重心脑血管疾病者。③肝功能异常者，丙氨酸氨基转移酶（ALT）或天冬氨酸氨基转移酶（AST）超过上限1.5倍者；④肾功能异常者或存在影响肾功能的急性因素者。
1.2 药品
硝苯地平控释片，规格：30 mg/片，批号：IX20200382，批准文号：国药准字J20180025，德国Bayer AG公司生产。
1.3 分组与治疗方法
将42例第九四〇医院高血压住院患者（海拔1 500 m）设为平原高血压组，42例八一医院高血压住院患者（海拔3 800 m）设为高原高血压组。两组患者均给予硝苯地平控释片每日晨起口服30 mg，连续6 d。
1.4 观察指标与疗效判定
根据我国总结和规定的降压药临床研究指导原则：将血压作为药效评价的主要指标，将记录的平原与高原组血压值，按照疗效标准等级：显效、有效、无效进行评价。考察相同剂量下，高原低氧环境对硝苯地平降压疗效的影响。监测平原高血压组和高原高血压组患者按照每日晨起口服30 mg硝苯地平控释片连续6 d的血压值，包括每天清晨、服药前及临睡前3个时段的SBP和DBP。具体操作为：在患者平躺情况下，对每个时间段的每次血压均测定3次，计算出平均值。疗效判定按文献[7-8]的方法对3个时间段的血压进行评价，分为显效、有效和无效。显效：SBP下降幅度≥10 mmHg并降至正常或SBP未达正常但下降幅度≥20 mmHg；有效：SBP下降1~10 mmHg并降至正常或SBP未降至正常但下降10~19 mmHg;无效：未达到上述标准。对总有效率（总有效率=显效率+有效率）进行统计学比较，以判定疗效。
此外，临床研究显示，较快的心率会显著增加高血压患者心血管事件和病死率[9-11]。依据专家建议，高血压患者应首先控制血压达标，在降压治疗的同时注重心率管理[12]。硝苯地平控释片具有反射性刺激交感神经激活的作用，可能导致心率加快引起心悸等不良反应。根据国内外指南和专家共识，在测定血压时一并测得心率，详细记录清晨、服药前、临睡前的心率。
1.5 统计学处理
用SPSS Statistics 21进行统计分析。计量资料用
$ \bar x \pm s $ 表示，组间比较用独立样本t检验，组内比较用卡方检验；计数资料用率表示，比较用卡方检验。2. 结果
2.1 一般资料
调查内容包括一般人口学资料、身高、体重、BMI、ALT、AST、Cr等。平原高血压组及高原高血压组的AST、ALT、Cr值均符合纳入排除标准，患者伴发疾病及合并用药较少。两组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义（P>0.05），组间具有可比性，见表1。
表 1 平原高血压组和高原高血压组患者的一般资料比较（$ \bar x \pm s $ ，n=42）项目 平原高血压组 高原高血压组 性别（男/女） 30/12 22/20 年龄 61.24±8.02 60.19±9.28 身高（l/cm） 168.79±9.09 168.31±6.45 体重（m/kg） 69.30±10.64 67.29±7.36 BMI （kg/m2） 24.23±2.45 23.80±2.54 AST（U/L） 21.31±8.87 25.14±9.77 ALT（U/L） 27.14±16.90 28.38±15.37 Cr（μmol/L） 74.93±17.33 76.17±19.79 2.2 高原及平原高血压人群血压值统计
依据临床血压监测指导原则，测定了3个不同时间段的血压值，分别为清晨、用药前及临睡前的血压。治疗前，高原高血压组的清晨DBP、服药前及临睡前的SBP和DBP均显著高于平原高血压组，且高原组舒张压升高更为显著。连续用药6 d后，平原高血压组的清晨、服药前及临睡前SBP均显著低于治疗前（P<0.01）。高原高血压组治疗前后的各时间段SBP和DBP均显著高于平原高血压组，差异均有统计学意义（P<0.05），但高原组治疗后与治疗前相比无显著性差异，且血压未降至正常，可见高原高血压组服用硝苯地平在6 d内的降血压疗效比平原高血压组差，详见表2。
表 2 平原高血压组和高原高血压组不同时段血压值比较（mmHg，$ \bar x \pm s $ ，n=42）组别 检测时间 SBP DBP 清晨 服药前 临睡前 清晨 服药前 临睡前 平原高血压组 治疗前 151.14±15.70 146.90±10.45 148.93±12.39 89.43±13.11 87.48±10.30 89.62±11.60 治疗后 138.86±14.66## 137.93±14.44# 137.95±17.82# 86.90±12.52 86.05±14.06 85.05±12.70 高原高血压组 治疗前 154.55±12.29 153.38±11.66** 154.60±11.98* 104.67±17.18*** 106.86±15.09*** 106.64±14.18*** 治疗后 148.93±19.76* 148.55±19.28** 149.10±20.00** 100.07±16.11*** 102.19±16.60*** 101.86±15.89*** *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001，与平原高血压组比较；#P<0.05，##P<0.01，与治疗前比较。 采用配对样本t检验判断硝苯地平治疗前后对平原高血压组和高原高血压组患者血压的影响，表3结果显示，平原高血压组治疗前后的清晨、服药前及临睡前SBP、临睡前DBP有统计学差异，高原高血压组治疗前后各时间段的SBP和DBP无统计学差异。
表 3 平原高血压组和高原高血压组患者治疗前后血压下降值比较（mmHg，$ \bar x \pm s $ ，n=42）组别 SBP下降值 DBP下降值 清晨 服药前 临睡前 清晨 服药前 临睡前 平原高血压组 12.29±17.10*** 8.98±15.40** 10.98±17.70*** 2.52±10.56 1.43±12.36 4.57±10.43** 高原高血压组 5.62±16.72 4.83±19.17 5.50±19.58 4.59±16.94 4.67±17.91 4.78±17.59 **P<0.01, ***P<0.001，与治疗前清晨、服药前、临睡前比较。 2.3 平原高血压组和高原高血压组患者的临床疗效评价
专家建议将研究结束时给药间隔末（谷值时）血压与基线血压的差值作为主要疗效指标[8]，本研究中选用服药前时间段的治疗前后血压之差进行疗效评价。高原高血压组和平原高血压组的总有效率分别为47.62%（20例/42例）和76.19%（32例/42例），高原高血压组硝苯地平控释片降压总有效率显著低于平原高血压组（P<0.05），见表4。
表 4 平原高血压组和高原高血压组患者的临床疗效比较[例（%），n=42]组别 显效 有效 无效 总有效率 平原高血压组 24（57.14） 8（19.05） 10（23.81） 32（76.19） 高原高血压组 13（30.95） 7（16.67） 22（52.38） 20（47.62）* *P<0.05，与平原高血压组比较。 两组患者均按照医嘱连续服药，获得81例患者不同时段心率数据。其中，平原高血压组41例，高原高血压组40例。高原高血压组各时间段的心率均显著高于平原高血压组，证实高原低氧环境会导致心率显著上升。连续用药6 d后，平原高血压组的清晨及服药前心率显著低于治疗前（P<0.05），高原高血压组心率有所下降，但无显著性差异（P>0.05），见表5。提示应在降压治疗的同时关注心率管理，以预防心血管事件的发生。
表 5 平原高血压组与高原组患者心率指标比较（$ \bar x \pm s $ ）组别 治疗前 治疗后 清晨 服药前 临睡前 清晨 服药前 临睡前 平原高血压组 109.51±17.46 110.37±17.90 109.85±17.62 100.46±21.13# 101.46±21.88# 101.39±21.42 高原高血压组 119.03±13.96** 119.70±14.64* 119.43±14.05** 113.65±20.22** 113.18±19.56* 114.55±19.55** *P<0.05，**P<0.01，与平原高血压组比较；#P<0.05，与治疗前比较。 2.4 安全性评价
在试验过程中，平原高血压组5例患者发生心动过速、心悸的症状，高原高血压组6例患者发生心动过速、心悸的症状。两组患者的药物不良反应发生率分别为11.90%和14.29%，差异无统计学意义（P>0.05）。
3. 讨论
本研究结果表明，高原高血压组的血压和心率值均显著高于平原高血压组，且高原高血压组血压控制不良、心率管理不佳，高原高血压患者服用与平原高血压患者同剂量的硝苯地平控释片未能有效地控制短期内血压。高原地区硝苯地平用药剂量应高于平原剂量，因此有必要建议《中国高血压防治指南》可增加一项高原地区高血压人群用药剂量。以增加药物在机体内的血药浓度，从而长期有效控制血压，与此同时需做好高血压患者服药前后血压的监测及患者安全用药教育，减少药物不良反应的发生，从而提高高原地区用药的合理性、安全性及有效性。
高原合理用药展望，目前，高原地区的合理用药指导有待提高，原因有以下几点：①地域偏远、文化差异及经济欠发达导致高原地区医护人员的合理用药意识存在局限性。此外，高原地区高血压的患病率高于全国平均水平，但患者的知晓率、治疗率和控制率明显偏低[13]。②高血压是心血管系统中最常见的慢性疾病，可诱发许多并发症，高血压严重危害高原地区人群的生命健康，降低血压可随之降低心血管疾病并发率，改善预后[14-15]，但高原地区患者服药的依从性差，不能长期遵医嘱服药，导致血压控制不佳，增加心血管疾病患病风险。③高原低氧环境会改变药物药动学参数从而影响药物疗效，但高原地区人体的药动学研究少有报道。从事高原合理用药研究的相关人员较少，高原人群的特殊用药至今未列入研究的议事日程。高原低氧环境导致药动学改变从而导致药效的差异是个体化合理用药中必须考虑的问题。综上，针对高原地区沿用平原临床用药方案的问题亟需解决，应着重研究高原与平原地区合理用药的临床疗效差异，发布高原地区合理用药指南，培养和提高高原地区医护人员合理用药意识，提高患者对疾病的知晓率、治疗率和控制率，提高患者用药依从性。
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