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黑豆是由豆科植物大豆[Glycine max (Linn.) Merr.]的成熟种子,淡豆豉是由黑豆经发酵后加工而成[1]。淡豆豉性味苦且辛凉,具有解表、除烦和清解郁热的功效,可用于治疗头痛感冒、胸闷烦躁、失眠等症状。淡豆豉中含有异黄酮、多糖、氨基酸、蛋白、皂苷、纤溶酶等成分,其中异黄酮类被广泛认为是主要活性成分之一。研究发现,淡豆豉还具有抗细菌、降低血糖、调节肠道菌群及抗癌等药理活性[2-6]。
本课题组按照前期优化的发酵工艺自制淡豆豉,并建立通过高效液相色谱对淡豆豉中6种异黄酮进行含量测定的方法[7-8]。依据建立的分析方法对发酵前的黑豆、发酵后的半成品和成品淡豆豉中6种异黄酮的含量进行检测,比较黑豆发酵前后和不同程度发酵条件下淡豆豉中6种异黄酮的含量变化,为进一步完善淡豆豉的发酵工艺和深入研究淡豆豉中异黄酮类化合物的药理活性奠定研究基础。
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根据《中国药典》中淡豆豉的制作标准[1],按质量比1∶1∶10称量青蒿、桑叶和黑豆,用量筒量取青蒿桑叶总质量的8倍水,将青蒿、桑叶倒入圆底烧瓶中,加入量好的水,冷凝回流煎煮1 h,将煎煮好的中药用尼龙纱布过滤,药渣放入托盘中,滤液倒入烧杯中。将处理后的黑豆放入滤液中,浸泡16 h。取出黑豆,放入蒸煮锅蒸煮1 h。晾约1 h至黑豆表面基本干燥,之后放入烧杯中,将一定量的半干半湿的青蒿桑叶置于黑豆上层,覆盖1.5 cm,置于35 ℃、湿度50%的恒温培养箱中发酵,6天后取出一半,做为半成品淡豆豉样品。剩余一半清洗稍晾后继续放入烧杯中,上层覆盖干燥的混匀后的青蒿、桑叶,置于35 ℃、湿度50%的恒温培养箱继续发酵15天,即为成品淡豆豉样品。
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精密称取对照品大豆苷10.93 mg、黄豆黄苷10.18 mg、染料木苷10.84 mg、大豆苷元5.09 mg、黄豆黄素5.19 mg和染料木素8.95 mg,分别加入甲醇超声溶解,于10 ml容量瓶内定容,制成浓度分别为1093 μg/ml、1018 μg/ml、1084 μg/ml、509 μg/ml、519 μg/ml和895 μg/ml的单一对照品储备液,再分别精密量取6种异黄酮对照品储备液适量,用甲醇稀释,配制成一系列浓度的混合对照品溶液[9-10]。
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将黑豆及自制淡豆豉样品60 ℃干燥,粉碎,过四号筛。取样品粉末约0.5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入10 ml色谱甲醇,混匀,超声处理2 h,放冷,再次称重,甲醇补足减失重,摇匀,进样前用 0.45 μm 滤膜滤过,取续滤液,得供试品溶液。
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色谱柱:DiamonsilC18(4.6×250 mm,5 μm);流动相为0.2%醋酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱(0~6 min,20%B;6~7 min,20%~40%B;7~12 min,40%B;12~22 min,40%~60%B;22~27 min,60%B;27~35 min,60%~90%B;35~40 min,90%B;40~41 min,90%~20%B;41~45 min,20%B),流速:1.0 ml/min;柱温:30 ℃;检测波长:260 nm;进样量:10 μl。空白溶剂、对照品、黑豆和淡豆豉样品色谱峰如图1所示。大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的保留时间依次为16.72 min、17.56 min、20.63 min、27.40 min、28.03 min和30.95 min。
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分别精密量取“2.1”项下对照品储备液溶液适量,置同一10ml容量瓶中,加50%甲醇至刻度,即得大豆苷54.65 μg/ml、黄豆黄苷50.90 μg/ml、染料木苷54.20 μg/ml、大豆苷元50.90 μg/ml、黄豆黄素51.90 μg/ml和染料木素44.75 μg/ml混合对照品溶液。取混合对照品溶液加50%甲醇进行逐级稀释,制成系列浓度的混合对照品溶液,进样分析。将信噪比大于且接近于10的对照品溶液浓度作为定量限(LOQ),对于高于定量限的系列浓度的混合对照品溶液,以峰面积(Y)为纵坐标、浓度(X)为横坐标,进行线性回归,得到大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的标准曲线,结果见表1。结果显示 6 种化学成分在相应浓度范围内呈现良好线性关系。
表 1 6种异黄酮标准曲线试验结果
成分 回归方程 线性范围
(μg/ml)r LOQ
(μg/ml)大豆苷 Y=36742X-10999 1.093~54.65 0.9999 0.1093 黄豆黄苷 Y=46941X-14743 1.018~50.90 0.9999 0.1018 染料木苷 Y=49764X-18948 1.084~54.20 0.9999 0.1084 大豆苷元 Y=49161X-14614 1.018~50.90 0.9999 0.1018 黄豆黄素 Y=32743X-8632.1 1.038~51.90 0.9993 0.1038 染料木素 Y=80493X-27200 0.895~44.75 0.9999 0.0895 -
取浓度分别为低、中、高的对照品溶液,在同一天内连续重复进样3次,以峰面积计算3次结果的RSD值。低浓度对照品中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素峰面积结果的RSD值分别为1.83%、0.39%、1.56%、1.45%、2.89%和0.59%;中浓度对照品中6种异黄酮成分峰面积结果的RSD值分别为0.08%、0.05%、0.05%、0.01%、0.41%和0.07%;高浓度对照品中6种异黄酮成分面积结果的RSD值分别为0.48%、0.42%、0.38%、0.44%、1.10%和0.59%。结果表明,此方法的日内精密度良好。
取浓度分别为低、中、高的对照品溶液,连续3天进样检测,以峰面积计算3次结果的RSD值。低浓度对照品中6种异黄酮成分峰面积结果的RSD值分别为0.13%、3.72%、3.52%、2.33%、2.15%和1.18%;中浓度对照品中6种异黄酮成分峰面积结果的RSD值分别为2.46%、2.61%、2.58%、2.28%、1.06%和1.81%;高浓度对照品中6种异黄酮成分面积结果的RSD值分别为3.44%、3.62%、3.70%、3.37%、3.08%和2.98%。结果表明,此方法的日间精密度良好。
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取同一批自制淡豆豉按上述条件制备 6 份供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样测定, 6种异黄酮大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素的平均含量分别为124.2 μg/g、37.11 μg/g、252.5 μg/g、273.4 μg/g、58.65 μg/g、283.3 μg/g,并计算含量的RSD值分别为1.89%、1.79%、2.50%、2.04%、2.51%、2.67%,结果表明该方法的重复性良好。
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取同一批自制淡豆豉的供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件,在制备后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h进样测定。测定6种异黄酮的峰面积,计算6种异黄酮峰面积的RSD 值,结果分别为1.93%、2.43%、0.94%、0.88%、1.01%和0.89%,结果表明供试品溶液在室温下放置8h的稳定性良好。
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取重复性试验同批次淡豆豉粉末约0.5 g,精密称定,平行6份,分别置于具塞锥形瓶中,每份分别精密加入近似等量的 6种对照品溶液,精密加入色谱甲醇至10 ml,混匀,超声处理2h,放冷,再次称重,甲醇补足减失重,摇匀,进样前用0.45 μm滤膜滤过,取续滤液,得加样回收供试品溶液。按上述色谱条件测定各成分的峰面积,计算各个化合物的回收率和回收率的RSD值,结果见表2。结果表明该方法回收率良好。
表 2 加样回收率试验结果
成分 药材粉末称量(g) 原有量(μg) 加入量(μg) 测得量(μg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 大豆苷 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.501263.16
63.58
64.16
63.21
64.20
64.3064.78
64.78
64.78
64.78
64.78
64.78121.5
123.7
123.2
121.5
123.9
124.490.11
92.79
91.20
90.05
92.21
92.7091.51 1.36 黄豆黄苷 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.501218.02
18.14
18.31
18.04
18.32
18.3518.48
18.48
18.48
18.48
18.48
18.4837.69
37.42
37.81
37.18
37.90
37.82106.4
104.3
105.5
103.5
106.0
105.3105.2 1.02 染料木苷 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.5012110.6
111.4
112.4
110.7
112.4
112.6113.4
113.4
113.4
113.4
113.4
113.4215.8
213.8
216.4
213.4
217.2
217.292.73
90.32
91.64
90.49
92.29
92.2291.61 1.09 大豆苷元 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.5012126.0
126.8
128.0
126.1
128.1
128.3129.2
129.2
129.2
129.2
129.2
129.2248.7
247.6
250.1
246.7
250.8
251.294.94
93.44
94.49
93.31
95.01
95.1094.38 0.86 黄豆黄素 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.501229.77
29.97
30.24
29.79
30.26
30.3130.53
30.53
30.53
30.53
30.53
30.5358.40
57.78
58.05
57.37
58.22
58.4493.77
91.08
91.10
90.34
91.59
92.1691.67 1.30 染料木素 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.5012127.2
128.0
129.2
127.2
129.2
129.4130.4
130.4
130.4
130.4
130.4
130.4254.0
253.8
256.9
253.4
257.9
257.897.25
96.43
97.98
96.75
98.69
98.4097.58 0.94
Comparison of contents variation of six isoflavones in black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum
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摘要:
目的 比较发酵前的黑豆及半成品和成品淡豆豉中大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆苷元、黄豆黄素和染料木素 6 种异黄酮的含量变化。 方法 采用高效液相色谱法测定异黄酮的含量,色谱条件为DiamonsilC18色谱柱(4.6×250 mm,5 μm),柱温30 ℃,检测波长为260 nm,流动相为0.2%醋酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脱,流速为1.0 ml/min。 结果 该方法测定6种异黄酮成分在测定范围内线性良好(r≥0.999 3),且回收率符合要求,黑豆经发酵后其中的6种异黄酮含量明显提升,且成品淡豆豉比半成品淡豆豉中含量更多。 结论 本研究建立的高效液相色谱法能够准确测定淡豆豉中6种异黄酮的含量。发酵可提升黑豆中的异黄酮的含量,且在发酵过程中结合型异黄酮向游离型异黄酮苷元转化。 Abstract:Objective To compare the contents variation of six flavonoids includingdaidzin, glycitin, genistin, daidzein, glycitein and genisteinin black beans, semifinished and finished Sojae Semen Praeparatum.Methods The contents of flavonoids were determined by HPLC, the condition were Diamonsil C18 column (4.6×250 mm, 5 μm) , column temperature 30 ℃, detection wavelength 260 nm, mobile phase 0.2% acetic acid water (A) - methanol (B), gradient elution, flow rate 1.0 ml/min. Results The linearity of this method to determine 6 isoflavones was good (r≥0.9993) within the determination range, and the recovery rate met the requirements. The RSD of precision, repeatability and stability experiment was less than 4%, 3%and 3%. The results of HPLC showed that the contents of six flavonoidsin Sojae Semen Praeparatum increased significantly compared with black beans. And, the contents of six flavonoids in finished Sojae Semen Praeparatum were slightly more than those in semifinished Sojae Semen Praeparatum. Conclusion The HPLC method established in this study could accurately determine the content of 6 isoflavones in Sojae Semen Praeparatum. The content of six isoflavones in black beans could be increased by the fermentation, and the combined isoflavones were transformed into free isoflavones during the fermentation process. -
Key words:
- black beans /
- Sojae Semen Praeparatum /
- daidzin /
- glycitin /
- genistin /
- daidzein /
- glycitein /
- genistein
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表 1 6种异黄酮标准曲线试验结果
成分 回归方程 线性范围
(μg/ml)r LOQ
(μg/ml)大豆苷 Y=36742X-10999 1.093~54.65 0.9999 0.1093 黄豆黄苷 Y=46941X-14743 1.018~50.90 0.9999 0.1018 染料木苷 Y=49764X-18948 1.084~54.20 0.9999 0.1084 大豆苷元 Y=49161X-14614 1.018~50.90 0.9999 0.1018 黄豆黄素 Y=32743X-8632.1 1.038~51.90 0.9993 0.1038 染料木素 Y=80493X-27200 0.895~44.75 0.9999 0.0895 表 2 加样回收率试验结果
成分 药材粉末称量(g) 原有量(μg) 加入量(μg) 测得量(μg) 回收率(%) 平均回收率(%) RSD(%) 大豆苷 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.501263.16
63.58
64.16
63.21
64.20
64.3064.78
64.78
64.78
64.78
64.78
64.78121.5
123.7
123.2
121.5
123.9
124.490.11
92.79
91.20
90.05
92.21
92.7091.51 1.36 黄豆黄苷 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.501218.02
18.14
18.31
18.04
18.32
18.3518.48
18.48
18.48
18.48
18.48
18.4837.69
37.42
37.81
37.18
37.90
37.82106.4
104.3
105.5
103.5
106.0
105.3105.2 1.02 染料木苷 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.5012110.6
111.4
112.4
110.7
112.4
112.6113.4
113.4
113.4
113.4
113.4
113.4215.8
213.8
216.4
213.4
217.2
217.292.73
90.32
91.64
90.49
92.29
92.2291.61 1.09 大豆苷元 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
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129.2
129.2
129.2
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129.2248.7
247.6
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246.7
250.8
251.294.94
93.44
94.49
93.31
95.01
95.1094.38 0.86 黄豆黄素 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.501229.77
29.97
30.24
29.79
30.26
30.3130.53
30.53
30.53
30.53
30.53
30.5358.40
57.78
58.05
57.37
58.22
58.4493.77
91.08
91.10
90.34
91.59
92.1691.67 1.30 染料木素 0.4923
0.4956
0.5001
0.4927
0.5004
0.5012127.2
128.0
129.2
127.2
129.2
129.4130.4
130.4
130.4
130.4
130.4
130.4254.0
253.8
256.9
253.4
257.9
257.897.25
96.43
97.98
96.75
98.69
98.4097.58 0.94 表 3 黑豆、发酵中和发酵后的淡豆豉中 6 种异黄酮类成分含量比较
含量(μg/g) 大豆苷 黄豆黄苷 染料木苷 大豆苷元 黄豆黄素 染料木素 黑豆 73.44 20.58 128.2 85.99 30.45 92.48 半成品淡豆豉 88.78 25.29 211.6 213.92 49.10 239.7 成品淡豆豉 123.6 44.02 217.0 239.3 56.75 245.4 -
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